CN101016331A - 分离纯化绿僵菌素的方法 - Google Patents
分离纯化绿僵菌素的方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN101016331A CN101016331A CN 200610132318 CN200610132318A CN101016331A CN 101016331 A CN101016331 A CN 101016331A CN 200610132318 CN200610132318 CN 200610132318 CN 200610132318 A CN200610132318 A CN 200610132318A CN 101016331 A CN101016331 A CN 101016331A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- fermented liquid
- destruxins
- extraction
- liquid
- volume ratio
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 49
- 241000223250 Metarhizium anisopliae Species 0.000 title claims abstract description 18
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims abstract description 67
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 13
- 239000012074 organic phase Substances 0.000 claims abstract description 12
- 239000012535 impurity Substances 0.000 claims abstract description 10
- 238000001035 drying Methods 0.000 claims abstract description 8
- 239000003463 adsorbent Substances 0.000 claims abstract description 7
- 230000002538 fungal effect Effects 0.000 claims abstract description 6
- 239000012071 phase Substances 0.000 claims abstract description 5
- 238000000605 extraction Methods 0.000 claims description 44
- YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N Dichloromethane Chemical compound ClCCl YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 28
- 239000002904 solvent Substances 0.000 claims description 25
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 24
- XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N Ethyl acetate Chemical compound CCOC(C)=O XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 24
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 24
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 claims description 17
- 238000004237 preparative chromatography Methods 0.000 claims description 17
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 claims description 16
- 239000000287 crude extract Substances 0.000 claims description 16
- 238000000926 separation method Methods 0.000 claims description 16
- 239000002594 sorbent Substances 0.000 claims description 16
- 238000000746 purification Methods 0.000 claims description 14
- 230000006837 decompression Effects 0.000 claims description 13
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 12
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 11
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 claims description 11
