CN104059947A - 一种制备高纯度萝卜硫素的方法 - Google Patents

Abstract

一种制备高纯度萝卜硫素的方法，具体涉及从萝卜籽中提取萝卜硫素的方法。本发明以风干萝卜籽为原料，经破碎、脱脂、水解、树脂初分离、反渗透浓缩、制备分离及冷冻干燥，制备出纯度高达98％以上的产品。本发明操作简便，设备简单，反应条件温和，节约能源，生产成本低，便于推广应用。对使用后的甲醇废液进行回收处理，还对使用后的树脂进行了再生处理，产生的杂质还能再利用，因而生产安全、绿色无污染，是节能减排的生产方法。采用本发明方法制备出的萝卜硫素产品，可广泛应用于医药、保健品等行业中。

Description

一种制备高纯度萝卜硫素的方法

一、技术领域

本发明属于萝卜硫素分离制备的技术领域，具体涉及从萝卜籽中提取萝卜硫素的方法。

二、背景技术

硫代葡萄糖苷是十字花科蔬菜中的一种芥子苷，在硫代葡萄糖苷酶或酸的催化下，芥子苷水解，生成萝卜硫素等异硫氰酸酯和葡萄糖。科学研究发现，萝卜硫素的化学名为1-异硫氰酸-4-甲磺酰基丁烷或1-异硫氰酸-4-甲磺酰基-(2-烯)丁烷，是迄今为止蔬菜中发现的最强抗癌成分之一，它可诱导机体产生II型解毒酶，该酶能防止致癌物质破坏健康细胞内的遗传因子，所以，从十字花科蔬菜中分离纯化1-异硫氰酸-4-甲磺酰基丁烷或1-异硫氰酸-4-甲磺酰基-(2-烯)丁烷具有重要的科学价值和广阔的市场前景。

目前，从十字花科蔬菜中提取萝卜硫素的方法有：①申请号为200910098197.6、名称为“一种萝卜硫素的提取方法”的发明专利，该专利公开的方法是：用干燥西兰花种子或新鲜西兰花球为原料，粉碎加入水，调节pH4.1～4.5，加入粗芥子硫苷酸酶水解后冷冻干燥成粉末；加入丙酮，浸提，过滤，将滤液真空浓缩成萝卜硫素粗品；然后将其通过硅胶柱层析，用乙酸乙酯和乙醇的混合液梯度洗脱，收集馏分，真空浓缩；用甲醇溶解，再经0.2um微孔滤膜过滤后，用C18硅胶装柱，采用甲醇水梯度洗脱，收集萝卜硫素馏分，真空干燥，得到萝卜硫素。该方法存在的主要问题是：1.未对种子进行脱脂，由于油脂的阻挡，西兰花种子中的芥子苷和芥子硫苷酸酶难以有效接触，导致萝卜硫素的生成率低；2.未对提取的芥子硫苷酸酶进行固定化，游离酶的半衰期短，易失活；3.使用的有机溶剂-丙酮致酶蛋白变性能力强，导致芥子硫苷酸酶大量变性而失活。因此，该方法导致原料利用率低、萝卜硫素生成率低，丙酮回收率低而污染环境，生产成本高，缺乏竞争力。②《食品工业科技》2012年第33卷第4期80～82页刊登的论文“高效液相色谱法测定西兰花中萝卜硫素的研究”，该论文公开的提取萝卜硫素的方法是：西兰花种子在无光照条件下发芽48h，冷冻干燥成粉末，加入正己烷脱脂并挥发脱除溶剂后，在加入去离子水混合均匀，水浴处理2h，再加入氯化钠并用等体积乙酸乙酯萃取3次，收集、合并萃取液，用旋蒸器减压蒸馏，除去乙酸乙酯，直至残留液呈黄油状液体时止。接着用10％的乙腈溶解残留液，然后用0.45um的微孔滤膜过滤，最后用旋蒸器减压蒸馏，除去滤过液中的乙腈和水，获得萝卜硫素。该方法存在的主要问题是：1.水解时未调节到硫代葡萄糖苷酶所需的最佳pH值，导致硫代葡萄糖苷酶的活力低，萝卜硫素产率低；2.使用有机溶剂乙酸乙酯和乙腈，两种溶剂均易挥发，异味重，有毒性，空气污染严重；因此，该方法生产的萝卜硫素成本也高，同样缺乏竞争力。

三、发明内容

本发明的目的是针对现有制备萝卜硫素的方法的不足之处，提供一种制备高纯度萝卜硫素的新方法，该方法具有充分利用资源，萝卜硫素生成率高、操作简单、溶剂可反复回收利用、产品纯度高达98％以上，绿色无污染等特点。

