CN104876843B - 一种从胭脂萝卜籽中制备高纯度莱菔素的方法 - Google Patents
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Abstract
一种从胭脂萝卜籽中制备高纯度莱菔素的方法，涉及到从胭脂萝卜籽中快速稳定制备高纯度莱菔素的方法技术。本发明以市售脱脂后的胭脂萝卜籽粉为原料，经过酶解、离心，离心液依次经过树脂粗分离、高效液相色谱制备分离，制备出莱菔素制备液；最终通过醇水快速置换、浓缩以及冷冻干燥，得到纯度为99％以上的莱菔素产品。该方法操作简单、高效、连续性强、溶剂可反复回收利用，树脂可再生循环，产品稳定且纯度高，解决了莱菔素在水中易重排或异构化、产品不易长久保存等问题。采用本方法制备出的莱菔素产品可广泛用于保健品及医药领域。
Description
一、技术领域
本专利属于莱菔素的制备及稳定性研究领域，特别涉及到一种从胭脂萝卜籽中快速稳定制备高纯度莱菔素的方法。
二、背景技术
莱菔素是十字花科蔬菜中硫代葡萄糖苷在黑芥子酶中水解而成的一类异硫氰酸酯类物质，学名为1-异硫氰酸-4-甲磺酰基-丁烷，又名莱菔硫素，莱菔子素，溶于水、甲醇和氯仿，易溶于乙醚，不溶于石油醚。莱菔素是迄今为止蔬菜中发现的最强抗癌成分之一，它能诱导机体产生II型解毒酶，防止致癌物质破坏健康细胞的遗传因子，具有广阔的市场前景。
现有制备莱菔素的技术，例如申请号为201110117510.3、名称为“一种莱菔素的制备方法”的发明专利，该专利公开的方法是：取莱菔素药材粉碎后加2～3倍水，调pH4.0～5.0，40～50℃酶解30～60min，升温至80℃灭酶，再加5～6倍水搅拌提取，过滤，用大孔吸附树脂吸附其中的莱菔素，再以50～70％乙醇洗脱，洗脱液经过纳滤、反渗透后浓缩再用二氯甲烷萃取，最后获得纯度达到75.6％的莱菔素。又如申请号为201210011551.9，名称为“一种芸薹属蔬菜种子中萝卜硫素的富集与提取”的发明专利，该专利公开的方法为：芸薹属蔬菜种子粉碎后加入体积比1∶3～1∶5的Trris-HCl缓冲液调节pH为6.0～8.0，再加维生素C及Zn+，激活蔬菜种子中内源黑芥子酶，水解自身的硫代葡萄糖苷，形成具有抗癌作用的莱菔素，最后用乙酸乙酯萃取孵育液中的莱菔素，经过滤、真空浓缩、超声浸提，得到莱菔素。上述方法存在的主要问题是：①选用二氯甲烷、乙酸乙酯等有机溶剂萃取莱菔素，此类溶剂毒性大，易挥发或水溶性高，污染环境；②用大孔吸附树脂静态吸附水溶液中的目标物，时间长且吸附效率低。由于莱菔素在水溶液中30分钟即开始重排或异构化，长时间的静态吸附导致其大量重排或异构成萝卜硫素氰或异噁烷等杂质，这将显著降低莱菔素的收得率并增加分离纯化的难度；③上述方法仅采用萃取和吸附进行纯化，由于萃取和吸附对目标物的选择性均低，制备出的莱菔素纯度均不高，仅能用于食品领域，附加值低。
三、发明内容
本发明是针对现有莱菔素制备技术的不足之处，提供一种快速稳定制备高纯度莱菔素的方法。该方法具有操作简单、高效、连续性强、溶剂可反复回收利用，树脂可再生循环，产品稳定且纯度高等特点。
本发明所依据的原理是：①莱菔素，即1-异硫氰酸-4-甲磺酰基-(2-烯)丁烷中的2-烯基为非极性基团，可与非极性吸附树脂形成疏水相互作用，从而与极性杂质分离；②吸附于非极性树脂的莱菔素用无水甲醇脱附，使莱菔素快速转移至甲醇中，莱菔素在甲醇中稳定，既避免了因浓缩热产生的重排等异构化反应，也可长期保存；③制备型液相色谱是基于分析型液相色谱原理的工业化设备，由于塔板数极高，可以将莱菔素与非极性杂质分离，获得高纯度莱菔素制备液；④冷冻干燥是将湿物料或溶液在较低温度(-10℃～-50℃)下冻结成固态，然后在绝对真空度(1.3～13Pa)下使其中的水分直接升华，最终使物料脱水的干燥技术。经过制备型液相色谱分离获得的高纯度莱菔素制备液经过甲醇快速脱附、低温真空脱甲醇浓缩及预冻成冰，再在冷冻干燥机内升华水分，即可快速制备出稳定、高纯度的莱菔素。
