CN110376320A - 一种全自动串联固相萃取植物中油菜素甾醇的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种采用全自动串联固相萃取方法用于植物中油菜素甾醇的分析前处理。该方法采用全自动在线固相萃取装置，串联两个固相萃取柱，对植物样品提取液进行在线净化、提纯，并与色谱进样在线联用，解决了传统离线样品前处理过程中样品损失较大的难题。两种固相萃取柱的在线串联使用，可以提高净化效率，减小色谱分析的基质效应，提高分析选择性。同时，两个固相萃取柱在使用后可以在线再生，重复使用多次，降低了分析成本，节省了分析时间。方法还集成了在线衍生功能，有利于提高检测灵敏度。

Description

一种全自动串联固相萃取植物中油菜素甾醇的方法

技术领域

本发明属于分析化学领域，具体地涉及一种植物样品的前处理方法，该方法适用于分析植物样品中油菜素甾醇类化合物时的样品前处理。

背景技术

植物中痕量植物激素的定量检测一直是植物学研究的一个分析难题。其中，油菜素甾醇因其高活性而备受关注。由于植物样品基质复杂，油菜素甾醇的含量极低(一般叶芽和叶片中含量仅约0.01～0.1ng/g鲜重)，因此需要高效的样品前处理手段去除大量杂质、富集油菜素甾醇。现有技术常采用液相萃取、固相萃取(solid phase extraction，SPE)、基质固相分散(matrix solid phase dispersion，MSPD)等方法的组合来处理植物样品。这些方法通常都是离线手工操作，最终获得的提取液或洗脱液需经过氮吹浓缩后复溶，才能进入色谱仪进行分离检测。多步离线操作尤其是手工操作必然带来样品损失，对于痕量组分的检测来说是非常不利的。

近几年出现的全自动在线固相萃取仪能在线进行固相萃取，洗脱液全部进入色谱柱，避免了氮吹复溶操作。这一技术不仅实现了固相萃取过程，包括活化、上样、淋洗、洗脱的全自动化，同时实现了固相萃取-色谱分离的在线联用。但目前全自动在线固相萃取方法在一次样品处理过程中仅能使用一个固相萃取柱。而对于复杂的植物基质来说，仅靠一个固相萃取柱很难获得很好的除杂效果，这将导致色谱分析油菜素甾醇时基质效应严重，灵敏低。

发明内容

本发明的目的是提供一种全自动植物样品前处理方法，利用全自动在线固相萃取装置进行串联固相萃取，对复杂植物样品中的油菜素甾醇进行纯化、富集，提高后续色谱分析的选择性和灵敏度，解决传统离线样品前处理过程中样品损失较大的难题。

为了解决上述技术难题，本发明采用的技术方案如下：

一种全自动串联固相萃取植物中油菜素甾醇的方法：采用全自动在线固相萃取装置进行固相萃取，所述全自动在线固相萃取装置具有双组压头，分别夹紧固相萃取柱A和固相萃取柱B；每组压头共两个，分别压紧固相萃取柱的两个端面；所述固相萃取柱A填充的固体吸附剂为C8或C18键合硅胶颗粒；所述固相萃取柱B填充的固体吸附剂为混合型阳离子交换吸附剂与混合型阴离子交换吸附剂的等质量组合；固相萃取柱A和固相萃取柱B为圆柱体，沿柱体中心轴开设有一个贯穿上下两端的圆形通孔，通孔内填充固体吸附剂；柱体上下两端设有与柱体紧密结合的筛板将填料封装在通孔内；所述固相萃取柱A和固相萃取柱B的两端面与全自动在线固相萃取装置的压头尺寸相匹配；所述全自动在线固相萃取装置内有一个两位八通阀和一个六通阀或四通阀，所述六通阀或四通阀位于八通阀与色谱柱之间，六通阀或四通阀的①号位与八通阀的⑦号位相连；六通阀或四通阀的②号位与色谱柱相连，六通阀或四通阀的③号位为流动相入口；六通阀的④号位和⑤号位为空；六通阀的⑥号位或四通阀的④号位连接废液瓶；所述八通阀的①号位与固相萃取柱A的上压头相连，固相萃取柱A的下压头与八通阀的⑤号位相连；八通阀的④号位与固相萃取柱B的上压头相连，固相萃取柱B的下压头与八通阀的⑥号位相连；八通阀的③号位为再生液入口，②号位与废液瓶相连，⑧号位为液体入口。所述在线固相萃取的具体步骤包括：

