CN109265577A - 一种泥鳅多糖的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本公开内容涉及制备泥鳅多糖的方法，包括以下步骤：(i)用高温水处理泥鳅，收集泥鳅表层黏液；(ii)加入酶，得到酶解液；(iii)使酶解液静置沉淀；(iv)去除沉淀物并浓缩，得到浓缩液；(v)向浓缩液加入醇，得到沉淀物；(vi)对沉淀物进行干燥，得到泥鳅多糖。
Description
技术领域
本发明涉及天然物质的提取技术领域，更具体而言，涉及一种泥鳅多糖的制备方法。
背景技术
泥鳅中含有大量对人体有益的生物活性物质，如蛋白质、抗菌肽、糖蛋白、泥鳅多糖(Misgurnus anguillicaudatus polysaccharides, MAP)、不饱和多烯脂肪酸、牛磺酸和赖氨酸等必需氨基酸以及锌、硒等微量营养元素。
泥鳅分泌多糖属于黏多糖，是动物体内蛋白多糖分子中的糖链部分。泥鳅多糖中含氨基糖和硫酸基，其含量分别为11.19%±0.03%，19.11%±0.41%(x±s, n=3)；泥鳅多糖中未发现糖醛酸。钦传光等(钦传光. 泥鳅多糖的分离、纯化、表征及生物活性研究，博士学位论文，华中科技大学，2001；周军. 泥鳅不同提取物的生物活性研究，硕士学位论文, 华中科技大学，2003)从泥鳅表皮黏液中提取中性黏多糖，经高效液相分离发现该多糖由一个高聚糖(MAP，19.1%)和一个寡糖(MAO，80.9%)组成。研究证实泥鳅多糖能够有效地清除O2 -、H2O2等活性氧，对DNA链有一定的保护作用；发现泥鳅多糖可抑制白细胞游走，具有显著的抗炎效果；泥鳅多糖能增强小鼠脾细胞中T细胞、细胞毒T淋巴细胞和天然杀伤细胞的活性；泥鳅多糖可明显降低糖尿病模型小鼠的高血糖及高血脂症，还证明通过模型小鼠动物试验，证实泥鳅多糖可阻断肝损伤小鼠的肝细胞损伤，具有保肝护肝功效；另外泥鳅多糖能抑制人胃癌SGC-7901细胞、白血病HL-60细胞和肝癌细胞的生长。
提取泥鳅多糖的现有技术方法，例如钦传光等(钦传光，黄开勋，徐辉碧，泥鳅多糖的免疫作用研究，中国药学杂志，2002年8月第37卷第8期)需要将鲜活泥鳅用蒸馏水浸养3天，该过程不仅耗时长，并且能耗高，因为饲养水浓缩需消耗大量能源。
因此，需要适于工业生产且耗时短、易操作、成本低的泥鳅多糖提取方法。
发明内容
预料不到地，本申请发明人发现，与现有技术的方法相比，仅通过高温水处理这一步骤就可获取泥鳅表面的全部黏液，这使得本发明的方法耗时短、用水量少、能耗小，且产量高。
在一方面，提供了制备泥鳅多糖的方法，包括以下步骤：
(i)用高温水处理泥鳅，收集泥鳅表层黏液；
(ii)加入酶，得到酶解液；
(iii)使酶解液静置沉淀；
(iv)去除沉淀物并浓缩，得到浓缩液；
(v)向浓缩液加入醇，得到沉淀物；
(vi)对沉淀物进行干燥，得到泥鳅多糖。
在一个实施方案中，所述高温水的温度是50℃-100℃，优选70℃-90℃。
在一个实施方案中，所述步骤(i)中高温水与泥鳅的重量比是0.5-4:1。
在一个实施方案中，所述步骤(i)中高温水与泥鳅的重量比优选是1:1。
在一个实施方案中，所述步骤(ii)中的酶选自木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、碱性蛋白酶或它们的混合物。
在一个实施方案中，在所述步骤(ii)中还包括在高温下使酶灭活及去除蛋白的步骤。
在一个实施方案中，在所述步骤(iv)中通过过滤或离心去除沉淀物。
在一个实施方案中，在所述步骤(iv)中用滤液膜设备或在真空下进行浓缩。
在一个实施方案中，所述膜设备选自纳滤膜设备、超滤膜设备或反渗透膜设备。
在一个实施方案中，所述步骤(v)中的醇是乙醇，优选高浓度乙醇。