本发明的目的是通过以下途径实现的，一种从胭脂萝卜籽中制备高纯度莱菔素的方法，以市售脱脂后的胭脂萝卜籽粉为原料，经过制备莱菔素粗提取液、制备莱菔素粗分离液、制备高纯度莱菔素浓缩液及制备高纯度莱菔素冻干物的步骤快速稳定制备出纯度高达99％以上的莱菔素，其具体的工艺步骤如下：
(1)制备莱菔素粗提取液
首先，配制出pH为3.0～4.5、浓度为0.1～0.5mol/L的柠檬酸-柠檬酸三钠缓冲溶液或pH为3.0～4.5、浓度为0.1～0.5mol/L柠檬酸缓冲溶液，再按照市售脱脂后的胭脂萝卜籽粉质量(kg)与该缓冲溶液体积(L)之比为1∶4～1∶10的比例，在搅拌下将市售脱脂后的胭脂萝卜籽粉分散于该缓冲溶液中，于30～40℃恒温水解反应1.5～3h。水解反应完成后进行过滤，分别收集滤液和滤渣，对收集的滤渣，烘干后用作家畜饲料添加剂；对收集的滤液，用稀HCl溶液调节pH至2～4后用管式离心机以10000～15000r/min的转速离心，分别收集离心清液和离心沉淀，对收集的离心沉淀，即为莱菔子蛋白质，与过滤收集的滤渣合并，烘干后用作家畜饲料添加剂；对收集的离心清液，即为莱菔素粗提取液，放置于0～4℃的冷藏室中避光保存，用于下一步制备莱菔素粗分离液。
(2)制备莱菔素粗分离液
第(1)步完成后，将活化的大孔吸附树脂sp700或sp850，用湿法装入中压层析柱，其中大孔吸附树脂体积(L)与第(1)步制备的莱菔素粗提取液体积(L)之比为1∶10～1∶16，再安装好转换接头并分别连接恒流泵和紫外检测器，就组装成莱菔素粗分离系统。莱菔素粗分离系统组装完成后，开启恒流泵，将第(1)步制备的莱菔素粗提取液以1～2BV/h的流速泵入莱菔素粗分离系统中，分别收集用过柱液和吸附莱菔素的大孔吸附树脂柱，对收集的过柱液，泵入生化处理池进行处理，达标后排放；对收集的吸附莱菔素的大孔吸附树脂柱，先用1～3BV的纯净水冲洗，再泵入3～6BV、体积浓度为10～15％的甲醇洗脱液，以1～3BV/h的流速洗脱杂质。分别收集冲洗液、体积浓度为10～15％的过柱甲醇洗脱液和经过该过柱甲醇洗脱液处理的大孔吸附树脂柱，对收集的冲洗液，泵入生化处理池进行处理，达标后排放；对收集的体积浓度为10～15％的过柱甲醇洗脱液，送入溶剂回收车间，减压蒸馏回收甲醇；对收集的经过体积浓度为10～15％的甲醇洗脱液处理的大孔吸附树脂柱，接着用体积浓度为50～65％的甲醇洗脱液进行洗脱，所用体积浓度为50～65％的甲醇洗脱液体积为3～6BV，洗脱液流速为1～3BV/h。分别收集体积浓度为50～65％的过柱甲醇洗脱液和脱附莱菔素的大孔吸附树脂柱，对收集的体积浓度为50～65％的过柱甲醇洗脱液，即为莱菔素粗分离液，用于下一步制备高纯度莱菔素浓缩液；对收集的脱附莱菔素的大孔吸附树脂柱，泵入体积浓度为80～100％的甲醇洗脱液进行洗脱，所用该甲醇洗脱液体积为3～6BV，洗脱液流速为1～3BV/h。分别收集体积浓度为80～100％的过柱甲醇洗脱液和经过浓度为80～100％的甲醇洗脱液处理后的树脂柱，对收集的体积浓度为80～100％的过柱甲醇洗脱液，送入溶剂回收车间，减压蒸馏回收甲醇；对收集的经过浓度为80～100％的甲醇洗脱液处理后的树脂柱，用1～2BV的纯净水冲洗。分别收集过柱冲洗液和经过纯净水冲洗的大孔吸附树脂柱，对收集的过柱冲洗液，送入溶剂回收车间，减压蒸馏回收甲醇；对收集的经过纯净水冲洗的大孔吸附树脂柱，即为再生莱菔素粗分离系统，可再次用于粗分离莱菔素。
(3)制备高纯度莱菔素浓缩液