a)活化：固相萃取前，八通阀的⑧号位与①号位相通，六通阀或四通阀的②号位与③号位相通；活化液从八通阀的⑧号位进入，依次流经固相萃取柱A和固相萃取柱B对其进行活化。此时流动相经六通阀直接进行色谱柱。

b)上样：八通阀和六通阀的阀位与步骤a相同；用液相色谱自动进样器定量吸取含油菜素甾醇的植物样品提取液，在上样溶液推动下，使植物样品提取液经八通阀⑧号位进入，加载到固相萃取柱A的柱头，油菜素甾醇被保留在固相萃取柱A上；所述上样溶液与植物提取液的溶剂条件相同；提取液全部进入固相萃取柱A后停止上样。

c)洗脱衍生：八通阀的阀位与步骤a相同，六通阀或四通阀的①号位与②号位相通，驱动洗脱溶剂从八通阀的⑧号位进入，依次流经固相萃取柱A和固相萃取柱B，将油菜素甾醇洗脱下来；所述洗脱溶剂为含有衍生试剂的流动相，洗脱过程中进行衍生，洗脱液直接进入色谱柱；。

d)分离再生：进样完成后，切换八通阀和六通阀或四通阀，此时八通阀的③号位与④号位相通；再生液从③号位进入，依次流经固相萃取柱B和固相萃取柱A，对其进行再生；此时六通阀或四通阀的①号位与②号位相通，色谱流动相直接进入色谱柱进行分离分析。

若衍生反应较慢，可以在六通阀的②号位与⑤号位之间连接一个衍生反应管，用于在线衍生油菜素甾醇。此时，六通阀的③号位为流动相入口，④号位连接色谱柱。所述步骤a、b和c中六通阀的④号位与③号位相通；所述步骤c中，驱动衍生液从八通阀的⑧号位进入，依次流经固相萃取柱A和固相萃取柱B，将固相萃取柱A上保留的油菜素甾醇洗脱下来并带入衍生反应管停流一段时间进行衍生；所述衍生液为含衍生试剂和5％～10％(v/v)吡啶的乙腈溶液；待衍生反应结束后，执行步骤d，切换八通阀和六通阀，此时六通阀的③号位与②号位相通，色谱流动相将衍生反应管内的衍生产物推送至色谱柱进行分离分析。

所述衍生试剂为氨基苯硼酸，浓度为0.5～2.0mg/L。所述流动相为体积浓度为60％～100％的乙腈-水溶液。所述植物样品提取液所采用的提取溶剂为乙腈、甲醇、80％(v/v)乙腈-水溶液、80％(v/v)甲醇-水溶液中的任一种。所述植物样品为含有油菜素甾醇的植物样品，例如拟南芥、水稻、油菜等植物中的一种或二种以上的种子、幼芽、叶片、根、茎、花等中的一种或二种以上。

所述活化液和再生液为乙腈或甲醇中的任一种。

所述衍生反应管外部设有加热装置，发生衍生反应时，衍生反应管的温度为65℃～75℃；所述步骤c中液体在衍生反应管内停流的时间为20s～60s。

所述衍生试剂可以为萘基苯硼酸、菲硼酸、蒽硼酸、萘基蒽硼酸中的任一种；衍生试剂的浓度为0.5～2.0mg/L。

所述固相萃取柱A和固相萃取柱B的通孔直径为1mm～3mm，内部填充的固体吸附剂的体积为6.3μL～70μL，填充体积为通孔容积的80％～100％。

所述活化液的流速为0.5mL/min～1mL/min；上样溶液的流速为0.1mL/min～1.0mL/min；洗脱溶剂和衍生液的流速为0.5mL/min～1.5mL/min；再生液的流速为0.5mL/min～1.5mL/min。