本发明的原理是：①萝卜籽油脂含量高达45％，超临界CO₂在适当条件下具有与油脂类似的密度，依据相似相溶原理，可溶解萝卜籽中的油脂，因此用超临界CO₂可提取萝卜籽中的油脂，获得脱脂萝卜籽；②萝卜籽中含有硫代葡萄糖苷及硫代葡萄糖苷酶，它们在细胞中处于分隔状态，当细胞被破坏时，硫代葡萄糖苷酶和硫代葡萄糖苷接触，即催化硫代葡萄糖苷水解生成萝卜硫素等异硫氰酸酯和葡萄糖；③酶被底物饱和方能发挥最大催化效率，向脱脂萝卜籽水解体系中加入硫代葡萄糖苷，使游离硫代葡萄糖苷酶被饱和而发挥最大催化效率，显著增加萝卜硫素的生成量；④1-异硫氰酸-4-甲磺酰基-(2-烯)丁烷的烯键既可加氢还原成1-异硫氰酸-4-甲磺酰基丁烷，也可氧化甚至断键，且前者的生物学活性比后者强1～2倍，因此获得前者比后者更具价值。将脱脂萝卜籽水解体系进行真空脱气并充入氮气，可显著降低其中的氧气，将显著降低1-异硫氰酸-4-甲磺酰基-(2-烯)丁烷的氧化；⑤1-异硫氰酸-4-甲磺酰基-(2-烯)丁烷的2-烯基丁烷基为非极性，可与非极性树脂形成疏水相互作用，可用非极性吸附树脂对其进行吸附，将其与极性杂质分离；⑦除去极性杂质的1-异硫氰酸-4-甲磺酰基-(2-烯)丁烷经反渗透浓缩，除去甲醇后再进入制备型液相色谱，由于该物质的结构与其它非极性杂质的差异，它们在反相C18硅胶上的吸附力不同，因此可用适当的洗脱液进行洗脱，由于制备型液相色谱的塔板数极高，分离效率高，因此可将其它杂质一一分离，制备出高纯度的萝卜硫素，即1-异硫氰酸-4-甲磺酰基-(2-烯)丁烷；⑧将制备出的高纯度1-异硫氰酸-4-甲磺酰基-(2-烯)丁烷进行反渗透浓缩，除去其中的甲醇和部分水，即可获得浓缩液，最后将该浓缩液进行冷冻干燥，除去水分，就制备出纯度高达98％以上的萝卜硫素，即1-异硫氰酸-4-甲磺酰基-(2-烯)丁烷。

本发明的目的是这样实现的：一种制备高纯度萝卜硫素的方法，以风干萝卜籽为原料，经破碎、脱脂、水解、树脂初分离、反渗透浓缩、制备分离及冷冻干燥，制备出纯度高达98％以上的萝卜硫素，即1-异硫氰酸-4-甲磺酰基-(2-烯)丁烷。其具体的工艺步骤如下：

1.制备脱脂萝卜籽粉

取水分含量低于4％的风干萝卜籽，先用破碎机破碎，再用20～60目的不锈钢筛网进行筛分，分别收集过筛者和未过筛者。对于未过筛的萝卜籽粉，返回破碎机进行再次破碎；对于过筛的萝卜籽粉，置于超临界二氧化碳的萃取器的萃取釜中，在温度为30～35℃、压力25～30MPa的条件下进行萃取1h～2h，然后将荷载萝卜籽油脂的超临界二氧化碳泵至分离釜中，降低压力至3～5MPa，使超临界二氧化碳气化，与萝卜籽油脂分离。分别收集气化的二氧化碳、脱二氧化碳萝卜籽油脂粗品和脱脂萝卜籽粉，对收集的气化二氧化碳，再次冷冻至0～5℃并再次加压至25～30Mpa，可再次用于提取萝卜籽油脂；对于收集的脱二氧化碳萝卜籽油脂粗品，用于制备精制萝卜籽油；对于收集的脱脂萝卜籽粉，分成两部分，一部分用于制备硫代葡萄糖苷提取液，另一部分用于制备萝卜硫素粗提液。

2.制备硫代葡萄糖苷提取液

第1步完成后，将第1步收集的部分脱脂萝卜籽粉，分散于甲醇中，在70～75℃的温度下进行第一次提取40～60min，脱脂萝卜籽粉质量(g)与甲醇体积(mL)之比为1∶6～9。第一次提取完成后进行抽滤，分别收集第一次滤过液和滤渣。对于收集的第一次滤渣，投入到甲醇中进行第二次提取，提取条件与第一次相同。第二次提取完成后进行抽滤，分别收集第二次滤过液和滤渣。对于收集的第二次滤渣，送入脱溶剂釜中，进行脱甲醇处理后可用作家畜饲料添加剂；对于收集的第二次提取液，与收集的第一次提取液合并后进行真空浓缩，直至浓缩液成膏状时止，所用浓缩真空度为0.06～0.09MPa、温度为40～45℃。浓缩完成后，分别收集膏状浓缩物和甲醇，对于收集的甲醇，返回甲醇贮罐，用于再次提取硫代葡萄糖苷；对于收集的膏状浓缩物，用蒸馏水溶解，膏状浓缩物质量(g)与蒸馏水体积(mL)之比为1∶3～6。溶解完成后，将溶解液置于萃取釜中，加入乙酸乙酯进行萃取处理10～20min，溶解液与乙酸乙酯体积之比为1mL∶1～6mL。萃取完成后，分别收集萃取相和萃余相，对收集的萃取相，进行精馏回收乙酸乙酯；对收集的萃余相，即为硫代葡萄糖苷提取液，用于制备萝卜硫素提取液。

3.制备萝卜硫素粗提液

第2步完成后，先将第1步收集的另一部分脱脂萝卜籽粉分散于pH5.0～6.0的柠檬酸-柠檬酸三钠缓冲溶液中，搅拌均匀，脱脂萝卜籽粉质量(g)与pH5.0～6.0的柠檬酸-柠檬酸三钠缓冲溶液体积(mL)之比为1∶6～12，再加入第2步收集的硫代葡萄糖苷提取液，加入的硫代葡萄糖苷提取液体积(mL)与脱脂萝卜籽粉质量(g)之比为1∶10～20，混合均匀后就获得制备萝卜硫素粗提液酶水解体系。然后在25～35℃、40～120r/min的搅拌速度下避光水解5～10h。水解完成后，进行过滤，分别收集滤过液和滤渣。对收集的滤渣，分散于温度为25～35℃的蒸馏水中，蒸馏水体积(mL)与滤渣质量(g)之比为10～20∶1，在40～120r/min的搅拌速度下避光洗涤20～30min，接着进行过滤，分别收集洗涤滤过液和滤渣。对收集的洗涤滤渣，干燥后用做家畜饲料添加剂；对收集的洗涤液，与收集的水解滤过液合并，用稀盐酸调节pH至2～4后离心，离心机转速为10000～16000r/min。分别收集离心清液和离心沉淀，对收集的离心沉淀，干燥后做饲料添加剂；对收集的离心清液，泵入脱气罐中，在真空度为0.06～0.09MPa、温度为10～35℃的条件下，保持20～40min，脱去液体中的氧气。然后充入0.1～0.3MPa的高纯度氮气，保持20～40min，即制备出萝卜硫素粗提液，用于制备初步纯化萝卜硫素浓缩液。