第(2)步完成后，将活化的罗门哈斯大孔吸附树脂AmberliteTMXAD1600或AmberliteTMXAD761，用湿法装入中压层析柱，其中罗门哈斯大孔吸附树脂体积(L)与第(2)步制备的莱菔素粗分离液体积(L)之比为1∶10～1∶16，再安装好转换接头并分别连接恒流泵和紫外检测器，就组装成莱菔素醇水置换系统。莱菔素醇水置换系统组装完成后，将第(2)步制备的莱菔素粗分离液浓缩后泵入制备型液相色谱柱，流动相甲醇与水的比例为30∶70，流速为20～25mL/min，按照色谱图收集流出液，即得到莱菔素制备液。用恒流泵以1～2BV/h的流速泵入第(3)步组装的莱菔素醇水置换系统，分别收集过柱液和吸附莱菔素的大孔吸附树脂柱，对收集的过柱液，减压真空浓缩回收甲醇，再泵入生化处理池进行处理，达标后排放；对收集的吸附莱菔素的大孔吸附树脂柱，用2～3BV的体积浓度为100％甲醇溶液进行洗脱，流速为1.5～2.5BV/h，根据紫外检测器上的紫外峰收集洗脱液和大孔吸附树脂柱，对收集的洗脱液减压真空浓缩回收甲醇，即获得高纯度莱菔素浓缩液，用于下一步制备高纯度莱菔素冻干物；对收集的经过体积浓度为100％的甲醇洗脱液处理后的树脂柱，用1～2BV的纯净水冲洗。分别收集过柱冲洗液和经过纯净水冲洗的大孔吸附树脂柱，对收集的过柱冲洗液，送入回收车间，回收甲醇；对收集的经过纯净水冲洗的大孔吸附树脂柱，即为再生莱菔素醇水置换系统，可再次醇水置换莱菔素溶液。
(4)制备高纯度莱菔素冻干物
第(3)步完成后，将高纯度莱菔素浓缩液在-40℃冷冻室中预冻7～10h，预冻结实后将其取出立刻放置于已经预设好的冷冻干燥机内，开启真空泵、真空计。冷冻干燥温度为-60℃～-50℃，绝对真空度为10～50Pa，直至冰块完全消失殆尽取出，即为高纯度莱菔素冻干物，纯度达99％以上。
本发明采用了上述技术手段后主要产生了以下效果：
1、本发明中的所有装置简单易行，效果显著，譬如用简单的吸附树脂柱进行醇水置换，取代了先前用乙酸乙酯或二氯甲烷萃取水中莱菔素的方法，既避免了在较高温度下浓缩其水溶液而导致莱菔素发生变化，又防止乙酸乙酯和二氯甲烷萃取时带来的三废，及时将莱菔素中的水分除去，避免其在水中发生降解。本发明绿色环保低能耗，故成本极低。
2、本发明采用大孔吸附树脂柱与紫外检测器相连，相比先前用吸附树脂静态吸附或单个树脂柱分离纯化莱菔素，此法能精准收集从树脂柱上洗脱下来的莱菔素，在进行醇水置换的同时可以根据紫外检测器出峰时间的差异精准地分离大部分杂质，相当于一个低塔板数的制备型液相色谱仪。巧妙减少了仅依靠计算柱体积收集洗脱液带来的误差。
3、本发明用到制备型液相色谱，制备色谱的塔板数极高，分离极其精准，因而可以快速制备出高纯度的莱菔素。
4、本发明用到冷冻干燥机进行最后阶段除水，利用升华的特点，可以将莱菔素中的水分降低到0.5％以下，达到了莱菔素在水中稳定存在的含水量要求。
四、具体实施方式
下面结合具体实施方式，进一步说明本发明。
实施例1
一种从胭脂萝卜籽中制备高纯度莱菔素的方法，其具体步骤如下：
(1)制备莱菔素粗提取液
首先，配制出pH为3.0、浓度为0.1mol/L的柠檬酸-柠檬酸三钠缓冲溶液或pH为3.0、浓度为0.1mol/L柠檬酸缓冲溶液，再按照市售脱脂后的胭脂萝卜籽粉质量(kg)与该缓冲溶液体积(L)之比为1∶4的比例，在搅拌下将市售脱脂后的胭脂萝卜籽粉分散于该缓冲溶液中，于30℃恒温水解反应1.5h。水解反应完成后进行过滤，分别收集滤液和滤渣，对收集的滤渣，烘干后用作家畜饲料添加剂；对收集的滤液，用稀HCl溶液调节pH至2后用管式离心机以10000r/min的转速离心，分别收集离心清液和离心沉淀，对收集的离心沉淀，即为莱菔子蛋白质，与过滤收集的滤渣合并，烘干后用作家畜饲料添加剂；对收集的离心清液，即为莱菔素粗提取液，放置于0℃的冷藏室中避光保存，用于下一步制备莱菔素粗分离液。
