CN105177072B - 一种用萝卜籽粕生产高纯度莱菔素的方法 - Google Patents
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Abstract
一种用萝卜籽粕生产高纯度莱菔素的方法，属于莱菔素生产领域。本发明以萝卜籽粕为原料，经过乙醇提取、制备色谱、反应分离、真空干燥等生产得到高纯度莱菔素。本发明方法具有不需要使用氯仿、乙酸乙酯等有机溶剂，操作简单，产品纯度高，废弃物有效循环利用，提取纯化效率高，无“三废”排放等特点。本发明在生产过程中，使用固定化酶作为催化剂，大大提高了酶的利用率。同时创新组装出反应‑分离耦合柱式反应器，可进行连续操作、反复使用。本发明提供生产莱菔素的方法纯化效率高，产品的纯度高达98％以上，且无溶剂残留。采用本发明方法生产出的产品，可广泛应用于医药、保健等行业中。
Description
一、技术领域
本发明属于生产莱菔素的技术领域，特别涉及一种用萝卜籽粕生产高纯度莱菔素的方法。
二、技术背景
近年来，全球癌症患者人数在大幅度增加，而每年我国新增癌症患者占到全球新增病例的20％以上。因此，癌症已经成为人类不容忽视的一种疾病。萝卜籽中含有丰富的硫苷，其中，4-甲基亚磺酰基-3-丁烯基硫苷在萝卜籽中的含量最高，经过黑芥子酶酶解后可生成4-甲基亚磺酰基-3-丁烯基异硫氰酸酯(俗称莱菔素，sulforaphene)。莱菔素与萝卜硫素相比，在结构上，莱菔素在烃基链上有一个不饱和键；在性能上，莱菔素抑制突变的活性是萝卜硫素的1.3～1.5倍。据相关研究报道，莱菔素对食道癌、结肠癌、乳腺癌等表现出良好的抗癌活性。
现有生产莱菔素的方法，如2014年10月8日公开的公开号为CN 104086467A“一种利用溶剂萃取法和分子蒸馏法联合制备莱菔素的方法”的发明专利，该专利公开的方法是：利用有机溶剂从莱菔素水解液中萃取并减压蒸馏得到莱菔素粗提物，再利用分子蒸馏分离纯化技术纯化得到高纯度的莱菔素产品。该方法存在的主要缺点有：①萃取过程中使用氯仿、二氯甲烷等有毒试剂，不但造成环境污染，而且萃取选择性较低。②分子蒸馏过程中温度较高、受热时间过长，极易造成莱菔素降解，影响产品质量。⑧分子蒸馏设备昂贵，投资成本大，技术要求较高，生产能力有限。④采用萝卜籽或萝卜芽苗作为原料成本较高，且造成萝卜籽中萝卜籽油的极大浪费。
三、发明内容
本发明的目的是针对现有生产莱菔素方法的不足之处，提供一种用萝卜籽粕生产高纯度莱菔素的方法，具有不需要使用氯仿、正己烷等有机试剂，操作简单，产品纯度高，废弃物有效循环利用，提取纯化效率高，无“三废”排放等特点。
本发明机理：用乙醇对萝卜籽粕中的4-甲基亚磺酰基-3-丁烯基硫苷进行提取，经纳滤膜除去提取液中的小分子蛋白、多糖等物质，达到纯化4-甲基亚磺酰基-3-丁烯基硫苷的目的。制备色谱是基于高效液相色谱技术发展起来的，分离效率与纯化倍数高，产品纯度高。4-甲基亚磺酰基-3-丁烯基硫苷与其它物质存在结构差异，在色谱填料上的吸附力不同，用适当的洗脱液进行洗脱分离，可以获得高纯度的4-甲基亚磺酰基-3-丁烯基硫苷。黑芥子酶经溶解、超声预处理，不仅改变了粗酶中各物质表面类型，且可最大程度提高产品稳定性。黑芥子酶通过交联剂丙二醛固定于胺基型树脂，形成固定化黑芥子酶。将固定化黑芥子酶反应柱与装有吸附树脂的分离柱耦联，形成反应-分离耦合柱式反应器，使高纯度4-甲基亚磺酰基-3-丁烯基硫苷在黑芥子酶的催化下生成莱菔素，然后吸附于分离柱上，实现莱菔素的生成与分离。