在一个实施方案中，所述步骤(vi)中的干燥选自冷冻干燥、鼓风干燥、真空干燥或喷雾干燥。
在一个具体方面，提供了一种制备泥鳅多糖的方法，包括以下步骤：
(i)用50℃-100℃的高温水处理泥鳅，收集泥鳅表层黏液；
(ii)加入酶，得到酶解液；
(iii)使酶解液静置沉淀；
(iv)去除沉淀物并浓缩，得到浓缩液；
(v)向浓缩液加入醇，得到沉淀物；
(vi)对沉淀物进行干燥，得到泥鳅多糖。
在另一个具体方面，提供了一种制备泥鳅多糖的方法，包括以下步骤：
(i)用70℃-90℃的高温水处理泥鳅，收集泥鳅表层黏液；
(ii)加入酶，得到酶解液；
(iii)使酶解液静置沉淀；
(iv)去除沉淀物并浓缩，得到浓缩液；
(v)向浓缩液加入醇，得到沉淀物；
(vi)对沉淀物进行干燥，得到泥鳅多糖。
在另一个方面，提供了通过任何前述方法获得的泥鳅多糖。
本发明采用高温水处理泥鳅，然后酶解蛋白，再进一步通过醇沉淀而纯化的步骤组合来制备泥鳅多糖。本发明的工艺简单、易操作、能耗低、成本低，适于工业生产。
本发明方法提取的泥鳅多糖，在抗癌、提高免疫力等方面发挥作用，可广泛应用于食品、医药、保健品等领域，市场前景广阔。
附图说明
图1图示根据本发明的方法制备泥鳅多糖的一般流程图。
具体实施方式
除非另外定义，本文所用的所有技术和科学术语具有本领域技术人员通常理解的相同含义。在冲突的情况下，以本申请说明书为准。下面描述优选的方法和材料，但是与本文所述那些类似或等同的方法和材料可用于实施或测试本发明。本文公开的材料、方法和实例仅是说明性的，而非旨在限制。
预料不到地，本申请发明人发现，与现有技术的方法相比，仅通过高温水处理这一步骤就可获取泥鳅表面的全部黏液，这使得本发明的方法耗时短、用水量少、能耗小，且产量高。
在一方面，提供了制备泥鳅多糖的方法，包括以下步骤：(i)对泥鳅进行处理，收集泥鳅表层黏液；(ii)加入酶使黏液中的蛋白酶解，然后使酶灭活，得到酶解液；(iii)使酶解液静置沉淀；(iv)过滤或离心去除沉淀物并用膜设备浓缩，得到浓缩液；(v)通过向浓缩液加入醇而沉淀，过滤得到沉淀物；(vi)对沉淀物进行干燥，得到泥鳅多糖。
在一个实施方案中，所述处理可以用高温水进行。
在一个实施方案中，所述高温水的温度可以是50℃-100℃，例如50℃、51℃、52℃、53℃、54℃、55℃、56℃、57℃、58℃、59℃、60℃、61℃、62℃、63℃、64℃、65℃、66℃、67℃、68℃、69℃、70℃、71℃、72℃、73℃、74℃、75℃、76℃、77℃、78℃、79℃、80℃、81℃、82℃、83℃、84℃、85℃、86℃、87℃、88℃、89℃、90℃、91℃、92℃、93℃、94℃、95℃、96℃、97℃、98℃、99℃或100℃。
在一个实施方案中，高温水的温度优选是70℃-90℃，例如70℃-80℃或80℃-90℃。
在一个实施方案中，所述步骤(i)中高温水与泥鳅的重量比可以是0.5-4:1，例如0.5:1、0.75:1、1:1、1.25:1、1.5:1、1.75:1、2:1、2.25:1、2.5:1、2.75:1、3:1、3.25:1、3.5:1、3.75:1或4:1。
在一个实施方案中，所述步骤(i)中高温水与泥鳅的重量比优选是1:1。
在一个实施方案中，所述步骤(ii)中的酶可以选自木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、碱性蛋白酶或它们的混合物。
在一个实施方案中，在所述步骤(ii)中还包括在高温下使酶灭活的步骤。
在一个实施方案中，在所述步骤(iv)中通过过滤或离心去除沉淀物。
在一个实施方案中，在所述步骤(iv)中用滤液膜设备或在真空下进行浓缩。