(2)制备莱菔素粗分离液
第(1)步完成后，将活化的大孔吸附树脂sp700或sp850，用湿法装入中压层析柱，其中大孔吸附树脂体积(L)与第(1)步制备的莱菔素粗提取液体积(L)之比为1∶10，再安装好转换接头并分别连接恒流泵和紫外检测器，就组装成莱菔素粗分离系统。莱菔素粗分离系统组装完成后，开启恒流泵，将第(1)步制备的莱菔素粗提取液以1BV/h的流速泵入莱菔素粗分离系统中，分别收集用过柱液和吸附莱菔素的大孔吸附树脂柱，对收集的过柱液，泵入生化处理池进行处理，达标后排放；对收集的吸附莱菔素的大孔吸附树脂柱，先用1BV的纯净水冲洗，再泵入3BV、体积浓度为10％的甲醇洗脱液，以1BV/h的流速洗脱杂质。分别收集冲洗液、体积浓度为10％的过柱甲醇洗脱液和经过该过柱甲醇洗脱液处理的大孔吸附树脂柱，对收集的冲洗液，泵入生化处理池进行处理，达标后排放；对收集的体积浓度为10％的过柱甲醇洗脱液，送入溶剂回收车间，减压蒸馏回收甲醇；对收集的经过体积浓度为10％的甲醇洗脱液处理的大孔吸附树脂柱，接着用体积浓度为50％的甲醇洗脱液进行洗脱，所用体积浓度为50％的甲醇洗脱液体积为3BV，洗脱液流速为1BV/h。分别收集体积浓度为50％的过柱甲醇洗脱液和脱附莱菔素的大孔吸附树脂柱，对收集的体积浓度为50％的过柱甲醇洗脱液，即为莱菔素粗分离液，用于下一步制备高纯度莱菔素浓缩液；对收集的脱附莱菔素的大孔吸附树脂柱，泵入体积浓度为80％的甲醇洗脱液进行洗脱，所用该甲醇洗脱液体积为3BV，洗脱液流速为1BV/h。分别收集体积浓度为80％的过柱甲醇洗脱液和经过浓度为80％的甲醇洗脱液处理后的树脂柱，对收集的体积浓度为80％的过柱甲醇洗脱液，送入溶剂回收车间，减压蒸馏回收甲醇；对收集的经过浓度为80％的甲醇洗脱液处理后的树脂柱，用1BV的纯净水冲洗。分别收集过柱冲洗液和经过纯净水冲洗的大孔吸附树脂柱，对收集的过柱冲洗液，送入溶剂回收车间，减压蒸馏回收甲醇；对收集的经过纯净水冲洗的大孔吸附树脂柱，即为再生莱菔素粗分离系统，可再次用于粗分离莱菔素。
(3)制备高纯度莱菔素浓缩液
第(2)步完成后，将活化的罗门哈斯大孔吸附树脂AmberliteTMXAD1600或AmberliteTMXAD761，用湿法装入中压层析柱，其中罗门哈斯大孔吸附树脂体积(L)与第(2)步制备的莱菔素粗分离液体积(L)之比为1∶10，再安装好转换接头并分别连接恒流泵和紫外检测器，就组装成莱菔素醇水置换系统。莱菔素醇水置换系统组装完成后，将第(2)步制备的莱菔素粗分离液浓缩后泵入制备型液相色谱柱，流动相甲醇∶水的比例为30∶70，流速为20mL/min，按照色谱图收集流出液，即得到莱菔素制备液。用恒流泵以1BV/h的流速泵入第(3)步组装的莱菔素醇水置换系统，分别收集过柱液和吸附莱菔素的大孔吸附树脂柱，对收集的过柱液，减压真空浓缩回收甲醇，再泵入生化处理池进行处理，达标后排放；对收集的吸附莱菔素的大孔吸附树脂柱，用2BV的体积浓度为100％甲醇溶液进行洗脱，流速为1.5BV/h，根据紫外检测器上的紫外峰收集洗脱液和大孔吸附树脂柱，对收集的洗脱液减压真空浓缩回收甲醇，即获得高纯度莱菔素浓缩液，用于下一步制备高纯度莱菔素冻干物；对收集的经过体积浓度为100％的甲醇洗脱液处理后的树脂柱，用1BV的纯净水冲洗。分别收集过柱冲洗液和经过纯净水冲洗的大孔吸附树脂柱，对收集的过柱冲洗液，送入回收车间，回收甲醇；对收集的经过纯净水冲洗的大孔吸附树脂柱，即为再生莱菔素醇水置换系统，可再次醇水置换莱菔素溶液。
(4)制备高纯度莱菔素冻干物