本发明的目的是这样实现的：一种用萝卜籽粕生产高纯度莱菔素的方法，以萝卜籽粕为原料，经过乙醇提取、制备色谱、反应分离、真空干燥等生产得到高纯度莱菔素。其具体的方法步骤如下：
(1)制备4-甲基亚磺酰基-3-丁烯基硫苷粗提液
以萝卜籽粕为原料，按照萝卜籽粕的质量(kg)：体积分数为50～60％乙醇溶液的体积(L)之比为1∶6～8的比例，将萝卜籽粕均匀分散于乙醇溶液中，在温度为70℃的条件下，进行第一次浸提，浸提1～2h。第一次浸提完成后，将浸提混合物泵入压滤机进行压滤，分别收集第一次浸提清液和第一次浸提残渣。对于收集的第一次浸提残渣，在同等条件下，进行第二次浸提和压滤，分别收集第二次浸提清液和第二次浸提残渣。对于收集的第二次浸提残渣，因含有丰富的蛋白质，经干燥处理后可用作动物饲料添加剂。对于收集的第二次浸提清液，与收集的第一次浸提清液合并后，再泵入截留分子量为600～800Da的纳滤器中，在0.25～0.35MPa下，进行第一次纳滤分离，直至纳滤截留液的体积为原体积的20～30％时止，分别收集第一次纳滤滤过液和第一次纳滤截留液。对于收集的第一次纳滤截留液，补充去离子水至原体积，在同等条件下，进行第二次纳滤分离，直至第二次纳滤截留液的体积减少为原体积的5～15％时止，分别收集第二次纳滤滤过液和第二次纳滤截留液，并将两次收集的纳滤滤过液合并。对于合并的纳滤滤过液即为4-甲基亚磺酰基-3-丁烯基硫苷粗提液，用作下一步处理。对于收集的第二次纳滤截留液，因含有丰富的蛋白质、多糖，经干燥处理后可用作动物饲料添加剂。
(2)制备高纯度4-甲基亚磺酰基-3-丁烯基硫苷浓缩液
第(1)步完成后，将市售制备色谱填料(SPS C18 10μm色谱填料或SMB C18 10μm色谱填料)，分散于无水乙醇中，并装配成制备色谱柱，备用。再按照制备色谱柱：第(1)步合并的纳滤滤过液的体积比为1∶3～5的比例，将合并的纳滤滤过液以流速为制备色谱柱体积的3倍/小时的速度，泵入制备色谱柱中，进行吸附上样。上样结束后，在检测波长为280nm，体积分数为30～40％的乙醇溶液为流动相，流动相流速为制备色谱柱体积的3～5倍/小时的条件下，将流动相泵入制备色谱柱中，进行洗脱制备。然后待流动相泵入18～22min时，开始进行收集4-甲基亚磺酰基-3-丁烯基硫苷色谱流出液，待流动相泵入25～30min时，结束收集4-甲基亚磺酰基-3-丁烯基硫苷色谱流出液，分别收集4-甲基亚磺酰基-3-丁烯基硫苷色谱流出液、制备色谱洗脱液和制备色谱柱。对于收集的制备色谱柱，可再生后重复使用。对于收集的制备色谱洗脱液，经反渗透浓缩回收乙醇，其中截留液含有丰富的硫苷，经冻干后可用于制作保健品等高附加值产品。对于收集的4-甲基亚磺酰基-3-丁烯基硫苷色谱流出液，泵入反渗透浓缩器中，在0.15～0.25MPa下，进行第一次反渗透浓缩，直到第一次反渗透截留液的体积减少至原体积的10～15％为止，分别收集第一次反渗透透过液和第一次反渗透截留液。对于收集的第一次反渗透截留液，加入去离子水，补充至原体积，在同等条件下，再进行第二次反渗透浓缩，直到第二次反渗透截留液的体积减少至原体积的5～8％为止，分别收集第二次反渗透透过液和第二次反渗透截留液。对于收集第二次反渗透截留液，即为高纯度4-甲基亚磺酰基-3-丁烯基硫苷浓缩液，纯度为95.6～98.9％。对于收集的第二次反渗透透过液，与收集的第一次反渗透透过液合并，经减压蒸馏回收乙醇，调配后可继续使用。
(3)制备反应-分离耦合柱式反应器