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 claims description 11
- 239000011259 mixed solution Substances 0.000 claims description 9
- 241000233866 Fungi Species 0.000 claims description 8
- 238000010828 elution Methods 0.000 claims description 8
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 7
- 239000005995 Aluminium silicate Substances 0.000 claims description 6
- 235000012211 aluminium silicate Nutrition 0.000 claims description 6
- NLYAJNPCOHFWQQ-UHFFFAOYSA-N kaolin Chemical compound O.O.O=[Al]O[Si](=O)O[Si](=O)O[Al]=O NLYAJNPCOHFWQQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 claims description 5
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 claims description 5
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 4
- 239000000741 silica gel Substances 0.000 claims description 4
- 229910002027 silica gel Inorganic materials 0.000 claims description 4
- 241000270295 Serpentes Species 0.000 claims description 3
- SVPXDRXYRYOSEX-UHFFFAOYSA-N bentoquatam Chemical compound O.O=[Si]=O.O=[Al]O[Al]=O SVPXDRXYRYOSEX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims description 3
- 239000000047 product Substances 0.000 abstract 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 abstract 2
- 238000001914 filtration Methods 0.000 abstract 1
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 abstract 1
- 238000002604 ultrasonography Methods 0.000 abstract 1
- 238000002203 pretreatment Methods 0.000 description 7
- UHOVQNZJYSORNB-UHFFFAOYSA-N Benzene Chemical compound C1=CC=CC=C1 UHOVQNZJYSORNB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 6
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000000463 material Substances 0.000 description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 3
- 238000003828 vacuum filtration Methods 0.000 description 3
- 241001443610 Aschersonia Species 0.000 description 2
- 101100008044 Caenorhabditis elegans cut-1 gene Proteins 0.000 description 2
- 101100008046 Caenorhabditis elegans cut-2 gene Proteins 0.000 description 2
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000223201 Metarhizium Species 0.000 description 2
- 241001465312 Ophiosphaerella Species 0.000 description 2
- 241000601794 Trichothecium Species 0.000 description 2
- GNBHVMBELHWUIF-UHFFFAOYSA-N destruxin-B Natural products O=C1C(CC(C)C)OC(=O)CCNC(=O)C(C)N(C)C(=O)C(C(C)C)N(C)C(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C2CCCN21 GNBHVMBELHWUIF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 2
