CN113278088A - 一种具有显著肠粘膜修复活性的羊栖菜多糖及其制备方法与应用 - Google Patents

一种具有显著肠粘膜修复活性的羊栖菜多糖及其制备方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种具有显著肠粘膜修复活性的羊栖菜多糖及其制备方法与应用，属于羊栖菜深加工领域。该方法包括以下步骤：超微粉碎、脱色后的羊栖菜经热水浸提法提取得到羊栖菜粗多糖，加入一定比例的纯水和H2O2，置于紫外光下进行UV/H2O2降解，反应完成后经分级醇沉、透析纯化后得到羊栖菜多糖。本发明制备羊栖菜多糖的方法简单高效、经济环保，应用范围广。所得羊栖菜多糖分子量为10‑170kDa，总糖含量为62‑84wt％，蛋白质含量为0.2‑1.6wt％，糖醛酸含量为8‑20wt％，能够促进小肠隐窝上皮细胞的损伤愈合，具有显著肠粘膜修复活性，可用于羊栖菜功能食品的开发，对羊栖菜的精深加工有重要的意义。

Description

一种具有显著肠粘膜修复活性的羊栖菜多糖及其制备方法与 应用
技术领域
本发明属于羊栖菜深加工领域，具体涉及一种具有显著肠粘膜修复活性的羊栖菜多糖及其制备方法与应用。
背景技术
羊栖菜(Sargassum fusiforme)属于褐藻门马尾藻科，是一种广泛分布于我国东南沿海地区的药食两用藻类植物。羊栖菜富含对人体健康有益的膳食纤维、蛋白质、维生素和微量矿物质成分，具有较高的开发和利用价值。其中，多糖类物质因其具有多种生物活性而被研究得最多。研究发现羊栖菜多糖具有抗氧化、抗疲劳、抗肿瘤、抗衰老、降血糖、降血脂、调节肠道菌群等多种功效，但对于羊栖菜多糖在肠粘膜修复方面的研究与应用却鲜有报道。此外，羊栖菜多糖具有分子量大、水溶性差和不利于机体吸收的特点，所以对其进行降解有利于其进一步开发。
现有技术中，CN201910026070.7公开了一种增强羊栖菜多糖生物活性的方法，其主要于pH为4.5～7.0的缓冲溶液中、在由果胶酶和糖化酶组成的复合酶的作用下进行降解反应，该方法不但能显著提高羊栖菜多糖的抗氧化活性与胆酸结合能力，还能增强其对巨噬细胞的免疫调节活性，但是降解效果不理想，对多糖分子量的影响较小，且存在成本高、能耗大等缺点。CN201910051290.5公开了一种具有促进伤口愈合作用的羊栖菜多糖及其应用，该方法制备的羊栖菜多糖能够促进人角质形成细胞的增殖和迁移，具有加快再上皮化过程、促进皮肤创面愈合的作用，但是该多糖制备方法步骤繁琐、耗时长。
目前尚未见文献报道采用UV/H2O2结合分级醇沉制备羊栖菜多糖。
发明内容
为了克服现有技术存在的不足，本发明的目的是提供一种具有显著肠粘膜修复活性的羊栖菜多糖及其制备方法与应用。
本发明采用UV/H2O2结合分级醇沉制备羊栖菜多糖，该制备方法简单高效、经济环保，应用范围广，能提高羊栖菜的深加工技术，拓宽羊栖菜的应用范围，具有良好的应用前景。
本发明的目的至少通过如下技术方案之一实现。
一种具有显著肠粘膜修复活性的羊栖菜多糖，所述羊栖菜多糖的分子量为10-170kDa，总糖含量为62-84wt％，蛋白质含量为0.2-1.6wt％，糖醛酸含量为8-20wt％。
优选的，所述羊栖菜多糖的分子量为12-21kDa，总糖含量为75-84wt％，蛋白质含量为0.2-0.9wt％，糖醛酸含量为9-18wt％。
以上所述的一种具有显著肠粘膜修复活性的羊栖菜多糖的制备方法，包括以下步骤：
向羊栖菜粗多糖中加入水和H2O2，再置于紫外光下进行UV/H2O2降解，反应完成后经分级醇沉、透析纯化后得到羊栖菜多糖。