在一个实施方案中，所述滤液膜设备可以选自纳滤膜设备、超滤膜设备或反渗透膜设备。
在一个实施方案中，所述步骤(v)中的醇可以是乙醇，优选高浓度乙醇。
在一个实施方案中，所述步骤(vi)中的干燥可以选自冷冻干燥、鼓风干燥、真空干燥或喷雾干燥。
在一个具体方面，提供了一种制备泥鳅多糖的方法，包括以下步骤：
(i)用50℃-100℃的高温水处理泥鳅，收集泥鳅表层黏液；
(ii)加入酶，得到酶解液；
(iii)使酶解液静置沉淀；
(iv)去除沉淀物并浓缩，得到浓缩液；
(v)向浓缩液加入醇，得到沉淀物；
(vi)对沉淀物进行干燥，得到泥鳅多糖。
在另一个具体方面，提供了一种制备泥鳅多糖的方法，包括以下步骤：
(i)用70℃-90℃的高温水处理泥鳅，收集泥鳅表层黏液；
(ii)加入酶，得到酶解液；
(iii)使酶解液静置沉淀；
(iv)去除沉淀物并浓缩，得到浓缩液；
(v)向浓缩液加入醇，得到沉淀物；
(vi)对沉淀物进行干燥，得到泥鳅多糖。
在另一个方面，提供了通过任何前述方法获得的泥鳅多糖。
本发明采用高温水处理泥鳅，再进一步通过醇沉淀而纯化的步骤组合制备泥鳅多糖。这大大简化了工艺流程，并且相对于现有技术的方法易于操作且成本较低，适于工业生产。
为了使本领域的技术人员更好地理解本发明的技术方案，下面结合具体实施例对本发明作进一步的详细说明。
实施例1. 泥鳅多糖的检测
硫酸-苯酚法标准曲线：精密称取葡萄糖对照品100mg，置于1000mL容量瓶中，加适量水溶解，稀释至刻度，摇匀，即得0.1mg/ml葡萄糖母液。分别吸取葡萄糖母液0.4、0.8、1.2、1.6、2.0ml至25ml加塞试管中，加水补足至2.0ml，加入5%苯酚水溶液1.0ml并混匀。随后快速加入5ml浓硫酸，10min后摇匀30s，30℃水浴20min。准确吸取150μl葡萄糖溶液至96孔板中，在490nm波长处以试剂空白溶液为参比，测定吸光度。以吸光度为横坐标，葡萄糖浓度为纵坐标，绘制标准曲线，得到回归方程：Y=0.1707X+0.0007(R2=0.9997)。
样品配制：精密称取适量样品，置于25mL容量瓶中，加适量水溶解，稀释至刻度，摇匀，即得样品溶液。吸取样品1ml至25ml加塞试管中，加水补足至2.0ml，加入5%苯酚水溶液1.0ml混匀。随后快速加入5ml浓硫酸，10min后摇匀30s，30℃水浴20min。准确吸取150μl葡萄糖溶液至96孔板中，在490nm波长处以试剂空白溶液为参比，测定吸光度。
泥鳅多糖浓度＝{0.1707* (A样品-A空白)+0.0007}/1*2*25/M取样量×100％
其中，A样品：样品吸光度，A空白：空白试剂吸光度，M取样量：样品的取样质量(mg)。
实施例2. 泥鳅多糖的制备
方法1：
经浸养干净的泥鳅2kg，置于带盖不锈钢桶中，将70℃1倍泥鳅重量体积的热水倒入桶中，盖好盖子，搅拌1分钟，过滤，收集热水液；收集液放冷后加入泥鳅重量0.05%的木瓜蛋白酶(800 u/mg)，60℃水浴保温酶解6小时；加热至沸腾，保持20分钟；向酶解液加入泥鳅重量0.2%的硅藻土，搅拌均匀后4℃静置4小时，过滤，滤液用1000D纳滤膜浓缩，浓缩至200ml左右，加4倍95%乙醇，使醇浓度大于70%，混合均匀，4℃静置8小时；4℃、10000r/min离心10min，得白色或类白色沉淀，沉淀用95%乙醇洗涤2次，然后在60℃经鼓风干燥，得到1.5g白色粉末。根据实施例1所述的方法对样品进行检测，泥鳅多糖含量为19.9%。
方法2：
经浸养干净的泥鳅2kg，置于带盖不锈钢桶中，将80℃0.75倍泥鳅重量体积的热水倒入桶中，盖好盖子，搅拌1分钟，过滤，用0.25倍泥鳅重量体积的室温水冲洗，收集热水液及冲洗液；放冷后加入泥鳅重量0.1%的碱性蛋白酶(200u/mg)，55℃水浴保温酶解4小时；加热至沸腾，保持20分钟；向酶解液加入泥鳅重量0.2%的硅藻土，搅拌均匀后4℃静置4小时，过滤，滤液用800D反渗透膜浓缩，浓缩至200ml左右，加5倍90%乙醇，使醇浓度大于60%，混合均匀，4℃静置8小时；4℃、10000r/min离心10min，得到棕色或浅棕色沉淀，沉淀用95%乙醇洗涤2次，沉淀用纯化水溶解后经冷冻干燥，得到1.6g棕色粉末。根据实施例1所述的方法对样品进行检测，泥鳅多糖含量为13.7%。
方法3：
经浸养干净的泥鳅2kg，置于带盖不锈钢桶中，将80℃0.75倍泥鳅重量体积的热水倒入桶中，盖好盖子，搅拌1分钟，过滤，用0.25倍泥鳅重量体积的室温水冲洗，收集热水液及冲洗液；放冷后加入泥鳅重量0.2%的中性蛋白酶(100u/mg)，45℃水浴保温酶解4小时；加热至沸腾，保持20分钟；向酶解液加入泥鳅重量0.2%的硅藻土，搅拌均匀后4℃静置4小时，过滤，真空浓缩，浓缩至200ml左右，加入5倍90%乙醇，使醇浓度大于60%，混合均匀，4℃静置8小时；4℃、10000r/min离心10min，得到棕色或浅棕色沉淀，沉淀用95%乙醇洗涤2次，然后在60℃经鼓风干燥，得到1.6g棕色粉末。根据实施例1所述的方法对样品进行检测，泥鳅多糖含量为13.4%。
虽然本发明某些特征已经在本文中阐释和描述，但本领域技术人员将想到许多修改、替代、变更和等同。因此，应理解的是，所附权利要求书意在涵盖落入本发明真实精神范围之内的所有此类修改和变更。
Claims (11)
1.一种制备泥鳅多糖的方法，包括以下步骤：
(i)用高温水处理泥鳅，收集泥鳅表层黏液；
(ii)加入酶，得到酶解液；
(iii)使酶解液静置沉淀；
(iv)去除沉淀物并浓缩，得到浓缩液；
(v)向浓缩液加入醇，得到沉淀物；
(vi)对沉淀物进行干燥，得到泥鳅多糖。
2.根据权利要求1所述的方法，其中高温水的温度是50℃-100℃，优选70℃-90℃。
3. 根据权利要求1所述的方法，其中高温水与泥鳅的重量比是0.5-4: 1，优选1: 1。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其中所述步骤(ii)中的酶选自木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、碱性蛋白酶或它们的混合物。
5.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其中在所述步骤(ii)中还包括在高温下使酶灭活及去除蛋白的步骤。
6.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其中在所述步骤(iv)中通过过滤或离心去除沉淀物。
7.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其中在所述步骤(iv)中用膜设备或在真空下进行浓缩。
8.根据权利要求7所述的方法，其中所述膜设备选自纳滤膜设备、超滤膜设备或反渗透膜设备。
9. 根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其中所述步骤(v)中的醇是高浓度乙醇，优选乙醇与水的浓度比是70%-100%: 0-30%。
10.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其中所述步骤(vi)中的干燥选自冷冻干燥、鼓风干燥、真空干燥或喷雾干燥。
11.通过前述权利要求中任一项的方法获得的泥鳅多糖。
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