所述衍生反应管为石英盘管，内容积为100微升～300微升。

本发明的技术方案与现有技术的区别主要在于：

(1)现有技术采用传统固相萃取、基质固相分散等方法对植物样品进行除杂净化，大部分操作都是离线手工操作。由于获得的洗脱液的体积(通常几百微升至几毫升)比色谱进样体积(通常几十微升)大很多，通常需要氮吹浓缩并用小体积溶剂进行复溶，才能进入色谱柱进行分离分析。这一过程不可避免造成一定的样品损失。本发明的技术方案完全避免了氮吹过程，由于采用的固相萃取柱内填料体积仅为6.3μL～70μL，洗脱体积仅10～20μL，洗脱液能全部直接转移至色谱柱进行分离分析，极大极高了样品利用率，实现了固相萃取-色谱分离的在线联用。

(2)与现有全自动在线固相萃取方法相比，本发明的技术方案实现了两个固相萃取柱的串联使用。固相萃取柱A填充的C8或C18键合硅胶颗粒主要用于去除非极性杂质，固相萃取柱B填充的混合型阳离子交换吸附剂与混合型阴离子交换吸附剂组合可以有效地去除可电离或强极性杂质。两种固相萃取柱的在线串联使用，可以获得更干净的洗脱液，减小色谱分析的基质效应，提高分析选择性。同时，两个固相萃取柱在使用后可以在线再生，重复使用多次，降低了分析成本，节省了分析时间。

本发明技术方案的优点：

(1)本发明的样品前处理方法将串联固相萃取全自动化，实现固相萃取与色谱分析的在线联用，避免了离线人工操作带来的误差和样品损失，省时省力，提高了样品处理的通量和速度。

(2)通过串联固相萃取，实现对复杂植物基质的高效除杂，提高了萃取选择性。

(3)该方法可以与在线衍生相结合，根据衍生反应速度，可以边洗脱边衍生，也可以洗脱后衍生。通过荧光基团衍生，可以采用高灵敏的荧光检测器对衍生产物进行荧光检测，对于非荧光基团衍生，也可以采用质谱检测器进行检测，进一步提高油菜素甾醇的检测灵敏度。

(4)该方法将净化、富集、衍生、进样过程全自动化控制，有利于提高样品前处理的重复性。

附图说明

图1为实施例1所述全自动在线串联固相萃取方法示意图。

图2为实施例2所述全自动在线串联固相萃取方法示意图。

图3为实施例3所述全自动在线串联固相萃取方法示意图。

其中，A为固相萃取柱A；B为固相萃取柱B；C为色谱柱；D为衍生反应管；W为废液瓶。

具体实施方式

实施方式1：

采用全自动在线固相萃取装置进行固相萃取，全自动在线固相萃取装置具有双组压头，分别夹紧固相萃取柱A和固相萃取柱B。固相萃取柱A和固相萃取柱B为圆柱体，沿柱体中心轴开设有一个贯穿上下两端的圆形通孔，通孔直径为1mm～3mm，通孔内填充固体吸附剂；柱体上下两端设有与柱体紧密结合的筛板将填料封装在通孔内；所述固相萃取柱A和固相萃取柱B的两端面与全自动在线固相萃取装置的压头尺寸相匹配。固相萃取柱A填充C8或C18键合硅胶颗粒；固相萃取柱B填充混合型阳离子交换吸附剂与混合型阴离子交换吸附剂，两者等质量组合，总体积6.3μL～70μL，占通孔容积的80％～100％。全自动在线固相萃取装置内有一个两位八通阀和一个六通阀或四通阀，所述六通阀或四通阀位于八通阀与色谱柱之间，六通阀或四通阀的①号位与八通阀的⑦号位相连；六通阀或四通阀的②号位与色谱柱相连，六通阀或四通阀的③号位为流动相入口；六通阀的④号位和⑤号位为空；六通阀的⑥号位或四通阀的④号位连接废液瓶；所述八通阀的①号位与固相萃取柱A的上压头相连，固相萃取柱A的下压头与八通阀的⑤号位相连；八通阀的④号位与固相萃取柱B的上压头相连，固相萃取柱B的下压头与八通阀的⑥号位相连；八通阀的③号位为再生液入口，②号位与废液瓶相连，⑧号位为液体入口。在线固相萃取的具体步骤如下：