第(3)步完成后，将高纯度莱菔素浓缩液在-40℃冷冻室中预冻7h，预冻结实后将其取出立刻放置于已经预设好的冷冻干燥机内，开启真空泵、真空计。冷冻干燥温度为-60℃，绝对真空度为10Pa，直至冰块完全消失殆尽取出，即为高纯度莱菔素冻干物，纯度达99％以上。
实施例2
一种从胭脂萝卜籽中制备高纯度莱菔素的方法，其具体步骤如下：
(1)制备莱菔素粗提取液
首先，配制出pH为4.5、浓度为0.5mol/L的柠檬酸-柠檬酸三钠缓冲溶液或pH为4.5、浓度为0.5mol/L柠檬酸缓冲溶液，再按照市售脱脂后的胭脂萝卜籽粉质量(kg)与该缓冲溶液体积(L)之比为1∶10的比例，在搅拌下将市售脱脂后的胭脂萝卜籽粉分散于该缓冲溶液中，于40℃恒温水解反应3h。水解反应完成后进行过滤，分别收集滤液和滤渣，对收集的滤渣，烘干后用作家畜饲料添加剂；对收集的滤液，用稀HCl溶液调节pH至4后用管式离心机以15000r/min的转速离心，分别收集离心清液和离心沉淀，对收集的离心沉淀，即为莱菔子蛋白质，与过滤收集的滤渣合并，烘干后用作家畜饲料添加剂；对收集的离心清液，即为莱菔素粗提取液，放置于4℃的冷藏室中避光保存，用于下一步制备莱菔素粗分离液。
(2)制备莱菔素粗分离液
第(1)步完成后，将活化的大孔吸附树脂sp700或sp850，用湿法装入中压层析柱，其中大孔吸附树脂体积(L)与第(1)步制备的莱菔素粗提取液体积(L)之比为1∶16，再安装好转换接头并分别连接恒流泵和紫外检测器，就组装成莱菔素粗分离系统。莱菔素粗分离系统组装完成后，开启恒流泵，将第(1)步制备的莱菔素粗提取液以2BV/h的流速泵入莱菔素粗分离系统中，分别收集用过柱液和吸附莱菔素的大孔吸附树脂柱，对收集的过柱液，泵入生化处理池进行处理，达标后排放；对收集的吸附莱菔素的大孔吸附树脂柱，先用3BV的纯净水冲洗，再泵入6BV、体积浓度为15％的甲醇洗脱液，以3BV/h的流速洗脱杂质。分别收集冲洗液、体积浓度为15％的过柱甲醇洗脱液和经过该过柱甲醇洗脱液处理的大孔吸附树脂柱，对收集的冲洗液，泵入生化处理池进行处理，达标后排放；对收集的体积浓度为15％的过柱甲醇洗脱液，送入溶剂回收车间，减压蒸馏回收甲醇；对收集的经过体积浓度为15％的甲醇洗脱液处理的大孔吸附树脂柱，接着用体积浓度为65％的甲醇洗脱液进行洗脱，所用体积浓度为65％的甲醇洗脱液体积为6BV，洗脱液流速为3BV/h。分别收集体积浓度为65％的过柱甲醇洗脱液和脱附莱菔素的大孔吸附树脂柱，对收集的体积浓度为65％的过柱甲醇洗脱液，即为莱菔素粗分离液，用于下一步制备高纯度莱菔素浓缩液；对收集的脱附莱菔素的大孔吸附树脂柱，泵入体积浓度为100％的甲醇洗脱液进行洗脱，所用该甲醇洗脱液体积为6BV，洗脱液流速为3BV/h。分别收集体积浓度为100％的过柱甲醇洗脱液和经过浓度为100％的甲醇洗脱液处理后的树脂柱，对收集的体积浓度为100％的过柱甲醇洗脱液，送入溶剂回收车间，减压蒸馏回收甲醇；对收集的经过浓度为100％的甲醇洗脱液处理后的树脂柱，用2BV的纯净水冲洗。分别收集过柱冲洗液和经过纯净水冲洗的大孔吸附树脂柱，对收集的过柱冲洗液，送入溶剂回收车间，减压蒸馏回收甲醇；对收集的经过纯净水冲洗的大孔吸附树脂柱，即为再生莱菔素粗分离系统，可再次用于粗分离莱菔素。
(3)制备高纯度莱菔素浓缩液