优选的，所述羊栖菜多糖的制备包括以下步骤：
(1)UV/H2O2降解：将所述羊栖菜粗多糖加入纯水中，得到羊栖菜粗多糖水溶液，然后加入H2O2，得到混合液1；将所述混合液1置于紫外光下进行辐射降解，得到混合液2；加入MnO2于所述混合液2中，得到混合液3，搅拌，待H2O2分解后，蒸发浓缩，得到浓缩液，离心取上清液；
(2)分级醇沉：将步骤(1)所述上清液与乙醇混合均匀，得到体系1，静置，离心，得到沉淀1和上清液1；将所述上清液1与乙醇混合均匀，得到体系2，静置，离心，得到沉淀2和上清液2；将所述上清液2与乙醇混合均匀，得到体系3，静置，离心，得到沉淀3和上清液3；
(3)透析纯化：将步骤(2)所述沉淀1、沉淀2和沉淀3分别加入纯水中复溶，使用透析袋进行透析纯化，收集大分子截留液，真空冷冻干燥，即得所述具有显著肠粘膜修复活性的羊栖菜多糖。
优选的，步骤(1)所述混合液1中H2O2的浓度为50-150mmol/L；所述辐射降解的时间为15-120min；所述混合液1与紫外灯的距离为10-25cm，辐照剂量为500-3600mJ/cm2；所述羊栖菜粗多糖与纯水的质量体积比为1g:100-500mL；所述浓缩液和混合液3的体积比为1:4-10。
优选的，步骤(1)中，辐照设备优选为天津合普公司的HOPE-MED 8140型皮肤光老化实验仪。
优选的，步骤(2)中，所述乙醇均为95％乙醇；所述体系1中乙醇的含量为15-30wt％；所述体系2中乙醇的含量为35-50wt％；所述体系3中乙醇的含量为60-80wt％；所述静置的温度为4-25℃，静置的时间为8-16h；所述离心的转速为6000-12000r/min，离心的时间为10-20min。
优选的，步骤(3)所述透析袋的截留分子量为500-5000kDa，透析纯化的时间为36-72h。
优选的，所述羊栖菜粗多糖的分子量为250-320kDa，总糖含量为50-78wt％，蛋白质含量为1.0-2.8wt％，糖醛酸含量为15-35wt％。
优选的，所述羊栖菜粗多糖的制备包括以下步骤：
(1)原料预处理：将洗净、烘干后的羊栖菜进行超微粉碎，过筛，加入95％乙醇中，升温进行回流反应，去除脂质及色素等小分子物质，离心取沉淀，烘干，得到羊栖菜粉末；
(2)羊栖菜粗多糖的提取：将步骤(1)所述羊栖菜粉末加入纯水中，得到羊栖菜水溶液；采用热水浸提法提取羊栖菜粗多糖，提取液抽滤去渣，取滤液进行蒸发浓缩，得到浓缩液；将所述浓缩液与95％乙醇混合均匀，静置，离心取沉淀，洗涤，待乙醇挥发后，加入纯水复溶，真空冷冻干燥，得到羊栖菜粗多糖；
步骤(1)所述过筛的筛孔大小为40-80目；所述回流反应的温度为80-100℃，回流反应的时间为2-6h；
步骤(2)所述羊栖菜粉末与纯水的质量体积比为1g:30-60mL，提取温度为75-100℃，提取时间为3-6h。
以上所述的一种具有显著肠粘膜修复活性的羊栖菜多糖在制备肠粘膜修复型药物或保健品中的应用。
与现有技术相比，本发明具有如下优点和有益效果：
(1)本发明采用UV/H2O2结合分级醇沉制备羊栖菜多糖，操作简便，条件温和，无污染，且能显著降低羊栖菜多糖的分子量、蛋白质和糖醛酸含量，提高多糖的总糖含量。
(2)本发明所制备的羊栖菜多糖能够促进小肠隐窝上皮细胞的损伤愈合，具有显著的肠粘膜修复活性。
附图说明
图1为本发明具有显著肠粘膜修复活性羊栖菜多糖的制备流程图。
图2为本发明实施例和对比例制备的羊栖菜多糖对IEC-6小肠隐窝上皮细胞损伤愈合的影响结果图。
具体实施方式
以下结合实例对本发明的具体实施作进一步说明，但本发明的实施和保护不限于此。需指出的是，以下若有未特别详细说明之过程，均是本领域技术人员可参照现有技术实现或理解的。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，视为可以通过市售购买得到的常规产品。
实施例1
一种羊栖菜多糖提取物，其制备方法如下：
(1)原料预处理：洗净、烘干后的羊栖菜进行超微粉碎，过40筛，加入95％乙醇中，升温进行回流反应，回流反应的温度为100℃，回流反应的次数为3次，共5h，去除脂质及色素等小分子物质，离心取沉淀，烘干，得到羊栖菜粉末；
(2)羊栖菜粗多糖的提取：将步骤(1)所述羊栖菜粉末按照质量体积比1:30g/mL加入纯水中，得到羊栖菜水溶液；采用热水浸提法提取羊栖菜粗多糖，提取温度为100℃，提取时间为3h，提取液抽滤去渣，取滤液进行蒸发浓缩，得到浓缩液，浓缩液与滤液的体积比为1:10；将所述浓缩液与95％乙醇混合均匀，浓缩液与95％乙醇的体积比为1:5，振荡混匀，置于4℃静置12h，离心取沉淀，所得沉淀经95％乙醇溶液洗涤后，于室温下放置，待乙醇挥发后，加入纯水复溶，经真空旋转蒸发仪浓缩后冻干，得到羊栖菜粗多糖；
(3)UV/H2O2降解：将步骤(2)所述羊栖菜粗多糖按照质量体积比1:200g/mL加入纯水中，得到羊栖菜粗多糖水溶液，然后加入H2O2使其终浓度为100mmol/L，得到混合液1；将所述混合液1置于紫外光(HOPE-MED 8140型皮肤光老化实验仪)下进行辐射降解15min，辐照剂量为508mJ/cm2，混合液1与紫外灯的距离为13cm，得到混合液2；按照质量体积比1:10mg/mL加入MnO2于所述混合液2中，得到混合液3，搅拌12h，待H2O2分解后，蒸发浓缩，得到浓缩液，浓缩液与混合液3的体积比为1:5，离心取上清液；
(4)分级醇沉：将步骤(3)所述上清液第一次与95％乙醇混合均匀，得到体系1，所述体系1中乙醇的含量为15wt％，置于4℃静置12h，12000r/min离心15min，得到沉淀1和上清液1；将所述上清液1第二次与95％乙醇混合均匀，得到体系2，所述体系2中乙醇的含量为45wt％，置于4℃静置12h，12000r/min离心15min，得到沉淀2和上清液2；将所述上清液2第三次与95％乙醇混合均匀，得到体系3，所述体系2中乙醇的含量为60wt％，置于4℃静置12h，12000r/min离心15min，得到沉淀3和上清液3；
(5)透析纯化：将步骤(4)所述沉淀1、2和3分别加入纯水中复溶，使用截留分子量为3000kDa的透析袋透析纯化48h，收集大分子截留液，真空冷冻干燥，即得所述具有显著肠粘膜修复活性羊栖菜多糖(标记为羊栖菜多糖A1、A2和A3)，具体流程见图1。
实施例2
一种羊栖菜多糖提取物，其制备方法如下：
(1)原料预处理：洗净、烘干后的羊栖菜进行超微粉碎，过60筛，加入95％乙醇中，升温进行回流反应，回流反应的温度为90℃，回流反应的次数为3次，共6h，去除脂质及色素等小分子物质，离心取沉淀，烘干，得到羊栖菜粉末；
(2)羊栖菜粗多糖的提取：将步骤(1)所述羊栖菜粉末按照质量体积比1:50g/mL加入纯水中，得到羊栖菜水溶液；采用热水浸提法提取羊栖菜粗多糖，提取温度为100℃，提取时间为4h，提取液抽滤去渣，取滤液进行蒸发浓缩，得到浓缩液，浓缩液与滤液的体积比为1:10；将所述浓缩液与95％乙醇混合均匀，浓缩液与95％乙醇的体积比为1:5，振荡混匀，置于4℃静置12h，离心取沉淀，所得沉淀经95％乙醇溶液洗涤后，于室温下放置，待乙醇挥发后，加入纯水复溶，经真空旋转蒸发仪浓缩后冻干，得到羊栖菜粗多糖；
(3)UV/H2O2降解：将步骤(2)所述羊栖菜粗多糖按照质量体积比1:500g/mL加入纯水中，得到羊栖菜粗多糖水溶液，然后加入H2O2使其终浓度为150mmol/L，得到混合液1；将所述混合液1置于紫外光(HOPE-MED 8140型皮肤光老化实验仪)下进行辐射降解120min，辐照剂量为3515mJ/cm2，混合液1与紫外灯的距离为15cm，得到混合液2；按照质量体积比1:10mg/mL加入MnO2于所述混合液2中，得到混合液3，搅拌12h，待H2O2分解后，蒸发浓缩，得到浓缩液，浓缩液与混合液3的体积比为1:6，离心取上清液；
(4)分级醇沉：将步骤(3)所述上清液第一次与95％乙醇混合均匀，得到体系1，所述体系1中乙醇的含量为25wt％，置于4℃静置12h，12000r/min离心15min，得到沉淀1和上清液1；将所述上清液1第二次与95％乙醇混合均匀，得到体系2，所述体系2中乙醇的含量为45wt％，置于4℃静置12h，12000r/min离心15min，得到沉淀2和上清液2；将所述上清液2第三次与95％乙醇混合均匀，得到体系3，所述体系2中乙醇的含量为70wt％，置于4℃静置12h，12000r/min离心15min，得到沉淀3和上清液3；
(5)透析纯化：将步骤(4)所述沉淀1、2和3分别加入纯水中复溶，使用截留分子量为3000kDa的透析袋透析纯化48h，收集大分子截留液，真空冷冻干燥，即得所述具有显著肠粘膜修复活性羊栖菜多糖(标记为羊栖菜多糖B1、B2和B3)。
实施例3
一种羊栖菜多糖提取物，其制备方法如下：
(1)原料预处理：洗净、烘干后的羊栖菜进行超微粉碎，过60筛，加入95％乙醇中，升温进行回流反应，回流反应的温度为100℃，回流反应的次数为3次，共3h，去除脂质及色素等小分子物质，离心取沉淀，烘干，得到羊栖菜粉末；
(2)羊栖菜粗多糖的提取：将步骤(1)所述羊栖菜粉末按照质量体积比1:60g/mL加入纯水中，得到羊栖菜水溶液；采用热水浸提法提取羊栖菜粗多糖，提取温度为90℃，提取时间为6h，提取液抽滤去渣，取滤液进行蒸发浓缩，得到浓缩液，浓缩液与滤液的体积比为1:10；将所述浓缩液与95％乙醇混合均匀，浓缩液与95％乙醇的体积比为1:5，振荡混匀，置于4℃静置12h，离心取沉淀，所得沉淀经95％乙醇溶液洗涤后，于室温下放置，待乙醇挥发后，加入纯水复溶，经真空旋转蒸发仪浓缩后冻干，得到羊栖菜粗多糖；
(3)UV/H2O2降解：将步骤(2)所述羊栖菜粗多糖按照质量体积比1:400g/mL加入纯水中，得到羊栖菜粗多糖水溶液，然后加入H2O2使其终浓度为100mmol/L，得到混合液1；将所述混合液1置于紫外光(HOPE-MED 8140型皮肤光老化实验仪)下进行辐射降解90min，辐照剂量为2460mJ/cm2，混合液1与紫外灯的距离为15cm，得到混合液2；按照质量体积比1:10mg/mL加入MnO2于所述混合液2中，得到混合液3，搅拌12h，待H2O2分解后，蒸发浓缩，得到浓缩液，浓缩液与混合液3的体积比为1:4，离心取上清液；
(4)分级醇沉：将步骤(3)所述上清液第一次与95％乙醇混合均匀，得到体系1，所述体系1中乙醇的含量为15wt％，置于4℃静置12h，12000r/min离心15min，得到沉淀1和上清液1；将所述上清液1第二次与95％乙醇混合均匀，得到体系2，所述体系2中乙醇的含量为50wt％，置于4℃静置12h，12000r/min离心15min，得到沉淀2和上清液2；将所述上清液2第三次与95％乙醇混合均匀，得到体系3，所述体系2中乙醇的含量为80wt％，置于4℃静置12h，12000r/min离心15min，得到沉淀3和上清液3；
(5)透析纯化：将步骤(4)所述沉淀1、2和3分别加入纯水中复溶，使用截留分子量为3000kDa的透析袋透析纯化48h，收集大分子截留液，真空冷冻干燥，即得所述具有显著肠粘膜修复活性羊栖菜多糖(标记为羊栖菜多糖C1、C2和C3)。
对比例1
(1)原料预处理：洗净、烘干后的羊栖菜进行超微粉碎，过40筛，加入95％乙醇中，升温进行回流反应，回流反应的温度为100℃，回流反应的次数为3次，共5h，去除脂质及色素等小分子物质，离心取沉淀，烘干，得到羊栖菜粉末；
(2)羊栖菜粗多糖的提取：将步骤(1)所述羊栖菜粉末按照质量体积比1:30g/mL加入纯水中，得到羊栖菜水溶液；采用热水浸提法提取羊栖菜粗多糖，提取温度为100℃，提取时间为3h，提取液抽滤去渣，取滤液进行蒸发浓缩，得到浓缩液，浓缩液与滤液的体积比为1:10；将所述浓缩液与95％乙醇混合均匀，浓缩液与95％乙醇的体积比为1:5，振荡混匀，置于4℃静置12h，离心取沉淀，所得沉淀经95％乙醇溶液洗涤后，于室温下放置，待乙醇挥发后，加入纯水复溶，得到羊栖菜粗多糖水溶液；
(3)透析纯化：将步骤(2)所述羊栖菜粗多糖水溶液用截留分子量为3000kDa的透析袋透析纯化48h，收集大分子截留液，真空冷冻干燥，即得所述羊栖菜多糖提取物(标记为羊栖菜多糖D)。
对比例2
(1)原料预处理：洗净、烘干后的羊栖菜进行超微粉碎，过40筛，加入95％乙醇中，升温进行回流反应，回流反应的温度为100℃，回流反应的次数为3次，共5h，去除脂质及色素等小分子物质，离心取沉淀，烘干，得到羊栖菜粉末；
(2)羊栖菜粗多糖的提取：将步骤(1)所述羊栖菜粉末按照质量体积比1:30g/mL加入纯水中，得到羊栖菜水溶液；采用热水浸提法提取羊栖菜粗多糖，提取温度为100℃，提取时间为3h，提取液抽滤去渣，取滤液进行蒸发浓缩，得到浓缩液，浓缩液与滤液的体积比为1:10；将所述浓缩液与95％乙醇混合均匀，浓缩液与95％乙醇的体积比为1:5，振荡混匀，置于4℃静置12h，离心取沉淀，所得沉淀经95％乙醇溶液洗涤后，于室温下放置，待乙醇挥发后，加入纯水复溶，经真空旋转蒸发仪浓缩后冻干，得到羊栖菜粗多糖；
(3)UV/H2O2降解：将步骤(2)所述羊栖菜粗多糖按照质量体积比1:200g/mL加入纯水中，得到羊栖菜粗多糖水溶液，然后加入H2O2使其终浓度为100mmol/L，得到混合液1；将所述混合液1置于紫外光(HOPE-MED 8140型皮肤光老化实验仪)下进行辐射降解90min，辐照剂量为2460mJ/cm2，混合液1与紫外灯的距离为15cm，得到混合液2；按照质量体积比1:10mg/mL加入MnO2于所述混合液2中，得到混合液3，搅拌12h，待H2O2分解后，蒸发浓缩，得到浓缩液，浓缩液与混合液3的体积比为1:5，离心取上清液；
(4)透析纯化：将步骤(3)所述上清液用截留分子量为3000kDa的透析袋透析纯化48h，收集大分子截留液，真空冷冻干燥，即得所述羊栖菜多糖提取物(标记为羊栖菜多糖E)。
对比例3
(1)原料预处理：洗净、烘干后的羊栖菜进行超微粉碎，过40筛，加入95％乙醇中，升温进行回流反应，回流反应的温度为100℃，回流反应的次数为3次，共5h，去除脂质及色素等小分子物质，离心取沉淀，烘干，得到羊栖菜粉末；
(2)羊栖菜粗多糖的提取：将步骤(1)所述羊栖菜粉末按照质量体积比1:30g/mL加入纯水中，得到羊栖菜水溶液；采用热水浸提法提取羊栖菜粗多糖，提取温度为100℃，提取时间为3h，提取液抽滤去渣，取滤液进行蒸发浓缩，得到浓缩液，浓缩液与滤液的体积比为1:10；将所述浓缩液与95％乙醇混合均匀，浓缩液与95％乙醇的体积比为1:5，振荡混匀，置于4℃静置12h，离心取沉淀，所得沉淀经95％乙醇溶液洗涤后，于室温下放置，待乙醇挥发后，加入纯水复溶，经真空旋转蒸发仪浓缩后冻干，得到羊栖菜粗多糖；
(3)分级醇沉：将步骤(2)所述羊栖菜粗多糖按照质量体积比1:200g/mL加入纯水中，得到羊栖菜粗多糖水溶液；将所述羊栖菜粗多糖水溶液第一次与95％乙醇混合均匀，得到体系1，所述体系1中乙醇的含量为15wt％，置于4℃静置12h，12000r/min离心15min，得到沉淀1和上清液1；将所述上清液1第二次与95％乙醇混合均匀，得到体系2，所述体系2中乙醇的含量为45wt％，置于4℃静置12h，12000r/min离心15min，得到沉淀2和上清液2；将所述上清液2第三次与95％乙醇混合均匀，得到体系3，所述体系2中乙醇的含量为60wt％，置于4℃静置12h，12000r/min离心15min，得到沉淀3和上清液3；
(4)透析纯化：将步骤(3)所述沉淀1、2和3分别加入纯水中复溶，使用截留分子量为3000kDa的透析袋透析纯化48h，收集大分子截留液，真空冷冻干燥，即得所述羊栖菜多糖提取物(标记为羊栖菜多糖F1、F2和F3)。
效果验证
本发明选择实施例1、2和3方法制得的羊栖菜多糖A1、A2、A3、B1、B2、B3、C1、C2和C3对比了对比例1(无处理)制得的羊栖菜多糖D的分子量和化学组成(总糖、蛋白质和糖醛酸含量)。此外，为了进一步评价UV/H2O2结合分级醇沉处理的增强作用，本实施例对比了对比例2(单独UV/H2O2处理)和对比例3(单独分级醇沉处理)方法制得的羊栖菜多糖E、F1、F2和F3的分子量和化学组成。
多糖分子量采用凝胶渗透色谱法(GPC)进行测定，具体实验步骤如下：称取4mg羊栖菜多糖充分溶解于0.02mol/L的KH2PO4溶液中，用0.22μm无菌水相滤膜过膜，滤液备用。色谱条件：色谱柱：TSK G-5000PWXL(7.8×300mm)和TSK G-3000PWXL(7.8×300mm)串联使用，柱温为35℃；检测器：Waters 2414示差折光检测器；流动相为0.02mol/L的KH2PO4缓冲液，流速为0.5mL/min，进样量为25μL。以不同分子量的葡聚糖(4.32、12.6、126和289kDa)绘制标准曲线。多糖样品的平均分子量根据其洗脱体积对照标准曲线计算得到。
多糖总糖含量采用苯酚-硫酸法进行测定，具体实验步骤如下：以岩藻糖为标准品，取0.1mg/mL的岩藻糖标准溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL，以去离子水补足至1mL，依次加入5％(w/v)苯酚溶液1mL和浓硫酸5mL，摇匀，反应20min，于490nm处测定反应液的吸光值。以去离子水作为空白，平行测定3次，取平均值。以岩藻糖浓度为横坐标、吸光值为纵坐标绘制标准曲线。准确吸取0.1mg/mL的羊栖菜多糖溶液1mL，按照上述方法进行显色反应后测定反应液的吸光值，将其代入上述标准曲线，计算多糖样品的总糖含量。
多糖蛋白质含量采用考马斯亮蓝法进行测定，具体实验步骤如下：以牛血清蛋白为标准品，取0.1mg/mL牛血清蛋白标准溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL，以去离子水补足至1mL，加入考马斯亮蓝溶液5mL，摇匀后静置5min，于595nm处测定反应液的吸光值。以去离子水作为空白，平行测定3次，取平均值。以牛血清蛋白浓度为横坐标、吸光值为纵坐标绘制标准曲线。准确吸取1mg/mL的羊栖菜多糖溶液1mL，按照上述方法进行显色反应后测定反应液的吸光值，将其代入上述标准曲线，计算多糖样品的蛋白质含量。
多糖糖醛酸含量采用硫酸-咔唑法进行测定，具体实验步骤如下：以半乳糖醛酸为标准品，取0.1mg/mL半乳糖醛酸标准液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL，以去离子水补足至1mL，混匀后于冰水浴中预冷，然后加入0.0125mol/L四硼酸钠-硫酸溶液5mL，混匀后沸水浴20min，取出后立即冷水浴至室温，加入0.15％(w/v)咔唑溶液0.2mL，混匀后静置2h，于523nm处测定反应液的吸光值。以去离子水作空白，平行测定3次，取平均值。以葡萄糖醛酸浓度为横坐标、吸光值为纵坐标绘制标准曲线。准确吸取0.5mg/mL的羊栖菜多糖溶液1mL，按照上述方法进行显色反应后测定反应液的吸光值，将其代入上述标准曲线，计算多糖样品的糖醛酸含量。
如表1所示，UV/H2O2结合分级醇沉处理可显著降低羊栖菜多糖的分子量、蛋白质和糖醛酸含量，提高多糖的总糖含量。
表1 UV/H2O2结合分级醇沉处理对羊栖菜多糖分子量和化学组成的影响
Figure BDA0003087726860000131
Figure BDA0003087726860000141
本发明对经UV/H2O2结合分级醇沉制备的羊栖菜多糖A1、A2、A3、B1、B2、B3、C1、C2和C3检测其肠粘膜修复活性，进一步比较了根据对比例1(无处理)、对比例2(单独UV/H2O2处理)和对比例3(单独分级醇沉)方法制得的羊栖菜多糖D、E、F1、F2和F3对IEC-6小肠隐窝上皮细胞损伤愈合的影响，具体实验步骤如下：
IEC-6细胞以1×105个/孔接种于12孔细胞培养板中，随后置于37℃，含有5％CO2的恒温培养箱中进行培养。待细胞融合度达到90％后，吸弃培养基，用200μL灭菌枪头，垂直于细胞平面划线进行划痕，随后用PBS清洗掉落的细胞；对照组加入培养基，实验组加入含有不同羊栖菜多糖的培养基，分别在0、6、18h时用显微镜进行拍照，利用Image J软件计算划痕面积来分析愈合效果。
如图2所示，经UV/H2O2结合分级醇沉制备的羊栖菜多糖对小肠隐窝上皮细胞的损伤愈合有更强的促进作用，表明其具有更好的肠粘膜修复活性。
以上实施例仅为本发明较优的实施方式，仅用于解释本发明，而非限制本发明，本领域技术人员在未脱离本发明精神实质下所作的改变、替换、修饰等均应属于本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种具有显著肠粘膜修复活性的羊栖菜多糖，其特征在于，所述羊栖菜多糖的分子量为10-170kDa，总糖含量为62-84wt％，蛋白质含量为0.2-1.6wt％，糖醛酸含量为8-20wt％。
2.根据权利要求1所述的一种具有显著肠粘膜修复活性的羊栖菜多糖，其特征在于，所述羊栖菜多糖的分子量为12-21kDa，总糖含量为75-84wt％，蛋白质含量为0.2-0.9wt％，糖醛酸含量为9-18wt％。
3.制备权利要求1或2所述的一种具有显著肠粘膜修复活性的羊栖菜多糖的方法，其特征在于，包括以下步骤：
向羊栖菜粗多糖中加入水和H2O2，再置于紫外光下进行UV/H2O2降解，反应完成后经分级醇沉、透析纯化后得到羊栖菜多糖。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述羊栖菜多糖的制备包括以下步骤：
(1)UV/H2O2降解：将所述羊栖菜粗多糖加入纯水中，得到羊栖菜粗多糖水溶液，然后加入H2O2，得到混合液1；将所述混合液1置于紫外光下进行辐射降解，得到混合液2；加入MnO2于所述混合液2中，得到混合液3，搅拌，待H2O2分解后，蒸发浓缩，得到浓缩液，离心取上清液；
(2)分级醇沉：将步骤(1)所述上清液与乙醇混合均匀，得到体系1，静置，离心，得到沉淀1和上清液1；将所述上清液1与乙醇混合均匀，得到体系2，静置，离心，得到沉淀2和上清液2；将所述上清液2与乙醇混合均匀，得到体系3，静置，离心，得到沉淀3和上清液3；
(3)透析纯化：将步骤(2)所述沉淀1、沉淀2和沉淀3分别加入纯水中复溶，使用透析袋进行透析纯化，收集大分子截留液，真空冷冻干燥，即得所述具有显著肠粘膜修复活性的羊栖菜多糖。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)所述混合液1中H2O2的浓度为50-150mmol/L；所述辐射降解的时间为15-120min；所述混合液1与紫外灯的距离为10-25cm，辐照剂量为500-3600mJ/cm2；所述羊栖菜粗多糖与纯水的质量体积比为1g:100-500mL；所述浓缩液和混合液3的体积比为1:4-10。
6.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，所述乙醇均为95％乙醇；所述体系1中乙醇的含量为15-30wt％；所述体系2中乙醇的含量为35-50wt％；所述体系3中乙醇的含量为60-80wt％；所述静置的温度为4-25℃，静置的时间为8-16h；所述离心的转速为6000-12000r/min，离心的时间为10-20min。
7.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)所述透析袋的截留分子量为500-5000kDa，透析纯化的时间为36-72h。
8.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述羊栖菜粗多糖的分子量为250-320kDa，总糖含量为50-78wt％，蛋白质含量为1.0-2.8wt％，糖醛酸含量为15-35wt％。
9.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于，所述羊栖菜粗多糖的制备包括以下步骤：
(1)原料预处理：将洗净、烘干后的羊栖菜进行超微粉碎，过筛，加入95％乙醇中，升温进行回流反应，去除脂质及色素等小分子物质，离心取沉淀，烘干，得到羊栖菜粉末；
(2)羊栖菜粗多糖的提取：将步骤(1)所述羊栖菜粉末加入纯水中，得到羊栖菜水溶液；采用热水浸提法提取羊栖菜粗多糖，提取液抽滤去渣，取滤液进行蒸发浓缩，得到浓缩液；将所述浓缩液与95％乙醇混合均匀，静置，离心取沉淀，洗涤，待乙醇挥发后，加入纯水复溶，真空冷冻干燥，得到羊栖菜粗多糖；
步骤(1)所述过筛的筛孔大小为40-80目；所述回流反应的温度为80-100℃，回流反应的时间为2-6h；
步骤(2)所述羊栖菜粉末与纯水的质量体积比为1g:30-60mL，提取温度为75-100℃，提取时间为3-6h。
10.权利要求1或2所述的一种具有显著肠粘膜修复活性的羊栖菜多糖在制备肠粘膜修复型药物或保健品中的应用。
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