a)活化：固相萃取前，八通阀的⑧号位与①号位相通，六通阀或四通阀的②号位与③号位相通；活化液从八通阀的⑧号位进入，依次流经固相萃取柱A和固相萃取柱B对其进行活化；活化液的流速为0.5mL/min～1mL/min；所述活化液为乙腈或甲醇中的任一种。

b)上样：八通阀和六通阀的阀位与步骤a相同；植物样品先经提取液提取其中的油菜素甾醇，所述提取液为乙腈、甲醇、80％(v/v)乙腈-水溶液、80％(v/v)甲醇-水溶液中的任一种。然后用液相色谱自动进样器定量吸取含油菜素甾醇的植物样品提取液，在上样溶液推动下，使植物样品提取液经八通阀⑧号位进入，加载到固相萃取柱A的柱头，油菜素甾醇被保留在固相萃取柱A上；上样溶液与植物提取液的溶剂条件相同；上样溶液流速为0.1mL/min～1.0mL/min；提取液全部进入固相萃取柱A后停止上样。

c)洗脱衍生：八通阀的阀位与步骤a相同，六通阀或四通阀的①号位与②号位相通。驱动洗脱溶剂以0.5mL/min～1.5mL/min的流速从八通阀的⑧号位进入，依次流经固相萃取柱A和固相萃取柱B，将油菜素甾醇洗脱下来；所述洗脱溶剂为含有氨基苯硼酸的流动相，边洗脱边衍生，洗脱液直接进入色谱柱；所述流动相为体积浓度为60％～100％的乙腈-水溶液。

d)分离再生：进样完成后，切换八通阀和六通阀或四通阀，此时八通阀的③号位与④号位相通；驱动再生液以0.5mL/min～1.5mL/min的流速从③号位进入，依次流经固相萃取柱B和固相萃取柱A，对其进行再生；此时六通阀或四通阀①号位与②号位相通，色谱流动相直接进入色谱柱进行分离分析。再生液为乙腈或甲醇中的任一种。

实施方式2：

与实施方式1的区别在于：所述六通阀的②号位与⑤号位之间连接有一个衍生反应管，用于在线衍生油菜素甾醇。所述衍生反应管为石英盘管，内容积为100微升～300微升。六通阀的③号位为流动相入口，④号位连接色谱柱。此时，所述步骤a、b和c中六通阀的④号位与③号位相通；所述步骤c中，驱动衍生液以0.5mL/min～1.5mL/min的流速从八通阀的⑧号位进入，依次流经固相萃取柱A和固相萃取柱B，将油菜素甾醇洗脱下来并带入衍生反应管停流20s～60s进行衍生；所述衍生液为含衍生试剂和5％～10％(v/v)吡啶的乙腈溶液；待衍生反应结束后，执行步骤d，切换八通阀和六通阀，此时六通阀的③号位与②号位相通，色谱流动相将衍生反应管内的衍生产物推送至色谱柱进行分离分析。所述衍生反应管外部可以设有加热装置，发生衍生反应时，衍生反应管的温度为65℃～75℃；所述衍生试剂为萘基苯硼酸、菲硼酸、蒽硼酸、萘基蒽硼酸中的任一种；衍生试剂的浓度为0.5～2.0mg/L。

下面结合具体实施例来说明本发明，在此本发明的示意性实施例以及说明用来解释本发明，但并不作为对本发明的限定。

实施例1

采用全自动在线固相萃取装置对水稻样品提取液进行固相萃取，全自动在线固相萃取装置具有双组压头，分别夹紧固相萃取柱A和固相萃取柱B。固相萃取柱A和固相萃取柱B为圆柱体，沿柱体中心轴开设有一个贯穿上下两端的圆形通孔，通孔直径为2.5mm，通孔内填充固体吸附剂；柱体上下两端设有与柱体紧密结合的密封筛板将填料密封在通孔内；所述固相萃取柱A和固相萃取柱B的外径与全自动在线固相萃取装置的压头尺寸相匹配。固相萃取柱A填充40μL C18键合硅胶颗粒；固相萃取柱B填充20μL MAX-MCX混合吸附剂，其中MAX和MCX按质量比1:1预先混合均匀，吸附剂填充体积占通孔容积的95％。全自动在线固相萃取装置内有一个两位八通阀和一个六通阀，所述六通阀位于八通阀与色谱柱之间，六通阀的①号位与八通阀的⑦号位相连；六通阀的②号位与色谱柱相连，③号位为流动相入口；④号位和⑤号位为空；⑥号位连接废液瓶；所述八通阀的①号位与固相萃取柱A的上压头相连，固相萃取柱A的下压头与八通阀的⑤号位相连；八通阀的④号位与固相萃取柱B的上压头相连，固相萃取柱B的下压头与八通阀的⑥号位相连；八通阀的③号位为再生液入口，②号位与废液瓶相连，⑧号位为液体入口，如图2所示。在线固相萃取的具体步骤如下：