4.制备脱氧充氮甲醇-水洗脱液

分别配制甲醇体积浓度为5～15％、60～80％的甲醇-水溶液，再分别移入脱气罐中，在真空度为0.06～0.09MPa、温度为10～35℃的条件下，保持20～40min，脱去其中的氧气。然后充入0.1～0.3MPa的高纯度氮气，保持20～40min，即制备出脱氧充氮甲醇-水洗脱液，用于制备萝卜硫素初步纯化浓缩液。

5.制备萝卜硫素初步纯化浓缩液

第3步完成之后，将第3步制备出的萝卜硫素粗提液泵入活化SP850或聚酰胺吸附树脂柱，吸附其中的萝卜硫素，萝卜硫素粗提液体积(mL)与SP850或聚酰胺吸附树脂的体积(mL)比为1∶15～30，以流速为5～10BV/h通过SP850或聚酰胺吸附树脂柱。吸附完成后收集荷载萝卜硫素的SP850或聚酰胺吸附树脂柱和脱附萝卜硫素的过柱溶液，对于收集的脱附萝卜硫素的过柱溶液，进行生化处理，达标后排放；对于收集的荷载萝卜硫素的SP850或聚酰胺吸附树脂柱，先用2BV、甲醇体积浓度为5～15％的脱氧充氮甲醇-水洗脱液、以3～6BV/h的流速洗涤夹杂于树脂间的杂质，分别收集甲醇洗涤液和洗去树脂间杂质的荷载萝卜硫素的SP850或聚酰胺吸附树脂柱，对收集的甲醇洗涤液，减压蒸馏回收甲醇后进行生化处理，达标后排放；回收的甲醇可用于再次配制甲醇积浓度为5～15％或60～80％的脱氧充氮甲醇-水洗脱液。对收集的洗去树脂间杂质的荷载萝卜硫素的SP850或聚酰胺吸附树脂柱，泵入甲醇积浓度为60～80％的脱氧充氮甲醇-水洗脱液以3～6BV/h的流速洗脱被吸附的萝卜硫素，直至甲醇体积浓度为60～80％的脱氧充氮甲醇-水洗脱液的耗量达到SP850或聚酰胺吸附树脂柱体积(mL)的5～10BV时止。分别收集荷载萝卜硫素的洗脱液和脱附萝卜硫素的SP850或聚酰胺吸附树脂柱，对于收集的脱附萝卜硫素的SP850或聚酰胺吸附树脂柱，进行再生处理；对于收集的荷载萝卜硫素的甲醇洗脱液，泵入反渗透器中，在压力低于0.4MPa下进行反渗透浓缩，直至浓缩液中萝卜硫素的质量浓度达到20～30％时为止。分别收集反渗透截留液和滤过液，对于收集的反渗透截留液，泵入真空浓缩机中，在真空度为0.06～0.09MPa、温度为30～45℃的条件下，进行真空浓缩，直至浓缩液无甲醇味时为止，就制备出萝卜硫素初步纯化浓缩液，用于制备高纯度萝卜硫素冻干物。对于收集的反渗透滤过液，进行减压蒸馏回收甲醇后进行生化处理，达标后排放；对于回收的甲醇，可用于再次配制甲醇体积浓度为5～15％或60～80％的脱氧充氮甲醇-水洗脱液。

6.制备高纯度萝卜硫素冻干物

第5步完成后，先将第5步制备的萝卜硫素初步纯化浓缩液通过0.22um微孔过滤膜过滤，再泵入以反相C18硅胶为填料的制备型液相色谱柱中，萝卜硫素初步纯化浓缩液体积(mL)与C18硅胶填料质量(g)之比为1∶50～80。接着控制色谱条件进行制备分离萝卜硫素，具体的色谱条件为：检测波长为245nm，柱温为25℃，流速为1.0mL·min-1；A组分为甲醇，B组分为超纯水；梯度洗脱程序为：在0min～15min区间，流动相中的A组分由5％上升至25％，B组分由95％下降至75％；在15min～75min区间，流动相中的A组分由25％上升至65％，B组分由75％下降至35％。收集37～41min区间的洗脱液，在35～45℃下进行真空浓缩，直至浓缩液中萝卜硫素质量浓度达到30～50％时，就制备出萝卜硫素浓缩液。将该萝卜硫素浓缩液置于冻干机中，在25～45Pa真空度、-50～-60℃温度下，进行冷冻干燥24～36h，就制备出纯度为98％以上的萝卜硫素。经核磁共振、液质联机和旋光仪分析鉴定，所制备出的萝卜硫素的化学结构为1-异硫氰酸-4-甲磺酰基-(2-烯)丁烷。

7.制备再生树脂柱

向第5步收集的脱附萝卜硫素的SP850或聚酰胺吸附树脂柱泵入3～4BV的无水甲醇，以2～5BV/h的流速洗脱树脂吸附的杂质，分别收集洗脱液和脱附杂质的SP850或聚酰胺吸附树脂柱。对收集的甲醇洗脱液，含有异硫氰酸酯类物质，减压蒸馏回收甲醇后分别收集甲醇和浓缩液，对于收集的甲醇，进行脱水处理，制备出无水甲醇，可再次用于洗脱脱附萝卜硫素的SP850或聚酰胺吸附树脂柱，制备再生树脂；对于收集的浓缩液，用于配制异硫氰酸酯类生物农药。对于收集的洗脱杂质的SP850或聚酰胺吸附树脂柱，用1～2BV的蒸馏水以2～5BV/h的流速洗涤，分别收集经该蒸馏水洗涤的SP850或聚酰胺吸附树脂柱和洗涤液，对收集的蒸馏水洗涤的SP850或聚酰胺吸附树脂柱，即为再生树脂柱，可再次用于纯化萝卜硫素粗提液；对于收集的洗涤液，可用于配制脱氧充氮甲醇-水洗脱液。