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 2
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 2
- 239000002893 slag Substances 0.000 description 2
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 2
- 241000223600 Alternaria Species 0.000 description 1
- 231100000678 Mycotoxin Toxicity 0.000 description 1
- PNEYBMLMFCGWSK-UHFFFAOYSA-N aluminium oxide Inorganic materials [O-2].[O-2].[O-2].[Al+3].[Al+3] PNEYBMLMFCGWSK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000001093 anti-cancer Effects 0.000 description 1
- 230000000840 anti-viral effect Effects 0.000 description 1
- 239000008346 aqueous phase Substances 0.000 description 1
- 238000007630 basic procedure Methods 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 238000013375 chromatographic separation Methods 0.000 description 1
- 238000011097 chromatography purification Methods 0.000 description 1
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 1
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 238000004880 explosion Methods 0.000 description 1
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 1
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 1
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 239000002636 mycotoxin Substances 0.000 description 1
- VLKZOEOYAKHREP-UHFFFAOYSA-N n-Hexane Chemical compound CCCCCC VLKZOEOYAKHREP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000001473 noxious effect Effects 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 1
- 238000005191 phase separation Methods 0.000 description 1
- 239000000049 pigment Substances 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 238000007789 sealing Methods 0.000 description 1
- 238000010898 silica gel chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000012916 structural analysis Methods 0.000 description 1
Images
Landscapes
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明提供了一种分离纯化绿僵菌素的方法，此法包括下列步骤：(1)将真菌发酵液采用吸附法处理，除去其中的部分杂质，然后离心除去吸附剂，得发酵液清液；(2)在超声波作用下用萃取剂对所得发酵液清液进行萃取，然后经分液漏斗分离有机相和水相，保存有机相并浓缩得绿僵菌素粗提物；(3)对所得绿僵菌素粗提物进行减压层析，所得馏份浓缩干燥，再溶解并过滤；(4)制备色谱，上述减压所得粗提物在高效液相色谱仪中进一步分离纯化，得到各种高纯度绿僵菌素。此种方法可以快速、环保、节省和高效地分离纯化绿僵菌素，具有良好的社会经济价值。
Description
技术领域
本发明涉及一种分离纯化的方法，特别涉及一种分离纯化绿僵菌素的方法。
技术背景