第(2)步完成后，将活化的罗门哈斯大孔吸附树脂AmberliteTMXAD1600或AmberliteTMXAD761，用湿法装入中压层析柱，其中罗门哈斯大孔吸附树脂体积(L)与第(2)步制备的莱菔素粗分离液体积(L)之比为1∶16，再安装好转换接头并分别连接恒流泵和紫外检测器，就组装成莱菔素醇水置换系统。莱菔素醇水置换系统组装完成后，将第(2)步制备的莱菔素粗分离液浓缩后泵入制备型液相色谱柱，流动相甲醇∶水的比例为30∶70，流速为25mL/min，按照色谱图收集流出液，即得到莱菔素制备液。用恒流泵以2BV/h的流速泵入第(3)步组装的莱菔素醇水置换系统，分别收集过柱液和吸附莱菔素的大孔吸附树脂柱，对收集的过柱液，减压真空浓缩回收甲醇，再泵入生化处理池进行处理，达标后排放；对收集的吸附莱菔素的大孔吸附树脂柱，用3BV的体积浓度为100％甲醇溶液进行洗脱，流速为2.5BV/h，根据紫外检测器上的紫外峰收集洗脱液和大孔吸附树脂柱，对收集的洗脱液减压真空浓缩回收甲醇，即获得高纯度莱菔素浓缩液，用于下一步制备高纯度莱菔素冻干物；对收集的经过体积浓度为100％的甲醇洗脱液处理后的树脂柱，用2BV的纯净水冲洗。分别收集过柱冲洗液和经过纯净水冲洗的大孔吸附树脂柱，对收集的过柱冲洗液，送入回收车间，回收甲醇；对收集的经过纯净水冲洗的大孔吸附树脂柱，即为再生莱菔素醇水置换系统，可再次醇水置换莱菔素溶液。
(4)制备高纯度莱菔素冻干物
第(3)步完成后，将高纯度莱菔素浓缩液在-40℃冷冻室中预冻10h，预冻结实后将其取出立刻放置于已经预设好的冷冻干燥机内，开启真空泵、真空计。冷冻干燥温度为-50℃，绝对真空度为50Pa，直至冰块完全消失殆尽取出，即为高纯度莱菔素冻干物，纯度达99％以上。
实施例3
一种从胭脂萝卜籽中制备高纯度莱菔素的方法，其具体步骤如下：
(1)制备莱菔素粗提取液
首先，配制出pH为4.0、浓度为0.3mol/L的柠檬酸-柠檬酸三钠缓冲溶液或pH为4.0、浓度为0.3mol/L柠檬酸缓冲溶液，再按照市售脱脂后的胭脂萝卜籽粉质量(kg)与该缓冲溶液体积(L)之比为1∶7的比例，在搅拌下将市售脱脂后的胭脂萝卜籽粉分散于该缓冲溶液中，于35℃恒温水解反应2h。水解反应完成后进行过滤，分别收集滤液和滤渣，对收集的滤渣，烘干后用作家畜饲料添加剂；对收集的滤液，用稀HCl溶液调节pH至3后用管式离心机以12000r/min的转速离心，分别收集离心清液和离心沉淀，对收集的离心沉淀，即为莱菔子蛋白质，与过滤收集的滤渣合并，烘干后用作家畜饲料添加剂；对收集的离心清液，即为莱菔素粗提取液，放置于2℃的冷藏室中避光保存，用于下一步制备莱菔素粗分离液。
(2)制备莱菔素粗分离液
第(1)步完成后，将活化的大孔吸附树脂sp700或sp850，用湿法装入中压层析柱，其中大孔吸附树脂体积(L)与第(1)步制备的莱菔素粗提取液体积(L)之比为1∶13，再安装好转换接头并分别连接恒流泵和紫外检测器，就组装成莱菔素粗分离系统。莱菔素粗分离系统组装完成后，开启恒流泵，将第(1)步制备的莱菔素粗提取液以1.5BV/h的流速泵入莱菔素粗分离系统中，分别收集用过柱液和吸附莱菔素的大孔吸附树脂柱，对收集的过柱液，泵入生化处理池进行处理，达标后排放；对收集的吸附莱菔素的大孔吸附树脂柱，先用1.5BV的纯净水冲洗，再泵入5BV、体积浓度为12％的甲醇洗脱液，以1.5BV/h的流速洗脱杂质。分别收集冲洗液、体积浓度为12％的过柱甲醇洗脱液和经过该过柱甲醇洗脱液处理的大孔吸附树脂柱，对收集的冲洗液，泵入生化处理池进行处理，达标后排放；对收集的体积浓度为12％的过柱甲醇洗脱液，送入溶剂回收车间，减压蒸馏回收甲醇；对收集的经过体积浓度为12％的甲醇洗脱液处理的大孔吸附树脂柱，接着用体积浓度为60％的甲醇洗脱液进行洗脱，所用体积浓度为60％的甲醇洗脱液体积为5BV，洗脱液流速为2BV/h。分别收集体积浓度为60％的过柱甲醇洗脱液和脱附莱菔素的大孔吸附树脂柱，对收集的体积浓度为60％的过柱甲醇洗脱液，即为莱菔素粗分离液，用于下一步制备高纯度莱菔素浓缩液；对收集的脱附莱菔素的大孔吸附树脂柱，泵入体积浓度为90％的甲醇洗脱液进行洗脱，所用该甲醇洗脱液体积为5BV，洗脱液流速为2BV/h。分别收集体积浓度为90％的过柱甲醇洗脱液和经过浓度为90％的甲醇洗脱液处理后的树脂柱，对收集的体积浓度为90％的过柱甲醇洗脱液，送入溶剂回收车间，减压蒸馏回收甲醇；对收集的经过浓度为90％的甲醇洗脱液处理后的树脂柱，用1.5BV的纯净水冲洗。分别收集过柱冲洗液和经过纯净水冲洗的大孔吸附树脂柱，对收集的过柱冲洗液，送入溶剂回收车间，减压蒸馏回收甲醇；对收集的经过纯净水冲洗的大孔吸附树脂柱，即为再生莱菔素粗分离系统，可再次用于粗分离莱菔素。