本发明采用上述技术方案后，主要有以下效果：

1.本发明方法在生产过程中使用破碎、脱脂、水解、树脂初分离、反渗透浓缩、制备分离及冷冻干燥等简单工艺，操作简便，设备简单，反应条件温和，节约能源，生产成本低，便于推广应用。

2.本发明方法在生产过程中，先对萝卜籽粉进行超临界二氧化碳脱脂后再水解，硫代葡萄糖苷和硫代葡萄糖苷酶可以得到充分而有效的接触，从而产物的生成率大大提高，而且在水解时加入了底物硫代葡萄糖苷，采用脱氧充氮甲醇-水作洗脱液，进一步提高了产物的生成率。

3.本发明方法在生产过程中，通过树脂进行初分离、反渗透浓缩、液相制备及真空浓缩的纯化步骤，其中由于制备型液相色谱的塔板数极高，每米的塔板数在20000以上，分离效率高，因此制备出的产物纯度极高，达98％以上。

4.本发明在生产过程中，使用超临界二氧化碳对萝卜籽粉末脱脂，对使用后的甲醇废液进行回收处理，还对使用后的树脂进行了再生处理，这使得生产过程安全、绿色无污染。

本发明方法是节能减排、安全生产且成本低，便于推广应用的理想的方法。采用本发明方法制备出的萝卜硫素，即1-异硫氰酸-4-甲磺酰基-(2-烯)丁烷产品，可广泛应用于医药、保健品行业中，有防癌抗癌等功能。

四、具体实施方式

下面结合具体实施方式，进一步说明本发明。

实施例1

一种制备高纯度萝卜硫素的方法，具体方法步骤如下：

1.制备脱脂萝卜籽粉

取水分含量低于4％的风干萝卜籽，先用破碎机破碎，再用20目的不锈钢筛网进行筛分，分别收集过筛者和未过筛者。对于未过筛的萝卜籽粉，返回破碎机进行再次破碎；对于过筛的萝卜籽粉，置于超临界二氧化碳的萃取器的萃取釜中，在温度为30℃、压力25MPa的条件下进行萃取1h，然后将荷载萝卜籽油脂的超临界二氧化碳泵至分离釜中，降低压力至3MPa，使超临界二氧化碳气化，与萝卜籽油脂分离。分别收集气化的二氧化碳、脱二氧化碳萝卜籽油脂粗品和脱脂萝卜籽粉，对收集的气化二氧化碳，再次冷冻至0℃并再次加压至25Mpa，可再次用于提取萝卜籽油脂；对于收集的脱二氧化碳萝卜籽油脂粗品，用于制备精制萝卜籽油；对于收集的脱脂萝卜籽粉，分成两部分，一部分用于制备硫代葡萄糖苷提取液，另一部分用于制备萝卜硫素粗提液。

2.制备硫代葡萄糖苷提取液

第1步完成后，将第1步收集的部分脱脂萝卜籽粉，分散于甲醇中，在70℃的温度下进行第一次提取40min，脱脂萝卜籽粉质量(g)与甲醇体积(mL)之比为1∶6。第一次提取完成后进行抽滤，分别收集第一次滤过液和滤渣。对于收集的第一次滤渣，投入到甲醇中进行第二次提取，提取条件与第一次相同。第二次提取完成后进行抽滤，分别收集第二次滤过液和滤渣。对于收集的第二次滤渣，送入脱溶剂釜中，进行脱甲醇处理后可用作家畜饲料添加剂；对于收集的第二次提取液，与收集的第一次提取液合并后进行真空浓缩，直至浓缩液成膏状时止，所用浓缩真空度为0.06MPa、温度为40℃。浓缩完成后，分别收集膏状浓缩物和甲醇，对于收集的甲醇，返回甲醇贮罐，用于再次提取硫代葡萄糖苷；对于收集的膏状浓缩物，用蒸馏水溶解，膏状浓缩物质量(g)与蒸馏水体积(mL)之比为1∶3。溶解完成后，将溶解液置于萃取釜中，加入乙酸乙酯进行萃取处理10min，溶解液与乙酸乙酯体积之比为1mL∶1mL。萃取完成后，分别收集萃取相和萃余相，对收集的萃取相，进行精馏回收乙酸乙酯；对收集的萃余相，即为硫代葡萄糖苷提取液，用于制备萝卜硫素提取液。

3.制备萝卜硫素粗提液

第2步完成后，先将第1步收集的另一部分脱脂萝卜籽粉分散于pH5.0的柠檬酸-柠檬酸三钠缓冲溶液中，搅拌均匀，脱脂萝卜籽粉质量(g)与pH5.0～6.0的柠檬酸-柠檬酸三钠缓冲溶液体积(mL)之比为1∶6，再加入第2步收集的硫代葡萄糖苷提取液，加入的硫代葡萄糖苷提取液体积(mL)与脱脂萝卜籽粉质量(g)之比为1∶10，混合均匀后就获得制备萝卜硫素粗提液酶水解体系。然后在25℃、40r/min的搅拌速度下避光水解10h。水解完成后，进行过滤，分别收集滤过液和滤渣。对收集的滤渣，分散于温度为25℃的蒸馏水中，蒸馏水体积(mL)与滤渣质量(g)之比为10∶1，在40r/min的搅拌速度下避光洗涤30min，接着进行过滤，分别收集洗涤滤过液和滤渣。对收集的洗涤滤渣，干燥后用做家畜饲料添加剂；对收集的洗涤液，与收集的水解滤过液合并，用稀盐酸调节pH至2后离心，离心机转速为10000r/min。分别收集离心清液和离心沉淀，对收集的离心沉淀，干燥后做饲料添加剂；对收集的离心清液，泵入脱气罐中，在真空度为0.06MPa、温度为10℃的条件下，保持20min，脱去液体中的氧气。然后充入0.12MPa的高纯度氮气，保持20min，即制备出萝卜硫素粗提液，用于制备初步纯化萝卜硫素浓缩液。

4制备脱氧充氮甲醇-水洗脱液

分别配制甲醇体积浓度为5％、60％的甲醇-水溶液，再分别移入脱气罐中，在真空度为0.06MPa、温度为10℃的条件下，保持20min，脱去其中的氧气。然后充入0.12MPa的高纯度氮气，保持20min，即制备出脱氧充氮甲醇-水洗脱液，用于制备萝卜硫素初步纯化浓缩液。

5.制备萝卜硫素初步纯化浓缩液

第3步完成之后，将第3步制备出的萝卜硫素粗提液泵入活化SP850吸附树脂柱，吸附其中的萝卜硫素，萝卜硫素粗提液体积(mL)与SP850吸附树脂的体积(mL)比为1∶15，以流速为5BV/h通过SP850吸附树脂柱。吸附完成后收集荷载萝卜硫素的SP850吸附树脂柱和脱附萝卜硫素的过柱溶液，对于收集的脱附萝卜硫素的过柱溶液，进行生化处理，达标后排放；对于收集的荷载萝卜硫素的SP850吸附树脂柱，先用2BV、甲醇体积浓度为5％的脱氧充氮甲醇-水洗脱液、以3BV/h的流速洗涤夹杂于树脂间的杂质，分别收集甲醇洗涤液和洗去树脂间杂质的荷载萝卜硫素的SP850吸附树脂柱，对收集的甲醇洗涤液，减压蒸馏回收甲醇后进行生化处理，达标后排放；回收的甲醇可用于再次配制甲醇积浓度为5％或60％的脱氧充氮甲醇-水洗脱液。对收集的洗去树脂间杂质的荷载萝卜硫素的SP850吸附树脂柱，泵入甲醇积浓度为60％的脱氧充氮甲醇-水洗脱液以3BV/h的流速洗脱被吸附的萝卜硫素，直至甲醇体积浓度为60％的脱氧充氮甲醇-水洗脱液的耗量达到SP850吸附树脂柱体积(mL)的5BV时止。分别收集荷载萝卜硫素的洗脱液和脱附萝卜硫素的SP850吸附树脂柱，对于收集的脱附萝卜硫素的SP850吸附树脂柱，进行再生处理；对于收集的荷载萝卜硫素的甲醇洗脱液，泵入反渗透器中，在压力低于0.4MPa下进行反渗透浓缩，直至浓缩液中萝卜硫素的质量浓度达到20％时为止。分别收集反渗透截留液和滤过液，对于收集的反渗透截留液，泵入真空浓缩机中，在真空度为0.06MPa、温度为30℃的条件下，进行真空浓缩，直至浓缩液无甲醇味时为止，就制备出萝卜硫素初步纯化浓缩液，用于制备高纯度萝卜硫素冻干物。对于收集的反渗透滤过液，进行减压蒸馏回收甲醇后进行生化处理，达标后排放；对于回收的甲醇，可用于再次配制甲醇体积浓度为5％或60％的脱氧充氮甲醇-水洗脱液。

6.制备高纯度萝卜硫素冻干物

第5步完成后，先将第5步制备的萝卜硫素初步纯化浓缩液通过0.22um微孔过滤膜过滤，再泵入以反相C18硅胶为填料的制备型液相色谱柱中，萝卜硫素初步纯化浓缩液体积(mL)与C18硅胶填料质量(g)之比为1∶50。接着控制色谱条件进行制备分离萝卜硫素，具体的色谱条件为：检测波长为245nm，柱温为25℃，流速为1.0mL·min-1；A组分为甲醇，B组分为超纯水；梯度洗脱程序为：在0min～15min区间，流动相中的A组分由5％上升至25％，B组分由95％下降至75％；在15min～75min区间，流动相中的A组分由25％上升至65％，B组分由75％下降至35％。收集37～41min区间的洗脱液，在35℃下进行真空浓缩，直至浓缩液中萝卜硫素质量浓度达到30％时，就制备出萝卜硫素浓缩液。将该萝卜硫素浓缩液置于冻干机中，在25Pa真空度、-60℃温度下，进行冷冻干燥24h，就制备出纯度为98％以上的萝卜硫素。经核磁共振、液质联机和旋光仪分析鉴定，所制备出的萝卜硫素的化学结构为1-异硫氰酸-4-甲磺酰基-(2-烯)丁烷。

7.制备再生树脂柱

向第5步收集的脱附萝卜硫素的SP850吸附树脂柱泵入3BV的无水甲醇，以2BV/h的流速洗脱树脂吸附的杂质，分别收集洗脱液和脱附杂质的SP850吸附树脂柱。对收集的甲醇洗脱液，含有异硫氰酸酯类物质，减压蒸馏回收甲醇后分别收集甲醇和浓缩液，对于收集的甲醇，进行脱水处理，制备出无水甲醇，可再次用于洗脱脱附萝卜硫素的SP850吸附树脂柱，制备再生树脂；对于收集的浓缩液，用于配制异硫氰酸酯类生物农药。对于收集的洗脱杂质的SP850吸附树脂柱，用1BV的蒸馏水以2BV/h的流速洗涤，分别收集经该蒸馏水洗涤的SP850吸附树脂柱和洗涤液，对收集的蒸馏水洗涤的SP850吸附树脂柱，即为再生树脂柱，可再次用于纯化萝卜硫素粗提液；对于收集的洗涤液，可用于配制脱氧充氮甲醇-水洗脱液。

实施例2

一种制备高纯度萝卜硫素的方法，具体方法步骤如下：

1.制备脱脂萝卜籽粉

同实施例1，其中：用40目的不锈钢筛网进行筛分破碎后的萝卜籽。在温度为33℃、压力28MPa的条件下进行萃取1.5h。降低压力至4MPa，使超临界二氧化碳气化，与萝卜籽油脂分离。对收集的气化二氧化碳，再次冷冻至3℃并再次加压至28Mpa。

2.制备硫代葡萄糖苷提取液

同实施例1，其中：在73℃的温度下进行第一次提取50min，脱脂萝卜籽粉质量(g)与甲醇体积(mL)之比为1∶7。浓缩真空度为0.08MPa、温度为43℃。膏状浓缩物质量(g)与蒸馏水体积(mL)之比为1∶5。乙酸乙酯进行萃取处理15min，溶解液与乙酸乙酯体积之比为1mL∶5mL。

3.制备萝卜硫素粗提液

同实施例1，其中：脱脂萝卜籽粉分散于pH5.5的柠檬酸-柠檬酸三钠缓冲溶液中，脱脂萝卜籽粉质量(g)与pH5.5的柠檬酸-柠檬酸三钠缓冲溶液体积(mL)之比为1∶9。硫代葡萄糖苷提取液体积(mL)与脱脂萝卜籽粉质量(g)之比为1∶15。在30℃、80r/min的搅拌速度下避光水解7h。对收集的滤渣，分散于温度为30℃的蒸馏水中，蒸馏水体积(mL)与滤渣质量(g)之比为15∶1，在80r/min的搅拌速度下避光洗涤25min。对收集的洗涤液，与收集的水解滤过液合并，用稀盐酸调节pH至3后离心，离心机转速为13000r/min。对收集的离心清液，泵入脱气罐中，在真空度为0.07MPa、温度为25℃的条件下，保持30min。然后充入0.2MPa的高纯度氮气，保持30min。

4.制备脱氧充氮甲醇-水洗脱液

同实施例1，其中：分别配制甲醇体积浓度为10％、70％的甲醇-水溶液，再分别移入脱气罐中，在真空度为0.08MPa、温度为25℃的条件下，保持30min。然后充入0.2MPa的高纯度氮气，保持30min。

5.制备萝卜硫素初步纯化浓缩液

同实施例1，其中：将第3步制备出的萝卜硫素粗提液泵入活化聚酰胺吸附树脂柱，萝卜硫素粗提液体积(mL)与聚酰胺吸附树脂的体积(mL)比为1∶20，以流速为7BV/h通过聚酰胺吸附树脂柱。对于收集的荷载萝卜硫素的聚酰胺吸附树脂柱，先用2BV、甲醇体积浓度为10％的脱氧充氮甲醇-水洗脱液、以4BV/h的流速洗涤夹杂于树脂间的杂质，对收集的洗去树脂间杂质的荷载萝卜硫素的聚酰胺吸附树脂柱，泵入甲醇积浓度为70％的脱氧充氮甲醇-水洗脱液以4BV/h的流速洗脱被吸附的萝卜硫素，直至甲醇体积浓度为70％的脱氧充氮甲醇-水洗脱液的耗量达到聚酰胺吸附树脂柱体积(mL)的7BV时止。对于收集的荷载萝卜硫素的甲醇洗脱液，反渗透浓缩至浓缩液中萝卜硫素的质量浓度达到25％时为止。反渗透截留液，泵入真空浓缩机中，在真空度为0.07MPa、温度为40℃的条件下，进行真空浓缩。

6.制备高纯度萝卜硫素冻干物

同实施例1，其中：萝卜硫素初步纯化浓缩液体积(mL)与C18硅胶填料质量(g)之比为1∶65。对收集37～41min区间的洗脱液，在40℃下进行真空浓缩，直至浓缩液中萝卜硫素质量浓度达到50％时。将该萝卜硫素浓缩液置于冻干机中，在真空度35Pa、-55℃温度下，进行冷冻干燥30h。

7.制备再生树脂柱

同实施例1，向第5步收集的脱附萝卜硫素的聚酰胺吸附树脂柱泵入3.5BV的无水甲醇，以3BV/h的流速洗脱树脂吸附的杂质，对于收集的洗脱杂质的聚酰胺吸附树脂柱，用1.5BV的蒸馏水以3BV/h的流速洗涤。

实施例3

一种制备高纯度萝卜硫素的方法，具体方法步骤如下：

1.制备脱脂萝卜籽粉

同实施例1，其中：用60目的不锈钢筛网进行筛分破碎后的萝卜籽。在温度为35℃、压力30MPa的条件下进行萃取2h。降低压力至5MPa，使超临界二氧化碳气化，与萝卜籽油脂分离。对收集的气化二氧化碳，再次冷冻至5℃并再次加压至30Mpa。

2.制备硫代葡萄糖苷提取液

同实施例1，其中：在75℃的温度下进行第一次提取60min，脱脂萝卜籽粉质量(g)与甲醇体积(mL)之比为1∶9。浓缩真空度为0.09MPa、温度为45℃。膏状浓缩物质量(g)与蒸馏水体积(mL)之比为1∶6。乙酸乙酯进行萃取处理20min，溶解液与乙酸乙酯体积之比为1mL∶6mL。

3.制备萝卜硫素粗提液

同实施例1，其中：脱脂萝卜籽粉分散于pH6.0的柠檬酸-柠檬酸三钠缓冲溶液中，脱脂萝卜籽粉质量(g)与pH6.0的柠檬酸-柠檬酸三钠缓冲溶液体积(mL)之比为1∶12。硫代葡萄糖苷提取液体积(mL)与脱脂萝卜籽粉质量(g)之比为1∶20。在35℃、120r/min的搅拌速度下避光水解5h。对收集的滤渣，分散于温度为35℃的蒸馏水中，蒸馏水体积(mL)与滤渣质量(g)之比为20∶1，在120r/min的搅拌速度下避光洗涤20min。对收集的洗涤液，与收集的水解滤过液合并，用稀盐酸调节pH至4后离心，离心机转速为16000r/min。对收集的离心清液，泵入脱气罐中，在真空度为0.09MPa、温度为35℃的条件下，保持30min。然后充入0.3MPa的高纯度氮气，保持40min。