绿僵菌素(destruxin)是真菌毒素，是一类环缩羧肽类化合物，主要由绿僵菌(Metarhizium)产生，其它真菌如壳座孢(Aschersonia)、链格孢(Altemaria)、单端孢(Trichothecium)及盘蛇孢(Ophiosphaerella)等也能形成不同种类的绿僵菌素。绿僵菌素有杀虫、抗病毒和抗癌等生物活性，经济价值很高。自从1961年，Kodaira首次分离出绿僵菌素A和B至今，35种绿僵菌素已经被分析鉴定。从Kodaira(1961)、Susuki(1970)到Pail等(1981)都是采用传统经典方法分离绿僵菌素。其方法第一步是萃取，将绿僵菌的发酵液离心或过滤去渣，然后调节其pH值到酸性，按其体积比：溶剂∶发酵液＝1∶1的比例加入乙酸乙酯、二氯甲烷、氯仿等溶剂萃取，将该过程重复多次，然后分离有机相和水相分离，保留有机相并通过旋转蒸发器或真空干燥器浓缩干燥，获得绿僵菌素的粗提物。第二步是层析，采用硅胶柱层析或氧化铝柱层析，用苯、丙酮、甲醇、二氯甲烷、乙酸乙酯和正己烷等溶剂，以不同浓度配比梯度洗脱，最后从不同馏份中可分离到不同的绿僵菌素，其中主要是绿僵菌素A、B和E，因为它们的含量较高，约占总绿僵菌素的85％左右。研究发展至今，虽然鉴定出多种绿僵菌素，但大多集中在结构分析和物理化学性质判定上，至于分离制备方法则仍然局限在繁杂的流程之中，整个过程需要使用大量的高毒溶剂，持续很长时间，制备成本非常高。
发明内容
本发明的目的是提供一种分离纯化绿僵菌素的方法，此法克服了常规方法的上述问题，应用此种方法可以达到快速、环保、节省和高效分离纯化绿僵菌素的目的。
在达到上述目的中，根据本发明提供的一种分离纯化绿僵菌素的方法，此法包括下列步骤：(1)真菌发酵液经过离心或真空抽滤去除固体残渣，所得发酵液采用吸附法处理，除去其中的部分杂质，然后离心除去吸附剂，得发酵液清液；(2)在超声波作用下用萃取剂对所得发酵液清液进行萃取，然后经分液漏斗分离有机相和水相，保存有机相并通过旋转蒸发器浓缩得绿僵菌素粗提物；(3)对所得绿僵菌素粗提物进行减压层析，所得馏份通过旋转蒸发器浓缩干燥，再溶解并过滤；(4)制备色谱，上述减压所得粗提物在高效液相色谱仪中进一步分离纯化，得到各种高纯度绿僵菌素。
吸附法预处理发酵液是通过吸附法除去发酵液中的杂质。真菌发酵液的组成非常复杂，从残余的培养基、菌组织，到蛋白质、色素和各种各样的代谢物质等。绿僵菌素的极性较低，且光吸收峰在波长200～220nm之间，当其溶于有机溶剂时呈无色透明液体，因此发酵液中吸收峰大于280nm的物质都可视为杂质，它们实际上是使发酵液颜色加深的物质。我们发现，利用吸附法预处理发酵液，能达到理想的去杂效果。其吸附法预处理发酵液的步骤是在下列条件下进行：用10％的盐酸溶液调节发酵液pH值至3.0～6.0；吸附剂为高岭土、硅藻土、膨润土，或它们其中一种或两种的混合物；吸附剂用量：吸附剂重量/发酵液体积＝1～5％；温度：15～35℃；振荡转速：100～200转/分；吸附处理0.5～2小时。而较好的吸附预处理条件是：用10％的盐酸溶液调节发酵液pH值至4.0；吸附剂为高岭土或硅藻土；吸附剂用量：吸附剂重量/发酵液体积＝2％；在24℃下，150转/分振荡吸附处理1小时。然后离心除去吸附剂。
由于超声波是一种纵波，它在液体中的传播会造成液体的压力变化而产生无数的微小真空泡，当这些真空泡受压爆破时，会形成强大的冲击，称为空穴效应，从而使萃取体系中分子增加碰撞机会，达到促进萃取效果的作用。因此，利用超声波促进萃取，能够减少溶剂用量、缩短萃取时间和降低萃取体系的温度以便减少目标物的损失。其超声波促进萃取绿僵菌素的条件是：用10％的盐酸溶液调节发酵液pH值至3.0～6.0；萃取溶剂为以下体积比的混合液∶乙酸乙酯∶二氯甲烷＝40～100∶60～0；萃取溶剂与发酵液的体积比为：萃取溶剂∶发酵液＝30～70∶70～30；超声波频率：30～50kHz；温度：-5～40℃；萃取时间：0.5～2小时；而较好的条件是：用10％的盐酸溶液调节发酵液pH值至4.0；萃取溶剂为以下体积比的混合液：乙酸乙酯∶二氯甲烷＝1∶1；萃取溶剂与发酵液的体积比为50∶50；超声波频率：40 kHz；温度：-5～10℃；萃取时间：1小时。
经过萃取后浓缩而成的绿僵菌素粗提物是一个混合体系，既含各种绿僵菌素，又含许多杂质。因此，该粗提物直接采用制备色谱分离纯化绿僵菌素时，由于杂质含量高，耗时很长。减压层析可以进一步除去杂质和分离不同的绿僵菌素组分，经减压层析后再用制备色谱，则不光缩短了时间，提高了效率，也减少了溶剂用量，降低了制备成本。减压层析装置由砂芯漏斗、玻璃抽滤瓶和真空泵组合而成。其减压层析条件是：硅胶H填柱；用二氯甲烷洗脱5～10个柱体积，或用以下体积比的混合液：二氯甲烷∶甲醇＝100～90∶0～10梯度洗脱5～10个柱体积。
经过减压层析所得浓缩物进一步在制备色谱仪上分离纯化。其色谱分离纯化在以下条件下进行：反相色谱柱；用以下体积比：乙腈∶水＝50∶50洗脱，或用以下体积比：乙腈∶水＝0～60∶100～40梯度洗脱；柱温：0～35℃；检测波长：200～220nm；而较好的检测波长：215nm，柱温：4℃。收集各馏份后，浓缩干燥，再作HPLC分析，与标准对照，确定绿僵菌素种类。
在本说明书中所用的“真菌发酵液”一词是指从主要由绿僵菌(Metarhizium)产生，或其它真菌如壳座孢(Aschersonia)、链格孢(Alternaria)、单端孢(Trichothecium)及盘蛇孢(Ophiosphaerella)等获得的包括不同种类的绿僵菌素的液体。
使用本发明的分离纯化绿僵菌素的方法的有益效果是：由于在萃取过程中采用了超声波促进萃取，从而省去了常规方法萃取过程需重复多次的繁杂，即节省了时间，又减少了溶剂用量，降低了制备成本；在层析过程中采用减压层析，即避免了使用苯等有毒溶剂，又为下一步骤制备色谱分离纯化除去了大量杂质，从而为制备色谱分离纯化省去了大量时间，也减少了溶剂用量，降低成本，达到了快速、环保、节省和高效分离纯化绿僵菌素的目的。
附图说明
图1表示分离纯化绿僵菌素的方法流程图；
图2表示吸附法预处理发酵液流程图；
图3表示超声波促进萃取流程图；
图4表示减压层析流程图；
图5表示减压层析装置示意图；
图6表示减压层析后制备色谱分离纯化绿僵菌素的HPLC图谱；
图7表示超声波促进萃取后制备色谱分离纯化绿僵菌素的HPLC图谱。
1.砂芯漏斗 2.样品层(其上盖滤纸) 3.硅胶H层
4.磨口套接或密封胶塞 5.真空泵接口 6.玻璃抽滤瓶