第(2)步完成后，以市售黑芥子酶为原料，按照黑芥子酶的质量(g)：缓冲溶液的体积(mL)比为1∶6～8的比例，将黑芥子酶分散于缓冲溶液中，超声波处理10～20min后，进行过滤，分别收集过滤液和滤渣。对于收集的过滤液，用于制备固定化黑芥子酶。对于收集的滤渣，烘干后用作动物饲料添加剂。其中，所述的缓冲溶液为pH 5.0的醋酸-醋酸钠缓冲溶液或pH 5.6的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲溶液或pH 4.8的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液。
将市售已活化的胺基型树脂(WA30树脂或SA20A树脂或SA21A树脂)，按照胺基型树脂的质量(g)：收集的过滤液的体积(mL)：丙二醛质量浓度为18％的丙二醛溶液的体积(mL)比为1∶3～5∶0.7～0.9的比例，先将胺基型树脂加入过滤液中，浸泡2～3h，再加入丙二醛溶液，在温度为40～45℃下进行固定化酶反应3～6h。反应完成后通过抽滤机进行抽滤，分别收集抽滤渣和抽滤液。对于收集的抽滤渣，用2倍于抽滤渣体积的去离子水对抽滤渣进行洗涤，除去夹杂的游离黑芥子酶和丙二醛，分别收集洗涤渣和洗涤液。对于收集的洗涤渣，即为制备出的固定化黑芥子酶，4℃保存备用。对于收集的洗涤液，与收集的抽滤液合并、浓缩、调配后，可再次用于固定化黑芥子酶。
将制备得到的固定化黑芥子酶装入夹套保温层析柱中，用与固定化黑芥子酶等体积的去离子水进行反冲，用以排出固定化黑芥子酶中的气泡，然后升温至25～30℃，就得到固定化黑芥子酶反应柱，用于水解4-甲基亚磺酰基-3-丁烯基硫苷。将市售已活化的吸附树脂(HP20树脂或AB-8树脂或D113树脂)分散于去离子水中，并装配成吸附树脂层析柱，再用与吸附树脂层析柱等体积的去离子水进行反冲，排出吸附树脂层析柱中的气泡，就得到了莱菔素分离柱，用于吸附生成的莱菔素。将固定化黑芥子酶反应柱和莱菔素分离柱进行连接，就组装出反应-分离耦合柱式反应器，收集备用。对于收集的反冲液，泵入生化处理池、进行生化处理，达标后排放。
(4)制备高纯度莱菔素
第(3)步完成后，将第(2)步制得的高纯度4-甲基亚磺酰基-3-丁烯基硫苷浓缩液，泵入第(3)步组装得到的反应-分离耦合柱式反应器中，在高纯度4-甲基亚磺酰基-3-丁烯基硫苷浓缩液的泵入速度为反应-分离耦合柱式反应器体积的1～3倍/小时下，进行连续反应。反应结束后，收集柱式反应器流出液和反应-分离耦合柱式反应器。对于收集的柱式反应器流出液，含有葡萄糖、硫苷，经结晶后可用作动物饲料添加剂。对于收集的反应-分离耦合柱式反应器，先将固定化黑芥子酶反应柱与莱菔素分离柱断开，然后再将莱菔素分离柱用2倍于莱菔素分离柱体积的无水乙醇进行洗脱，洗脱完成后，收集洗脱液和洗脱后的莱菔素分离柱。对于收集的洗脱液，经减压浓缩后，然后再置于真空干燥箱中，在真空度为0.07～0.08MPa下，真空干燥20～30h，以除去残留的乙醇，最后得到高纯度莱菔素，莱菔素纯度达98.1～99.2％。对于收集的洗脱后的莱菔素分离柱和固定化黑芥子酶反应柱，经再生后，可重新组装出反应-分离耦合柱式反应器反复使用。
本发明采用上述技术方案后，主要有以下效果：
1、本发明在生产过程中，使用固定化酶作为催化剂，大大提高了酶的利用率。同时创新组装出反应-分离耦合柱式反应器，可进行连续操作、反复使用，因而能提高产量节约成本。
2、本发明提供的生产莱菔素的方法纯化效率高，产品的纯度高达98％以上，且无溶剂残留。同时在生产过程中得到多种副产品，进一步降低了生产成本。