(3)制备高纯度莱菔素浓缩液
第(2)步完成后，将活化的罗门哈斯大孔吸附树脂AmberliteTMXAD1600或AmberliteTMXAD761，用湿法装入中压层析柱，其中罗门哈斯大孔吸附树脂体积(L)与第(2)步制备的莱菔素粗分离液体积(L)之比为1∶13，再安装好转换接头并分别连接恒流泵和紫外检测器，就组装成莱菔素醇水置换系统。莱菔素醇水置换系统组装完成后，将第(2)步制备的莱菔素粗分离液浓缩后泵入制备型液相色谱柱，流动相甲醇∶水的比例为30∶70，流速为22mL/min，按照色谱图收集流出液，即得到莱菔素制备液。用恒流泵以1.5BV/h的流速泵入第(3)步组装的莱菔素醇水置换系统，分别收集过柱液和吸附莱菔素的大孔吸附树脂柱，对收集的过柱液，减压真空浓缩回收甲醇，再泵入生化处理池进行处理，达标后排放；对收集的吸附莱菔素的大孔吸附树脂柱，用2.5BV的体积浓度为100％甲醇溶液进行洗脱，流速为2BV/h，根据紫外检测器上的紫外峰收集洗脱液和大孔吸附树脂柱，对收集的洗脱液减压真空浓缩回收甲醇，即获得高纯度莱菔素浓缩液，用于下一步制备高纯度莱菔素冻干物；对收集的经过体积浓度为100％的甲醇洗脱液处理后的树脂柱，用1.5BV的纯净水冲洗。分别收集过柱冲洗液和经过纯净水冲洗的大孔吸附树脂柱，对收集的过柱冲洗液，送入回收车间，回收甲醇；对收集的经过纯净水冲洗的大孔吸附树脂柱，即为再生莱菔素醇水置换系统，可再次醇水置换莱菔素溶液。
(4)制备高纯度莱菔素冻干物
第(3)步完成后，将高纯度莱菔素浓缩液在-40℃冷冻室中预冻8.5h，预冻结实后将其取出立刻放置于已经预设好的冷冻干燥机内，开启真空泵、真空计。冷冻干燥温度为-55℃，绝对真空度为30Pa，直至冰块完全消失殆尽取出，即为高纯度莱菔素冻干物，纯度达99％以上。
Claims (1)
1.一种从胭脂萝卜籽中制备高纯度莱菔素的方法，其特征在于具体的工艺步骤如下：
(1)制备莱菔素粗提取液
首先，配制出pH为3.0～4.5、浓度为0.1～0.5mol/L的柠檬酸-柠檬酸三钠缓冲溶液或pH为3.0～4.5、浓度为0.1～0.5mol/L柠檬酸缓冲溶液，再按照市售脱脂后的胭脂萝卜籽粉质量与该缓冲溶液体积之比为1kg∶4L～1kg∶10L的比例，在搅拌下将市售脱脂后的胭脂萝卜籽粉分散于该缓冲溶液中，于30～40℃恒温水解反应1.5～3h；水解反应完成后进行过滤，分别收集滤液和滤渣，对收集的滤渣，烘干后用作家畜饲料添加剂；对收集的滤液，用稀HCl溶液调节pH至2～4后用管式离心机以10000～15000r/min的转速离心，分别收集离心清液和离心沉淀，对收集的离心沉淀，即为莱菔子蛋白质，与过滤收集的滤渣合并，烘干后用作家畜饲料添加剂；对收集的离心清液，即为莱菔素粗提取液，放置于0～4℃的冷藏室中避光保存，用于下一步制备莱菔素粗分离液；
(2)制备莱菔素粗分离液
第(1)步完成后，将活化的大孔吸附树脂sp700或sp850，用湿法装入中压层析柱，其中大孔吸附树脂体积与第(1)步制备的莱菔素粗提取液体积之比为1L∶10L～1L∶16L，再安装好转换接头并分别连接恒流泵和紫外检测器，就组装成莱菔素粗分离系统；莱菔素粗分离系统组装完成后，开启恒流泵，将第(1)步制备的莱菔素粗提取液以1～2BV/h的流速泵入莱菔素粗分离系统中，分别收集用过柱液和吸附莱菔素的大孔吸附树脂柱，对收集的过柱液，泵入生化处理池进行处理，达标后排放；对收集的吸附莱菔素的大孔吸附树脂柱，先用1～3BV的纯净水冲洗，再泵入3～6BV、体积浓度为10～15％的甲醇洗脱液，以1～3BV/h的流速洗脱杂质，分别收集冲洗液、体积浓度为10～15％的过柱甲醇洗脱液和经过该过柱甲醇洗脱液处理的大孔吸附树脂柱，对收集的冲洗液，泵入生化处理池进行处理，达标后排放；对收集的体积浓度为10～15％的过柱甲醇洗脱液，送入溶剂回收车间，减压蒸馏回收甲醇；对收集的经过体积浓度为10～15％的甲醇洗脱液处理的大孔吸附树脂柱，接着用体积浓度为50～65％的甲醇洗脱液进行洗脱，所用体积浓度为50～65％的甲醇洗脱液体积为3～6BV，洗脱液流速为1～3BV/h；分别收集体积浓度为50～65％的过柱甲醇洗脱液和脱附莱菔素的大孔吸附树脂柱，对收集的体积浓度为50～65％的过柱甲醇洗脱液，即为莱菔素粗分离液，用于下一步制备高纯度莱菔素浓缩液；对收集的脱附莱菔素的大孔吸附树脂柱，泵入体积浓度为80～100％的甲醇洗脱液进行洗脱，所用该甲醇洗脱液体积为3～6BV，洗脱液流速为1～3BV/h；分别收集体积浓度为80～100％的过柱甲醇洗脱液和经过浓度为80～100％的甲醇洗脱液处理后的树脂柱，对收集的体积浓度为80～100％的过柱甲醇洗脱液，送入溶剂回收车间，减压蒸馏回收甲醇；对收集的经过浓度为80～100％的甲醇洗脱液处理后的树脂柱，用1～2BV的纯净水冲洗；分别收集过柱冲洗液和经过纯净水冲洗的大孔吸附树脂柱，对收集的过柱冲洗液，送入溶剂回收车间，减压蒸馏回收甲醇；对收集的经过纯净水冲洗的大孔吸附树脂柱，即为再生莱菔素粗分离系统，可再次用于粗分离莱菔素；
(3)制备高纯度莱菔素浓缩液
第(2)步完成后，将活化的罗门哈斯大孔吸附树脂AmberliteTMXAD1600或AmberliteTMXAD761，用湿法装入中压层析柱，其中罗门哈斯大孔吸附树脂体积与第(2)步制备的莱菔素粗分离液体积之比为1L∶10L～1L∶16L，再安装好转换接头并分别连接恒流泵和紫外检测器，就组装成莱菔素醇水置换系统；莱菔素醇水置换系统组装完成后，将第(2)步制备的莱菔素粗分离液浓缩后泵入制备型液相色谱柱，流动相甲醇∶水的比例为30∶70，流速为20～25mL/min，按照色谱图收集流出液，即得到莱菔素制备液；用恒流泵以1～2BV/h的流速泵入第(3)步组装的莱菔素醇水置换系统，分别收集过柱液和吸附莱菔素的大孔吸附树脂柱，对收集的过柱液，减压真空浓缩回收甲醇，再泵入生化处理池进行处理，达标后排放；对收集的吸附莱菔素的大孔吸附树脂柱，用2～3BV的体积浓度为100％甲醇溶液进行洗脱，流速为1.5～2.5BV/h，根据紫外检测器上的紫外峰收集洗脱液和大孔吸附树脂柱，对收集的洗脱液减压真空浓缩回收甲醇，即获得高纯度莱菔素浓缩液，用于下一步制备高纯度莱菔素冻干物；对收集的经过体积浓度为100％的甲醇洗脱液处理后的树脂柱，用1～2BV的纯净水冲洗；分别收集过柱冲洗液和经过纯净水冲洗的大孔吸附树脂柱，对收集的过柱冲洗液，送入回收车间，回收甲醇；对收集的经过纯净水冲洗的大孔吸附树脂柱，即为再生莱菔素醇水置换系统，可再次醇水置换莱菔素溶液；
(4)制备高纯度莱菔素冻干物
第(3)步完成后，将高纯度莱菔素浓缩液在-40℃冷冻室中预冻7～10h，预冻结实后将其取出立刻放置于已经预设好的冷冻干燥机内，开启真空泵、真空计，冷冻干燥温度为-60℃～-50℃，绝对真空度为10～50Pa，直至冰块完全消失殆尽取出，即为高纯度莱菔素冻干物，纯度达99％以上。
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