具体实施方式
用本发明的分离纯化绿僵菌素的方法基本流程是：
如图1所示，(1)吸附法预处理发酵液：真菌发酵液经过离心或真空抽滤去除固体残渣，所得发酵液采用吸附法处理，除去其中的部分杂质，然后离心除去吸附剂，得发酵液清液；(2)超声波促进萃取：在超声波作用下用萃取剂对所得发酵液清液进行萃取，然后经分液漏斗分离有机相和水相，保存有机相并通过旋转蒸发器浓缩得绿僵菌素粗提物；(3)减压层析：对所得绿僵菌素粗提物进行减压层析，所得馏份通过旋转蒸发器浓缩干燥，再溶解并过滤；(4)制备色谱分离纯化：制备色谱，上述减压所得粗提物在高效液相色谱仪中进一步分离纯化，得到各种高纯度绿僵菌素。
下列实施例将进一步说明本发明，但本发明不仅限于实施例。
实施例1
将从金龟子绿僵菌小孢变种(Metarhizium anisopliae var.anisopliae)产生的液体经发酵后，用5000～8000转/分的离心机离心10～15分钟，去渣；或真空抽滤去渣；用10％的盐酸溶液调节发酵液pH值至4.0，用高岭土或硅藻土作吸附剂，并按吸附剂重量/发酵液体积＝2％加入到发酵液中，在24℃下，150转/分振荡吸附处现1小时；然后用5000～8000转/分的离心机离心10～15分钟，去除吸附剂，保留发酵液，如图2所示；用10％的盐酸溶液调节发酵液pH值至4.0，萃取溶剂为以下体积比的混合液：乙酸乙酯∶二氯甲烷＝1∶1；萃取溶剂与发酵液的体积比为50∶50；用频率为40kHz的超声波在温度-5～10℃的范围中萃取1小时，然后经分液漏斗分离有机相和水相，保存有机相并通过旋转蒸发器浓缩，得到绿僵菌素粗提物，对绿僵菌素A和B的萃取效率达到95％以上，流程如图3所示；然后减压层析：硅胶H填柱；用二氯甲烷洗脱5～10个柱体积，或用以下体积比的混合液：二氯甲烷∶甲醇＝100～90∶0～10梯度洗脱5～10个柱体积，得馏分1或馏分2，然后用旋转蒸发器浓缩馏分去除溶剂，从馏分1中得到绿僵菌素A和B粗提物，或从馏分2中得到绿僵菌素C、D和E粗提物，对绿僵菌素A和B的回收率达到95％以上，其流程如图4所示，装置如图5所示。将各馏份浓缩干燥，再溶解并过滤后制备色谱分离纯化：反相色谱柱；用以下体积比：乙腈∶水＝50∶50洗脱，或用以下体积比：乙腈∶水＝0～60∶100～40梯度洗脱；并用215nm波长紫外光在柱温4℃检测绿僵菌素。各馏份浓缩干燥，再作HPLC分析，与标准对照，确定绿僵菌素种类。
实施例2
按所述的相同步骤重复进行实施例1，但是吸附法预处理发酵液、超声波促进萃取、制备色谱分离纯化过程的条件分别改为：
(1)吸附法预处理发酵液的条件：
用10％的盐酸溶液调节发酵液pH值至3.0～6.0；吸附剂为高岭土、硅藻土、膨润土，或它们其中一种或两种的混合物；吸附剂用量：吸附剂重量/发酵液体积＝1～5％；温度：15～35℃；振荡转速：100～200转/分；吸附处理0.5～2小时。
(2)超声波促进萃取的条件：
用10％的盐酸溶液调节发酵液pH值至3.0～6.0；萃取溶剂为以下体积比的混合液：乙酸乙酯∶二氯甲烷＝40～100∶60～0；萃取溶剂与发酵液的体积比为：萃取溶剂∶发酵液＝30～70∶70～30；超声波频率：30～50kHz；温度：-5～40℃；萃取时间：03～2小时。
(3)制备色谱分离纯化的条件：
反相色谱柱；用以下体积比：乙腈∶水＝50∶50洗脱，或用以下体积比：乙腈∶水＝0～60∶100～40梯度洗脱；
柱温：0～35℃；检测波长：200～220nm
对比例1
按实施例1所述的相同条件重复进行实施例1，但省去其中间(3)减压层析这一步骤，而直接将超声波促进萃取后得到的绿僵菌素粗提物，用高效液相色谱仪中进一步分离纯化。在HPLC图谱中，实施例1减压层析后制备色谱分离纯化，其测定绿僵菌素A在用时8分钟左右时测定峰面积达到最大值，绿僵菌素B在用时12分钟左右时测定峰面积达到最大值。而本实施例超声波促进萃取后制备色谱分离纯化中，其测定绿僵菌素A在用时50分钟左右时测定峰面积达到最大值，绿僵菌素B在用时60分钟左右时测定峰面积达到最大值，其具体分离纯化绿僵菌素的HPLC图谱情况如图6、图7所示。
Claims (9)
1.一种分离纯化绿僵菌素的方法，该方法包括下列步骤：
(1)将真菌发酵液采用吸附法处理，除去其中的部分杂质，然后离心除去吸附剂，得发酵液清液；
(2)在超声波作用下用萃取剂对所得发酵液清液进行萃取，然后经分液漏斗分离有机相和水相，保存有机相并浓缩得绿僵菌素粗提物；
(3)对所得绿僵菌素粗提物进行减压层析，所得馏份浓缩干燥，再溶解并过滤；
(4)制备色谱，上述减压所得粗提物在高效液相色谱仪中进一步分离纯化，得到各种高纯度绿僵菌素。
2.按照权利要求1的方法，其中所述步骤(1)中吸附法的条件是：用10％的盐酸溶液调节发酵液pH值至3.0～6.0；吸附剂为高岭土、硅藻土、膨润土，或它们其中一种或两种的混合物；吸附剂用量：吸附剂重量/发酵液体积＝1～5％；温度：15～35℃；振荡转速：100～200转/分；吸附处理0.5～2小时。
3.按照权利要求2的方法，其中所述步骤(1)中吸附法的条件是：用10％的盐酸溶液调节发酵液pH值至4.0；吸附剂为高岭土或硅藻上；吸附剂用量：吸附剂重量/发酵液体积＝2％；在24℃下，150转/分振荡吸附处理1小时。
4.按照权利要求1的方法，其中所述步骤(2)中用超声波促进萃取的条件是：用10％的盐酸溶液调节发酵液pH值至3.0～6.0；萃取溶剂为以下体积比的混合液：乙酸乙酯∶二氯甲烷＝40～100∶60～0；萃取溶剂与发酵液的体积比为：萃取溶剂∶发酵液＝30～70∶70～30；超声波频率：30～50kHz；温度：-5～40℃；萃取时间：0.5～2小时。
5.按照权利要求4的方法，其中所述步骤(2)中用超声波促进萃取的条件是：用10％的盐酸溶液调节发酵液pH值至4.0；萃取溶剂为以下体积比的混合液：乙酸乙酯∶二氯甲烷＝1∶1；萃取溶剂与发酵液的体积比为50∶50；超声波频率：40kHz；温度：-5～10℃；萃取时间：1小时。