4.制备脱氧充氮甲醇-水洗脱液

同实施例1，其中：分别配制甲醇体积浓度为15％、80％的甲醇-水溶液，再分别移入脱气罐中，在真空度为0.09MPa、温度为35℃的条件下，保持40min。然后充入0.3MPa的高纯度氮气，保持40min。

5.制备萝卜硫素初步纯化浓缩液

同实施例1，其中：萝卜硫素粗提液体积(mL)与SP850吸附树脂的体积(mL)比为1∶30，以流速为10BV/h通过SP850吸附树脂柱。对于收集的荷载萝卜硫素的SP850吸附树脂柱，先用2BV、甲醇体积浓度为15％的脱氧充氮甲醇-水洗脱液、以6BV/h的流速洗涤夹杂于树脂间的杂质，对收集的洗去树脂间杂质的荷载萝卜硫素的SP850吸附树脂柱，泵入甲醇积浓度为80％的脱氧充氮甲醇-水洗脱液以6BV/h的流速洗脱被吸附的萝卜硫素，直至甲醇体积浓度为80％的脱氧充氮甲醇-水洗脱液的耗量达到SP850吸附树脂柱体积(mL)的10BV时止。对于收集的荷载萝卜硫素的甲醇洗脱液，反渗透浓缩至浓缩液中萝卜硫素的质量浓度达到30％时为止。反渗透截留液，泵入真空浓缩机中，在真空度为0.09MPa、温度为45℃的条件下，进行真空浓缩。

6.制备高纯度萝卜硫素冻干物

同实施例1，其中：萝卜硫素初步纯化浓缩液体积(mL)与C18硅胶填料质量(g)之比为1∶80。对收集37～41min区间的洗脱液，在45℃下进行真空浓缩，直至浓缩液中萝卜硫素质量浓度达到50％时。将该萝卜硫素浓缩液置于冻干机中，在真空度45Pa、-50℃温度下，进行冷冻干燥36h。

7.制备再生树脂柱

同实施例1，向第5步收集的脱附萝卜硫素的SP850吸附树脂柱泵入4BV的无水甲醇，以5BV/h的流速洗脱树脂吸附的杂质，对于收集的洗脱杂质的SP850吸附树脂柱，用2BV的蒸馏水以5BV/h的流速洗涤。

Claims (1)

1.一种制备高纯度萝卜硫素的方法，其特征在于具体方法步骤如下：

(1).制备脱脂萝卜籽粉

取水分含量低于4％的风干萝卜籽，先用破碎机破碎，再用20～60目的不锈钢筛网进行筛分，分别收集过筛者和未过筛者，对于未过筛的萝卜籽粉，返回破碎机进行再次破碎，对于过筛的萝卜籽粉，置于超临界二氧化碳的萃取器的萃取釜中，在温度为30～35℃、压力25～30MPa的条件下进行萃取1h～2h，然后将荷载萝卜籽油脂的超临界二氧化碳泵至分离釜中，降低压力至3～5MPa，使超临界二氧化碳气化，与萝卜籽油脂分离，分别收集气化的二氧化碳、脱二氧化碳萝卜籽油脂粗品和脱脂萝卜籽粉，对收集的气化二氧化碳，再次冷冻至0～5℃并再次加压至25～30Mpa；

(2).制备硫代葡萄糖苷提取液

第(1)步完成后，将第(1)步收集的部分脱脂萝卜籽粉，分散于甲醇中，在70～75℃的温度下进行第一次提取40～60min，脱脂萝卜籽粉质量与甲醇体积之比为1g∶6～9mL，第一次提取完成后进行抽滤，分别收集第一次滤过液和滤渣，对于收集的第一次滤渣，投入到甲醇中进行第二次提取，提取条件与第一次相同，第二次提取完成后进行抽滤，分别收集第二次滤过液和滤渣，对于收集的第二次滤渣，送入脱溶剂釜中，进行脱甲醇处理，对于收集的第二次提取液，与收集的第一次提取液合并后进行真空浓缩，直至浓缩液成膏状时止，所用浓缩真空度为0.06～0.09MPa、温度为40～45℃，浓缩完成后，分别收集膏状浓缩物和甲醇，对于收集的甲醇，返回甲醇贮罐，用于再次提取硫代葡萄糖苷，对于收集的膏状浓缩物，用蒸馏水溶解，膏状浓缩物质量与蒸馏水体积之比为1g∶3～6mL，溶解完成后，将溶解液置于萃取釜中，加入乙酸乙酯进行萃取处理10～20min，溶解液与乙酸乙酯体积之比为1mL∶1～6mL，萃取完成后，分别收集萃取相和萃余相，对收集的萃取相，进行精馏回收乙酸乙酯；

(3).制备萝卜硫素粗提液

第(2)步完成后，先将第(1)步收集的另一部分脱脂萝卜籽粉分散于pH5.0～6.0的柠檬酸-柠檬酸三钠缓冲溶液中，搅拌均匀，脱脂萝卜籽粉质量与pH5.0～6.0的柠檬酸-柠檬酸三钠缓冲溶液体积之比为1g∶6～12mL，再加入第2步收集的硫代葡萄糖苷提取液，加入的硫代葡萄糖苷提取液体积与脱脂萝卜籽粉质量之比为1mL∶10～20g，混合均匀后就获得制备萝卜硫素粗提液酶水解体系，然后在25～35℃、40～120r/min的搅拌速度下避光水解5～10h，水解完成后，进行过滤，分别收集滤过液和滤渣，对收集的滤渣，分散于温度为25～35℃的蒸馏水中，蒸馏水体积与滤渣质量之比为10～20mL∶1g，在40～120r/min的搅拌速度下避光洗涤20～30min，接着进行过滤，分别收集洗涤滤过液和滤渣，对收集的洗涤液，与收集的水解滤过液合并，用稀盐酸调节pH至2～4后离心，离心机转速为10000～16000r/min，分别收集离心清液和离心沉淀，对收集的离心清液，泵入脱气罐中，在真空度为0.06～0.09MPa、温度为10～35℃的条件下，保持20～40min，脱去液体中的氧气，然后充入0.1～0.3MPa的高纯度氮气，保持20～40min，即制备出萝卜硫素粗提液；

(4).制备脱氧充氮甲醇-水洗脱液

分别配制甲醇体积浓度为5～15％、60～80％的甲醇-水溶液，再分别移入脱气罐中，在真空度为0.06～0.09MPa、温度为10～35℃的条件下，保持20～40min，脱去其中的氧气，然后充入0.1～0.3MPa的高纯度氮气，保持20～40min，即制备出脱氧充氮甲醇-水洗脱液；

(5).制备萝卜硫素初步纯化浓缩液

第(3)步完成之后，将第(3)步制备出的萝卜硫素粗提液泵入活化SP850或聚酰胺吸附树脂柱，吸附其中的萝卜硫素，萝卜硫素粗提液体积与SP850或聚酰胺吸附树脂的体积比为1mL∶15～30mL，以流速为5～10BV/h通过SP850或聚酰胺吸附树脂柱，吸附完成后收集荷载萝卜硫素的SP850或聚酰胺吸附树脂柱和脱附萝卜硫素的过柱溶液，对于收集的脱附萝卜硫素的过柱溶液，进行生化处理，达标后排放，对于收集的荷载萝卜硫素的SP850或聚酰胺吸附树脂柱，先用2BV、甲醇体积浓度为5～15％的脱氧充氮甲醇-水洗脱液、以3～6BV/h的流速洗涤夹杂于树脂间的杂质，分别收集甲醇洗涤液和洗去树脂间杂质的荷载萝卜硫素的SP850或聚酰胺吸附树脂柱，对收集的甲醇洗涤液，减压蒸馏回收甲醇后进行生化处理，达标后排放，对收集的洗去树脂间杂质的荷载萝卜硫素的SP850或聚酰胺吸附树脂柱，泵入甲醇积浓度为60～80％的脱氧充氮甲醇-水洗脱液以3～6BV/h的流速洗脱被吸附的萝卜硫素，直至甲醇体积浓度为60～80％的脱氧充氮甲醇-水洗脱液的耗量达到SP850或聚酰胺吸附树脂柱体积的5～10BV时止，分别收集荷载萝卜硫素的洗脱液和脱附萝卜硫素的SP850或聚酰胺吸附树脂柱，对于收集的脱附萝卜硫素的SP850或聚酰胺吸附树脂柱，进行再生处理，对于收集的荷载萝卜硫素的甲醇洗脱液，泵入反渗透器中，在压力低于0.4MPa下进行反渗透浓缩，直至浓缩液中萝卜硫素的质量浓度达到20～30％时为止，分别收集反渗透截留液和滤过液，对于收集的反渗透截留液，泵入真空浓缩机中，在真空度为0.06～0.09MPa、温度为30～45℃的条件下，进行真空浓缩，直至浓缩液无甲醇味时为止，就制备出萝卜硫素初步纯化浓缩液，对于收集的反渗透滤过液，进行减压蒸馏回收甲醇后进行生化处理，达标后排放；

(6).制备高纯度萝卜硫素冻干物

第(5)步完成后，先将第(5)步制备的萝卜硫素初步纯化浓缩液通过0.22um微孔过滤膜过滤，再泵入以反相C18硅胶为填料的制备型液相色谱柱中，萝卜硫素初步纯化浓缩液体积与C18硅胶填料质量之比为1mL∶50～80g，接着控制色谱条件进行制备分离萝卜硫素，具体的色谱条件为：检测波长为245nm，柱温为25℃，流速为1.0mL·min-1；A组分为甲醇，B组分为超纯水，梯度洗脱程序为：在0min～15min区间，流动相中的A组分由5％上升至25％，B组分由95％下降至75％，在15min～75min区间，流动相中的A组分由25％上升至65％，B组分由75％下降至35％，收集37～41min区间的洗脱液，在35～45℃下进行真空浓缩，直至浓缩液中萝卜硫素质量浓度达到30～50％时，就制备出萝卜硫素浓缩液，将该萝卜硫素浓缩液置于冻干机中，在25～45Pa真空度、-50～-60℃温度下，进行冷冻干燥24～36h，就制备出纯度为98％以上的萝卜硫素，经核磁共振、液质联机和旋光仪分析鉴定，所制备出的萝卜硫素的化学结构为1-异硫氰酸-4-甲磺酰基-(2-烯)丁烷；

(7)制备再生树脂柱

向第(5)步收集的脱附了萝卜硫素的SP850或聚酰胺吸附树脂柱泵入3～4BV的无水甲醇，以2～5BV/h的流速洗脱树脂吸附的杂质，分别收集洗脱液和脱附杂质的SP850或聚酰胺吸附树脂柱，对收集的甲醇洗脱液，减压蒸馏回收甲醇后分别收集甲醇和浓缩液，对于收集的甲醇进行脱水处理，制备出无水甲醇，对于收集的洗脱杂质的SP850或聚酰胺吸附树脂柱，用1～2BV的蒸馏水以2～5BV/h的流速洗涤，分别收集经该蒸馏水洗涤的SP850或聚酰胺吸附树脂柱和洗涤液，对收集的蒸馏水洗涤后的SP850或聚酰胺吸附树脂柱，即为再生树脂柱，可再次用于纯化萝卜硫素粗提液，对于收集的洗涤液，可用于配制脱氧充氮甲醇-水洗脱液。