3、本发明在生产过程中，采用废弃的萝卜籽粕为原料，成本低廉且废物利用；避免使用氯仿、乙腈等有毒试剂，使用乙醇、去离子水等无毒物质，且回收利用。这不但在生产过程中安全无污染，无“三废”排放，还充分循环利用资源，进一步降低生产成本。
4、本发明在生产过程中，生产设备常用简单，操作简便且易于控制，因此生产安全又降低生产成本。
采用本发明方法生产出的产品，具有抗肿瘤、抗菌、提高机体抗氧化能力、免疫力等活性，可广泛应用于医药、保健等行业中。
四、具体实施方式
下面结合具体实施方式，进一步说明本发明。
实施例1
一种用萝卜籽粕生产高纯度莱菔素的方法，具体方法步骤如下：
(1)制备4-甲基亚磺酰基-3-丁烯基硫苷粗提液
以萝卜籽粕为原料，按照萝卜籽粕的质量：体积分数为50％乙醇溶液的体积之比为1kg∶6L的比例，将萝卜籽粕均匀分散于乙醇溶液中，在温度为70℃的条件下，进行第一次浸提，浸提1h。第一次浸提完成后，将浸提混合物泵入压滤机进行压滤，分别收集第一次浸提清液和第一次浸提残渣。对于收集的第一次浸提残渣，在同等条件下，进行第二次浸提和压滤，分别收集第二次浸提清液和第二次浸提残渣。对于收集的第二次浸提清液，与收集的第一次浸提清液合并后，再泵入截留分子量为600Da的纳滤器中，在0.25MPa下，进行第一次纳滤分离，直至纳滤截留液的体积为原体积的20％时止，分别收集第一次纳滤滤过液和第一次纳滤截留液。对于收集的第一次纳滤截留液，补充去离子水至原体积，在同等条件下，进行第二次纳滤分离，直至第二次纳滤截留液的体积减少为原体积的5％时止，分别收集第二次纳滤滤过液和第二次纳滤截留液，并将两次收集的纳滤滤过液合并。对于合并的纳滤滤过液即为4-甲基亚磺酰基-3-丁烯基硫苷粗提液，用作下一步处理。
(2)制备高纯度4-甲基亚磺酰基-3-丁烯基硫苷浓缩液
第(1)步完成后，将市售制备色谱填料(SPS C18 10μm色谱填料)，分散于无水乙醇中，并装配成制备色谱柱，备用。再按照制备色谱柱：第(1)步合并的纳滤滤过液的体积比为1∶3的比例，将合并的纳滤滤过液以流速为制备色谱柱体积的3倍/小时的速度，泵入制备色谱柱中，进行吸附上样。上样结束后，在检测波长为280nm，体积分数为30％的乙醇溶液为流动相，流动相流速为制备色谱柱体积的3倍/小时的条件下，将流动相泵入制备色谱柱中，进行洗脱制备。然后待流动相泵入18min时，开始进行收集4-甲基亚磺酰基-3-丁烯基硫苷色谱流出液，待流动相泵入25min时，结束收集4-甲基亚磺酰基-3-丁烯基硫苷色谱流出液，分别收集4-甲基亚磺酰基-3-丁烯基硫苷色谱流出液、制备色谱洗脱液和制备色谱柱。对于收集的4-甲基亚磺酰基-3-丁烯基硫苷色谱流出液，泵入反渗透浓缩器中，在0.15MPa下，进行第一次反渗透浓缩，直到第一次反渗透截留液的体积减少至原体积的10％为止，分别收集第一次反渗透透过液和第一次反渗透截留液。对于收集的第一次反渗透截留液，加入去离子水，补充至原体积，在同等条件下，再进行第二次反渗透浓缩，直到第二次反渗透截留液的体积减少至原体积的5％为止，分别收集第二次反渗透透过液和第二次反渗透截留液。对于收集第二次反渗透截留液，即为高纯度4-甲基亚磺酰基-3-丁烯基硫苷浓缩液，纯度为95.6％。
(3)制备反应-分离耦合柱式反应器
第(2)步完成后，以市售黑芥子酶为原料，按照黑芥子酶的质量：缓冲溶液的体积比为1g∶6mL的比例，将黑芥子酶分散于缓冲溶液中，超声波处理10min后，进行过滤，分别收集过滤液和滤渣。对于收集的过滤液，用于制备固定化黑芥子酶。其中，所述的缓冲溶液为pH 5.0的醋酸-醋酸钠缓冲溶液。