6.按照权利要求1的方法，其中所述步骤(3)中减压层析的条件是：硅胶H填柱；用二氯甲烷洗脱5～10个柱体积，或用以下体积比的混合液：二氯甲烷∶甲醇＝100～90∶0～10梯度洗脱5～10个柱体积。
7.按照权利要求1的方法，其中所述步骤(4)中制备色谱的条件是：反相色谱柱；用以下体积比：乙腈∶水＝50∶50洗脱，或用以下体积比：乙腈∶水＝0～60∶100～40梯度洗脱；柱温：0～35℃；检测波长：200～220nm。
8.按照权利要求7的方法，其中所述步骤(4)中制备色谱的条件是：柱温：4℃；检测波长：215nm。
9.按照权利要求1的方法，其中所述真菌来自半知菌亚门丝孢纲，其种类包括绿僵菌、壳座孢、链格孢、单端孢及盘蛇孢。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN2006101323180A CN101016331B (zh) | 2006-12-26 | 2006-12-26 | 分离纯化绿僵菌素的方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN2006101323180A CN101016331B (zh) | 2006-12-26 | 2006-12-26 | 分离纯化绿僵菌素的方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN101016331A true CN101016331A (zh) | 2007-08-15 |
| CN101016331B CN101016331B (zh) | 2010-11-10 |
Family
ID=38725571
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN2006101323180A Expired - Fee Related CN101016331B (zh) | 2006-12-26 | 2006-12-26 | 分离纯化绿僵菌素的方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN101016331B (zh) |
Cited By (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101560473B (zh) * | 2008-11-25 | 2011-07-27 | 华南农业大学 | 一种高产绿僵菌素菌株及其应用 |
| CN101427691B (zh) * | 2008-12-15 | 2011-11-16 | 华南农业大学 | 一种金龟子绿僵菌与绿僵菌素混合杀虫组合物 |
| CN102337317A (zh) * | 2011-08-25 | 2012-02-01 | 浙江东奇生物科技有限公司 | 绿僵菌制剂及其在防治植物寄生性线虫方面的应用 |
| CN102349545A (zh) * | 2011-08-25 | 2012-02-15 | 浙江东奇生物科技有限公司 | 绿僵菌制剂及其在防治粘虫方面的应用 |
| CN104530186A (zh) * | 2015-01-04 | 2015-04-22 | 上海吉尔多肽有限公司 | 一种他替瑞林的分离纯化方法 |
| CN112778797A (zh) * | 2021-02-22 | 2021-05-11 | 安徽农业大学 | 一种绿僵菌中的天然绿色色素的提取方法 |
| CN115521362A (zh) * | 2022-09-30 | 2022-12-27 | 哈尔滨工业大学（深圳） | 一种PseudodestruxinB的制备方法 |
| CN115521362B (zh) * | 2022-09-30 | 2024-05-28 | 哈尔滨工业大学（深圳） | 一种Pseudodestruxin B的制备方法 |
-
2006
- 2006-12-26 CN CN2006101323180A patent/CN101016331B/zh not_active Expired - Fee Related
Cited By (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101560473B (zh) * | 2008-11-25 | 2011-07-27 | 华南农业大学 | 一种高产绿僵菌素菌株及其应用 |
| CN101427691B (zh) * | 2008-12-15 | 2011-11-16 | 华南农业大学 | 一种金龟子绿僵菌与绿僵菌素混合杀虫组合物 |
| CN102337317A (zh) * | 2011-08-25 | 2012-02-01 | 浙江东奇生物科技有限公司 | 绿僵菌制剂及其在防治植物寄生性线虫方面的应用 |
| CN102349545A (zh) * | 2011-08-25 | 2012-02-15 | 浙江东奇生物科技有限公司 | 绿僵菌制剂及其在防治粘虫方面的应用 |
| CN104530186A (zh) * | 2015-01-04 | 2015-04-22 | 上海吉尔多肽有限公司 | 一种他替瑞林的分离纯化方法 |
| CN112778797A (zh) * | 2021-02-22 | 2021-05-11 | 安徽农业大学 | 一种绿僵菌中的天然绿色色素的提取方法 |
| CN112778797B (zh) * | 2021-02-22 | 2022-04-29 | 安徽农业大学 | 一种绿僵菌中的天然绿色色素的提取方法 |