a)活化：固相萃取前，八通阀的⑧号位与①号位相通，六通阀的②号位与③号位相通，如图1a所示；活化液甲醇从八通阀的⑧号位进入，依次流经固相萃取柱A和固相萃取柱B对其进行活化；活化液的流速为0.6mL/min；

b)上样：八通阀和六通阀的阀位与步骤a相同；先用80％(v/v)乙腈-水溶液提取水稻样品，获得提取液；再用液相色谱自动进样器定量吸取提取液，在80％(v/v)乙腈-水溶液推动下，使提取液经八通阀⑧号位进入，加载到固相萃取柱A的柱头，油菜素甾醇被保留在固相萃取柱A上；上样溶液流速为1.0mL/min；提取液全部进入固相萃取柱A后停止上样；

c)洗脱衍生：八通阀的阀位与步骤a相同，切换六通阀，六通阀的①号位与②号位相通，如图1b所示。洗脱溶剂为含有2.0mg/L氨基苯硼酸和9％(v/v)吡啶的乙腈溶液。驱动洗脱溶剂以0.6mL/min的流速从八通阀的⑧号位进入，依次流经固相萃取柱A和固相萃取柱B，将油菜素甾醇洗脱下来并与洗脱溶剂中的氨基苯硼酸发生衍生反应。洗脱液直接进入色谱柱。

d)分离再生：色谱进样完成后，切换八通阀，如图1c所示。此时八通阀的③号位与④号位相通；驱动再生液甲醇以1.5mL/min的流速从③号位进入，依次流经固相萃取柱B和固相萃取柱A，对其进行再生。

活化液、上样溶液可以通过注射泵驱动，并以多位选择阀选择进入八通阀的液体。

分析结果：采用上述方法对50mg水稻叶片样品进行处理，采用液相色谱进行分离分析，检测出5种油菜素甾醇，结果见表1。

表1水稻样品中油菜素甾醇含量检测结果

实施例2

如实施例2所述，其区别在于：用一个四通阀代替六通阀。如图2所示，四通阀的①号位与八通阀的⑦号位相连；四通阀的②号位与色谱柱相连，③号位为流动相入口；④号位连接废液瓶。活化、上样时阀位如图2a所示；洗脱时，切换四通阀，使洗脱液直接进入色谱柱(图2b)；进样完成后，切换八通阀进行再生(图2c)。

分析结果同实施例1。

实施例3

采用全自动在线固相萃取装置对拟南芥提取液进行固相萃取，全自动在线固相萃取装置具有双组压头，分别夹紧固相萃取柱A和固相萃取柱B。固相萃取柱A和固相萃取柱B为圆柱体，沿柱体中心轴开设有一个贯穿上下两端的圆形通孔，通孔直径为1mm，通孔内填充固体吸附剂；柱体上下两端设有与柱体紧密结合的筛板将填料封装在通孔内；所述固相萃取柱A和固相萃取柱B的两端面与全自动在线固相萃取装置的压头尺寸相匹配。固相萃取柱A填充6.3μL C8键合硅胶颗粒；固相萃取柱B填充6.3μL MAX-MCX混合吸附剂，其中MAX和MCX按质量比1:1预先混合均匀，吸附剂填充体积占通孔容积的85％。全自动在线固相萃取装置内有一个两位八通阀和一个六通阀，所述六通阀位于八通阀与色谱柱之间，六通阀的①号位与八通阀的⑦号位相连；六通阀的②号位与⑤号位连接有一个衍生反应管，用于在线衍生油菜素甾醇；所述衍生反应管为石英盘管，内容积为100微升；六通阀的③号位为流动相入口，④号位连接色谱柱，⑥号位连接废液瓶；所述八通阀的①号位与固相萃取柱A的上压头相连，固相萃取柱A的下压头与八通阀的⑤号位相连；八通阀的④号位与固相萃取柱B的上压头相连，固相萃取柱B的下压头与八通阀的⑥号位相连；八通阀的③号位为再生液入口，②号位与废液瓶相连，⑧号位为液体入口，如图3所示。在线固相萃取的具体步骤如下：

a)活化：固相萃取前，八通阀的⑧号位与①号位相通，六通阀的③号位与④号位相通，如图3a所示；活化液乙腈从八通阀的⑧号位进入，依次流经固相萃取柱A和固相萃取柱B对其进行活化；活化液的流速为1mL/min；

b)上样：八通阀和六通阀的阀位与步骤a相同；先用乙腈或甲醇提取拟南芥样品，获得提取液；再用液相色谱自动进样器定量吸取提取液，在上样溶液乙腈或甲醇推动下，使提取液经八通阀⑧号位进入，加载到固相萃取柱A的柱头，油菜素甾醇被保留在固相萃取柱A上；上样溶液流速为0.5mL/min；提取液全部进入固相萃取柱A后停止上样；

c)洗脱衍生：八通阀和六通阀的阀位与步骤a相同，驱动衍生液以1.0mL/min的流速从八通阀的⑧号位进入，依次流经固相萃取柱A和固相萃取柱B，将油菜素甾醇洗脱下来并带入衍生反应管停流50s进行衍生；所述衍生液为含有1.0mg/L菲硼酸和6％(v/v)吡啶的乙腈溶液。所述衍生反应管外部设有加热装置，发生衍生反应时，衍生反应管的温度为75℃；

d)分离再生：衍生反应结束后，切换八通阀和六通阀，如图3b所示。此时八通阀的③号位与④号位相通；驱动再生液乙腈以1.0mL/min的流速从③号位进入，依次流经固相萃取柱B和固相萃取柱A，对其进行再生；此时六通阀③号位与②号位相通，色谱流动相将衍生反应管内的衍生产物推送至色谱柱进行分离分析。

活化液、上样溶液和衍生液可以通过注射泵驱动，并以多位选择阀选择进入八通阀的液体。

分析结果：采用上述方法检测20mg拟南芥幼芽样品，检测出3种油菜素甾醇，其中24-epibrassinolide含量0.03±0.01ng/g，24-epicastasterone含量0.16±0.06ng/g，6-deoxo-24-epicastasterone含量2.79±0.27ng/g。

实施例4

如实施例3所述，其区别在于：所述洗脱溶剂为含有2.0mg/L萘基蒽硼酸和10％(v/v)吡啶的乙腈溶液。所述衍生反应管内容积为250微升，洗脱液进入衍生反应管停流20s。

分析结果：采用上述方法检测30mg拟南芥叶片样品，检测出2种油菜素甾醇，其中24-epibrassinolide含量2.05±0.31ng/g，6-deoxo-24-epicastasterone含量0.26±0.05ng/g。

Claims (9)

1.一种全自动串联固相萃取植物中油菜素甾醇的方法，其特征在于：采用全自动在线固相萃取装置进行固相萃取，所述全自动在线固相萃取装置具有双组压头，分别夹紧固相萃取柱A和固相萃取柱B；所述固相萃取柱A填充的固体吸附剂为C8或C18键合硅胶颗粒；所述固相萃取柱B填充的固体吸附剂为混合型阳离子交换吸附剂与混合型阴离子交换吸附剂的等质量组合；固相萃取柱A和固相萃取柱B为圆柱体，沿柱体中心轴开设有一个贯穿上下两端的圆形通孔，通孔内填充固体吸附剂；柱体上下两端设有与柱体紧密结合的筛板将填料封装在通孔内；所述固相萃取柱A和固相萃取柱B的两端面与全自动在线固相萃取装置的压头尺寸相匹配；所述全自动在线固相萃取装置内有一个两位八通阀和一个六通阀或四通阀，所述六通阀或四通阀位于八通阀与色谱柱之间，六通阀或四通阀的①号位与八通阀的⑦号位相连；六通阀或四通阀的②号位与色谱柱相连，六通阀或四通阀的③号位为流动相入口；六通阀的④号位和⑤号位为空；六通阀的⑥号位或四通阀的④号位连接废液瓶；所述八通阀的①号位与固相萃取柱A的上压头相连，固相萃取柱A的下压头与八通阀的⑤号位相连；八通阀的④号位与固相萃取柱B的上压头相连，固相萃取柱B的下压头与八通阀的⑥号位相连；八通阀的③号位为再生液入口，②号位与废液瓶相连，⑧号位为液体入口；所述在线固相萃取的具体步骤包括：

a)活化：固相萃取前，八通阀的⑧号位与①号位相通，六通阀或四通阀的②号位与③号位相通；活化液从八通阀的⑧号位进入，依次流经固相萃取柱A和固相萃取柱B对其进行活化；

b)上样：八通阀和六通阀或四通阀的阀位与步骤a相同；用液相色谱自动进样器定量吸取含油菜素甾醇的植物样品提取液，在上样溶液推动下，使植物样品提取液经八通阀⑧号位进入，加载到固相萃取柱A的柱头，油菜素甾醇被保留在固相萃取柱A上；所述上样溶液与植物提取液的溶剂条件相同；提取液全部进入固相萃取柱A后停止上样；

c)洗脱衍生：八通阀阀位与步骤a相同，六通阀或四通阀的①号位与②号位相通，驱动洗脱溶剂从八通阀的⑧号位进入，依次流经固相萃取柱A和固相萃取柱B，将油菜素甾醇洗脱下来所述洗脱溶剂为含有衍生试剂的流动相，洗脱过程中进行衍生，洗脱液直接进入色谱柱；

d)分离再生：进样完成后，切换八通阀和六通阀或四通阀，此时八通阀的③号位与④号位相通；再生液从③号位进入，依次流经固相萃取柱B和固相萃取柱A，对其进行再生；此时六通阀或四通阀的①号位与②号位相通，色谱流动相直接进入色谱柱进行分离分析。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述全自动在线固相萃取装置内有一个两位八通阀和一个六通阀，所述六通阀位于八通阀与色谱柱之间；所述六通阀的②号位与⑤号位之间连接有一个衍生反应管，用于在线衍生油菜素甾醇；六通阀的③号位为流动相入口，④号位连接色谱柱；所述步骤a、b和c中六通阀的④号位与③号位相通；所述步骤c中，驱动衍生液从八通阀的⑧号位进入，依次流经固相萃取柱A和固相萃取柱B，将固相萃取柱A上保留的油菜素甾醇洗脱下来并带入衍生反应管内停流一段时间进行衍生；所述衍生液为含衍生试剂和5％～10％(v/v)吡啶的乙腈溶液；待衍生反应结束后，执行步骤d，切换八通阀和六通阀，此时六通阀的③号位与②号位相通，色谱流动相将衍生反应管内的衍生产物推送至色谱柱进行分离分析。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述衍生试剂为氨基苯硼酸，浓度为0.5～2.0mg/L；所述流动相为体积浓度为60％～100％的乙腈-水溶液；所述植物样品提取液所采用的提取溶剂为乙腈、甲醇、80％(v/v)乙腈-水溶液、80％(v/v)甲醇-水溶液中的任一种。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述活化液和再生液为乙腈或甲醇中的任一种。

5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述衍生反应管外部设有加热装置，发生衍生反应时，衍生反应管的温度为65℃～75℃；所述步骤c中液体在衍生反应管内停留的时间为20s～60s。

6.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述衍生试剂为萘基苯硼酸、菲硼酸、蒽硼酸、萘基蒽硼酸中的任一种；衍生试剂的浓度为0.5～2.0mg/L；所述流动相为体积浓度为60％～100％的乙腈-水溶液。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述固相萃取柱A和固相萃取柱B的通孔直径为1mm～3mm，内部填充的固体吸附剂的体积为6.3μL～70μL，填充体积为通孔容积的80％～100％。

8.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述活化液的流速为0.5mL/min～1mL/min；上样溶液的流速为0.1mL/min～1.0mL/min；洗脱溶剂和衍生液的流速为0.5mL/min～1.5mL/min；再生液的流速为0.5mL/min～1.5mL/min。

9.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述衍生反应管为石英盘管，内容积为100微升～300微升。