将市售已活化的胺基型树脂(WA30树脂)，按照胺基型树脂的质量：收集的过滤液的体积：丙二醛质量浓度为18％的丙二醛溶液的体积比为1g∶3mL∶0.7mL的比例，先将胺基型树脂加入过滤液中，浸泡2h，再加入丙二醛溶液，在温度为40℃下进行固定化酶反应3h。反应完成后通过抽滤机进行抽滤，分别收集抽滤渣和抽滤液。对于收集的抽滤渣，用2倍于抽滤渣体积的去离子水对抽滤渣进行洗涤，分别收集洗涤渣和洗涤液。对于收集的洗涤渣，即为制备出的固定化黑芥子酶，4℃保存备用。
将制备得到的固定化黑芥子酶装入夹套保温层析柱中，用与固定化黑芥子酶等体积的去离子水进行反冲，然后升温至25℃，就得到固定化黑芥子酶反应柱。将市售已活化的吸附树脂(HP20树脂)，分散于去离子水中，并装配成吸附树脂层析柱，再用与吸附树脂层析柱等体积的去离子水进行反冲，就得到了莱菔素分离柱。将固定化黑芥子酶反应柱和莱菔素分离柱进行连接，就组装出反应-分离耦合柱式反应器，收集备用。
(4)制备高纯度莱菔素
第(3)步完成后，将第(2)步制得的高纯度4-甲基亚磺酰基-3-丁烯基硫苷浓缩液，泵入第(3)步组装得到的反应-分离耦合柱式反应器中，在高纯度4-甲基亚磺酰基-3-丁烯基硫苷浓缩液的泵入速度为反应-分离耦合柱式反应器体积的1倍/小时下，进行连续反应。反应结束后，收集柱式反应器流出液和反应-分离耦合柱式反应器。对于收集的反应-分离耦合柱式反应器，先将固定化黑芥子酶反应柱与莱菔素分离柱断开，然后再将莱菔素分离柱用2倍于莱菔素分离柱体积的无水乙醇进行洗脱，洗脱完成后，收集洗脱液和洗脱后的莱菔素分离柱。对于收集的洗脱液，经减压浓缩后，然后再置于真空干燥箱中，在真空度为0.07MPa下，真空干燥20h，最后得到高纯度莱菔素，莱菔素纯度达98.1％。
实施例2
一种用萝卜籽粕生产高纯度莱菔素的方法，具体方法步骤如下：
(1)制备4-甲基亚磺酰基-3-丁烯基硫苷粗提液
以萝卜籽粕为原料，按照萝卜籽粕的质量：体积分数为55％乙醇溶液的体积之比为1kg∶7L的比例，在温度为70℃的条件下，浸提1.5h。将浸提混合物泵入压滤机进行压滤，在同等条件下，进行第二次浸提和压滤，对于收集的第二次浸提清液，与收集的第一次浸提清液合并后，再泵入截留分子量为700Da的纳滤器中，在0.30MPa下，进行第一次纳滤分离，直至纳滤截留液的体积为原体积的25％时止，在同等条件下，进行第二次纳滤分离，直至第二次纳滤截留液的体积减少为原体积的10％时止。
(2)制备高纯度4-甲基亚磺酰基-3-丁烯基硫苷浓缩液
第(1)步完成后，将市售制备色谱填料(SMB C18 10μm色谱填料)，并装配成制备色谱柱。再按照制备色谱柱：第(1)步合并的纳滤滤过液的体积比为1∶4的比例，将合并的纳滤滤过液以流速为制备色谱柱体积的3倍/小时的速度，泵入制备色谱柱中。在检测波长为280nm，体积分数为35％的乙醇溶液为流动相，流动相流速为制备色谱柱体积的4倍/小时的条件下，将流动相泵入制备色谱柱中。然后待流动相泵入20min时，开始进行收集4-甲基亚磺酰基-3-丁烯基硫苷色谱流出液，待流动相泵入28min时，结束收集4-甲基亚磺酰基-3-丁烯基硫苷色谱流出液。对于收集的4-甲基亚磺酰基-3-丁烯基硫苷色谱流出液，泵入反渗透浓缩器中，在0.20MPa下，进行第一次反渗透浓缩，直到第一次反渗透截留液的体积减少至原体积的12％为止，在同等条件下，再进行第二次反渗透浓缩，直到第二次反渗透截留液的体积减少至原体积的6％为止，第二次反渗透截留液，即为高纯度4-甲基亚磺酰基-3-丁烯基硫苷浓缩液，纯度为97.2％。
(3)制备反应-分离耦合柱式反应器
第(2)步完成后，以市售黑芥子酶为原料，按照黑芥子酶的质量：缓冲溶液的体积比为1g∶7mL的比例，超声波处理15min后，进行过滤。其中，pH 5.6的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲溶液。
将市售已活化的胺基型树脂(SA20A树脂)，按照胺基型树脂的质量：收集的过滤液的体积：丙二醛质量浓度为18％的丙二醛溶液的体积比为1g∶4mL∶0.8mL的比例，浸泡2.5h，再加入丙二醛溶液，在温度为42℃下进行固定化酶反应4.5h。反应完成后通过抽滤机进行抽滤。用2倍于抽滤渣体积的去离子水对抽滤渣进行洗涤。
将制备得到的固定化黑芥子酶装入夹套保温层析柱中，然后升温至28℃。将市售已活化的吸附树脂(AB-8树脂)，并装配成吸附树脂层析柱，就得到了莱菔素分离柱。将固定化黑芥子酶反应柱和莱菔素分离柱进行连接，就组装出反应-分离耦合柱式反应器，收集备用。
(4)制备高纯度莱菔素
第(3)步完成后，将第(2)步制得的高纯度4-甲基亚磺酰基-3-丁烯基硫苷浓缩液，泵入第(3)步组装得到的反应-分离耦合柱式反应器中，在高纯度4-甲基亚磺酰基-3-丁烯基硫苷浓缩液的泵入速度为反应-分离耦合柱式反应器体积的2倍/小时下，进行连续反应。先将固定化黑芥子酶反应柱与莱菔素分离柱断开，然后再将莱菔素分离柱用2倍于莱菔素分离柱体积的无水乙醇进行洗脱。对于收集的洗脱液，经减压浓缩后，然后再置于真空干燥箱中，在真空度为0.075MPa下，真空干燥25h，最后得到高纯度莱菔素，莱菔素纯度达98.6％。
实施例3
一种用萝卜籽粕生产高纯度莱菔素的方法，具体方法步骤如下：
(1)制备4-甲基亚磺酰基-3-丁烯基硫苷粗提液
以萝卜籽粕为原料，按照萝卜籽粕的质量：体积分数为60％乙醇溶液的体积之比为1kg∶8L的比例，在温度为70℃的条件下，浸提2h。将浸提混合物泵入压滤机进行压滤，在同等条件下，进行第二次浸提和压滤，对于收集的第二次浸提清液，与收集的第一次浸提清液合并后，再泵入截留分子量为800Da的纳滤器中，在0.35MPa下，进行第一次纳滤分离，直至纳滤截留液的体积为原体积的30％时止，在同等条件下，进行第二次纳滤分离，直至第二次纳滤截留液的体积减少为原体积的15％时止。
(2)制备高纯度4-甲基亚磺酰基-3-丁烯基硫苷浓缩液
第(1)步完成后，将市售制备色谱填料(SPS C18 10μm色谱填料)，并装配成制备色谱柱。再按照制备色谱柱：第(1)步合并的纳滤滤过液的体积比为1∶5的比例，将合并的纳滤滤过液以流速为制备色谱柱体积的3倍/小时的速度，泵入制备色谱柱中。在检测波长为280nm，体积分数为40％的乙醇溶液为流动相，流动相流速为制备色谱柱体积的5倍/小时的条件下，将流动相泵入制备色谱柱中。然后待流动相泵入22min时，开始进行收集4-甲基亚磺酰基-3-丁烯基硫苷色谱流出液，待流动相泵入30min时，结束收集4-甲基亚磺酰基-3-丁烯基硫苷色谱流出液。对于收集的4-甲基亚磺酰基-3-丁烯基硫苷色谱流出液，泵入反渗透浓缩器中，在0.25MPa下，进行第一次反渗透浓缩，直到第一次反渗透截留液的体积减少至原体积的15％为止，在同等条件下，再进行第二次反渗透浓缩，直到第二次反渗透截留液的体积减少至原体积的8％为止，第二次反渗透截留液，即为高纯度4-甲基亚磺酰基-3-丁烯基硫苷浓缩液，纯度为98.9％。
(3)制备反应-分离耦合柱式反应器
第(2)步完成后，以市售黑芥子酶为原料，按照黑芥子酶的质量：缓冲溶液的体积比为1g∶8mL的比例，超声波处理20min后，进行过滤。其中，pH 4.8的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液。
将市售已活化的胺基型树脂(SA21A树脂)，按照胺基型树脂的质量：收集的过滤液的体积：丙二醛质量浓度为18％的丙二醛溶液的体积比为1g∶5mL∶0.9mL的比例，浸泡3h，再加入丙二醛溶液，在温度为45℃下进行固定化酶反应6h。反应完成后通过抽滤机进行抽滤。用2倍于抽滤渣体积的去离子水对抽滤渣进行洗涤。
将制备得到的固定化黑芥子酶装入夹套保温层析柱中，然后升温至30℃。将市售已活化的吸附树脂(D113树脂)，并装配成吸附树脂层析柱，就得到了莱菔素分离柱。将固定化黑芥子酶反应柱和莱菔素分离柱进行连接，就组装出反应-分离耦合柱式反应器，收集备用。
(4)制备高纯度莱菔素
第(3)步完成后，将第(2)步制得的高纯度4-甲基亚磺酰基-3-丁烯基硫苷浓缩液，泵入第(3)步组装得到的反应-分离耦合柱式反应器中，在高纯度4-甲基亚磺酰基-3-丁烯基硫苷浓缩液的泵入速度为反应-分离耦合柱式反应器体积的3倍/小时下，进行连续反应。先将固定化黑芥子酶反应柱与莱菔素分离柱断开，然后再将莱菔素分离柱用2倍于莱菔素分离柱体积的无水乙醇进行洗脱。对于收集的洗脱液，经减压浓缩后，然后再置于真空干燥箱中，在真空度为0.08MPa下，真空干燥30h，最后得到高纯度莱菔素，莱菔素纯度达99.2％。
Claims (1)
1.一种用萝卜籽粕生产高纯度莱菔素的方法，其特征在于具体方法步骤如下：
(1)制备4-甲基亚磺酰基-3-丁烯基硫苷粗提液
以萝卜籽粕为原料，按照萝卜籽粕的质量：体积分数为50～60％乙醇溶液的体积之比为1kg∶6～8L的比例，将萝卜籽粕均匀分散于乙醇溶液中，在温度为70℃的条件下，进行第一次浸提，浸提1～2h；第一次浸提完成后，将浸提混合物泵入压滤机进行压滤，分别收集第一次浸提清液和第一次浸提残渣；对于收集的第一次浸提残渣，在同等条件下，进行第二次浸提和压滤，分别收集第二次浸提清液和第二次浸提残渣；对于收集的第二次浸提清液，与收集的第一次浸提清液合并后，再泵入截留分子量为600～800Da的纳滤器中，在0.25～0.35MPa下，进行第一次纳滤分离，直至纳滤截留液的体积为原体积的20～30％时止，分别收集第一次纳滤滤过液和第一次纳滤截留液；对于收集的第一次纳滤截留液，补充去离子水至原体积，在同等条件下，进行第二次纳滤分离，直至第二次纳滤截留液的体积减少为原体积的5～15％时止，分别收集第二次纳滤滤过液和第二次纳滤截留液，并将两次收集的纳滤滤过液合并；对于合并的纳滤滤过液即为4-甲基亚磺酰基-3-丁烯基硫苷粗提液，用作下一步处理；
(2)制备高纯度4-甲基亚磺酰基-3-丁烯基硫苷浓缩液
第(1)步完成后，将市售制备色谱填料，即SPS C18 10μm色谱填料或SMB C18 10μm色谱填料，分散于无水乙醇中，并装配成制备色谱柱，备用；再按照制备色谱柱：第(1)步合并的纳滤滤过液的体积比为1∶3～5的比例，将合并的纳滤滤过液以流速为制备色谱柱体积的3倍/小时的速度，泵入制备色谱柱中，进行吸附上样；上样结束后，在检测波长为280nm，体积分数为30～40％的乙醇溶液为流动相，流动相流速为制备色谱柱体积的3～5倍/小时的条件下，将流动相泵入制备色谱柱中，进行洗脱制备；然后待流动相泵入18～22min时，开始进行收集4-甲基亚磺酰基-3-丁烯基硫苷色谱流出液，待流动相泵入25～30min时，结束收集4-甲基亚磺酰基-3-丁烯基硫苷色谱流出液，分别收集4-甲基亚磺酰基-3-丁烯基硫苷色谱流出液、制备色谱洗脱液和制备色谱柱；对于收集的4-甲基亚磺酰基-3-丁烯基硫苷色谱流出液，泵入反渗透浓缩器中，在0.15～0.25MPa下，进行第一次反渗透浓缩，直到第一次反渗透截留液的体积减少至原体积的10～15％为止，分别收集第一次反渗透透过液和第一次反渗透截留液；对于收集的第一次反渗透截留液，加入去离子水，补充至原体积，在同等条件下，再进行第二次反渗透浓缩，直到第二次反渗透截留液的体积减少至原体积的5～8％为止，分别收集第二次反渗透透过液和第二次反渗透截留液；对于收集第二次反渗透截留液，即为高纯度4-甲基亚磺酰基-3-丁烯基硫苷浓缩液，纯度为95.6～98.9％；
(3)制备反应-分离耦合柱式反应器
第(2)步完成后，以市售黑芥子酶为原料，按照黑芥子酶的质量∶缓冲溶液的体积比为1g∶6～8mL的比例，将黑芥子酶分散于缓冲溶液中，超声波处理10～20min后，进行过滤，分别收集过滤液和滤渣；对于收集的过滤液，用于制备固定化黑芥子酶；其中，所述的缓冲溶液为pH 5.0的醋酸-醋酸钠缓冲溶液或pH 5.6的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲溶液或pH 4.8的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液；
将市售已活化的胺基型树脂，即WA30树脂或SA20A树脂或SA21A树脂，按照胺基型树脂的质量∶收集的过滤液的体积∶丙二醛质量浓度为18％的丙二醛溶液的体积比为1g∶3～5mL∶0.7～0.9mL的比例，先将胺基型树脂加入过滤液中，浸泡2～3h，再加入丙二醛溶液，在温度为40～45℃下进行固定化酶反应3～6h；反应完成后通过抽滤机进行抽滤，分别收集抽滤渣和抽滤液；对于收集的抽滤渣，用2倍于抽滤渣体积的去离子水对抽滤渣进行洗涤，分别收集洗涤渣和洗涤液；对于收集的洗涤渣，即为制备出的固定化黑芥子酶，4℃保存备用；
将制备得到的固定化黑芥子酶装入夹套保温层析柱中，用与固定化黑芥子酶等体积的去离子水进行反冲，然后升温至25～30℃，就得到固定化黑芥子酶反应柱；将市售已活化的吸附树脂，即HP20树脂或AB-8树脂或D113树脂，分散于去离子水中，并装配成吸附树脂层析柱，再用与吸附树脂层析柱等体积的去离子水进行反冲，就得到了莱菔素分离柱；将固定化黑芥子酶反应柱和莱菔素分离柱进行连接，就组装出反应-分离耦合柱式反应器，收集备用；
(4)制备高纯度莱菔素
第(3)步完成后，将第(2)步制得的高纯度4-甲基亚磺酰基-3-丁烯基硫苷浓缩液，泵入第(3)步组装得到的反应-分离耦合柱式反应器中，在高纯度4-甲基亚磺酰基-3-丁烯基硫苷浓缩液的泵入速度为反应-分离耦合柱式反应器体积的1～3倍/小时下，进行连续反应；反应结束后，收集柱式反应器流出液和反应-分离耦合柱式反应器；对于收集的反应-分离耦合柱式反应器，先将固定化黑芥子酶反应柱与莱菔素分离柱断开，然后再将莱菔素分离柱用2倍于莱菔素分离柱体积的无水乙醇进行洗脱，洗脱完成后，收集洗脱液和洗脱后的莱菔素分离柱；对于收集的洗脱液，经减压浓缩后，然后再置于真空干燥箱中，在真空度为0.07～0.08MPa下，真空干燥20～30h，最后得到高纯度莱菔素，莱菔素纯度达98.1～99.2％。
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