| CN115521362A (zh) * | 2022-09-30 | 2022-12-27 | 哈尔滨工业大学（深圳） | 一种PseudodestruxinB的制备方法 |
| CN115521362B (zh) * | 2022-09-30 | 2024-05-28 | 哈尔滨工业大学（深圳） | 一种Pseudodestruxin B的制备方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN101016331B (zh) | 2010-11-10 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN101016331B (zh) | 分离纯化绿僵菌素的方法 | |
| CN111487356B (zh) | 一种利用超临界流体色谱系统分离辅酶q10的方法 | |
| CN100384797C (zh) | 一种提取高纯度茄尼醇的方法 | |
| EP3890859A2 (en) | Process for purifying tetrahydrocannabinol using a chromatographic stationary phase | |
| CN102675426B (zh) | 一种达托霉素的提取纯化方法 | |
| CN101935278A (zh) | 由杜仲叶提取、分离、纯化绿原酸的方法 | |
| CN110655453A (zh) | 一种次大麻二酚的提取分离方法 | |
| CN102321135A (zh) | 一种利用高速逆流色谱分离纯化虫草素的方法 | |
| CN107674116B (zh) | 一种纽莫康定b0的纯化方法 | |
| CN1065246C (zh) | 棒酸盐的制备方法 | |
| CN101455330B (zh) | 一种番茄红素提取方法 | |
| CN102093328B (zh) | 一种富集纯化松树皮中原花青素的方法 | |
| CN108727328A (zh) | 一种蓝莓花青素的高效提取及纯化方法 | |
| CN102977173A (zh) | 一种高纯度维生素b12的纯化工艺 | |
| CN109021040A (zh) | 一种栀子苷的连续色谱分离纯化方法 | |
| CN104926719A (zh) | 一种从火麻仁中提取葫芦巴碱的方法 | |
| CN111018939A (zh) | 一种茶皂素的快速精制方法 | |
| CN102728096B (zh) | 一种银杏叶提取过程的除杂方法 | |
| CN103254226B (zh) | 一种固定床吸附法分离纯化卵磷脂的方法 | |
| CN107721909B (zh) | 从桑科植物中连续提取dnj、黄酮、多糖的方法和系统 | |
| CN101985102A (zh) | 一种辅酶q10层析硅胶的在线再生方法 | |
| CN1563400A (zh) | 一种分离制备灵菌红素的方法 | |
| CN105111286A (zh) | 一种高效制备纽莫康定b0的方法 | |
| CN101367728B (zh) | 从紫锥菊提取物纯化菊苣酸和单咖啡酰酒石酸的方法 | |
| CN103965156A (zh) | 一种用于天然维生素e提纯的柱层析法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| ASS | Succession or assignment of patent right |
Owner name: GUANGDONG NEWSCENE BIOLOGICAL ENGINEERING CO., LTD Free format text: FORMER OWNER: SOUTH CHINA AGRICULTURAL UNIVERSITY Effective date: 20150119 |
|
| C41 | Transfer of patent application or patent right or utility model | ||
| COR | Change of bibliographic data |
Free format text: CORRECT: ADDRESS; FROM: 510642 GUANGZHOU, GUANGDONG PROVINCE TO: 529500 YANGJIANG, GUANGDONG PROVINCE |
|
| TR01 | Transfer of patent right |
Effective date of registration: 20150119 Address after: 529500, Vientiane Industrial Park, North customs town, Yangdong County, Yangjiang City, Guangdong Province, No. seven, 1, Chicheng Road Patentee after: GUANGDONG XINJINGXIANG BIOENGINEERING Co.,Ltd. Address before: 510642 Guangdong city of Guangzhou province Tianhe District Wushan South China Agricultural University Patentee before: South China Agricultural University |
|
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20101110 |
|
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |