CN112204390B - 微固相提取装置和方法 - Google Patents

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Abstract

可使用样品小柱（201）进行样品制备和分离。所述小柱包括具有第一端部和第二端部的圆筒（204）、连接到所述圆筒的第二端部的色谱柱区段（209）以及包含吸附剂材料的色谱柱（205）。所述吸附剂材料包括抗体附接到其上以选择性地保留分析物的颗粒、蛋白质附接到其上以保留特定类别的抗体的颗粒或酶附接到其上以对特定类别的分子执行特异性修饰的颗粒。所述色谱柱区段可与温度控制装置热连通以便控制所述色谱柱的温度。

Description

微固相提取装置和方法
本申请要求2018年5月21日提交的名称为“Micro Solid Phase ExtractionDevices and Methods”的美国临时专利申请No. 62/674,146和2019年3月20日提交的名称为“Micro Solid Phase Extraction Devicesand Methods”的美国临时专利申请No. 62/820,902的优先权和权益；这些申请中的每个申请的全部内容据此全文以引用方式并入本文。
技术领域
本技术整体涉及用于执行样品制备（例如，样品清洗、浓缩、提取）和分离的装置和方法，并且具体地涉及使用微固相提取（µSPE）装置进行的样品制备和分离。
背景技术
样品制备在分析复杂样品诸如生物样品中起主要作用。例如，血液包含高浓度的蛋白质和脂质，这对于色谱和/或MS分析可能是有害的。因此，需要在分析前对复杂样品进行样品净化（例如，清洗）、提取（例如，浓缩）和分离。
微流体液相色谱（µLC）通常用于痕量分析和高灵敏度分析。µLC可在非常小的样品上执行，并且在较大体积的样品不可用或过于昂贵的情况下，µLC可能是特别有意义的。传统样品制备方法诸如固相提取（SPE）、蛋白质沉淀（PP）、液-液提取（LLE）和渗析可从多达0.2mL-1mL的样品开始，该样品可在处理过程中稀释至高达0.5mL-10mL的总体积。这些“大体积”样品制备方法与µLC具有有限的相容性，因为这些方法需要对于µLC而言原本不必要的样品量，这会引入浪费和过多的成本，并且如果没有足够的样品，则可能妨碍分析。
发明内容
本文提供了用于在小柱中执行样品的清洗、提取和分离的装置和方法。例如，µSPE装置可为温度受控的以增强色谱性能，或者可用附接有抗体的吸附剂材料进行填充以便选择性地保留特定分析物。
本技术的一个方面涉及用于样品的清洗和分离的小柱。小柱包括圆筒，该圆筒具有开放的圆筒第一端部和与圆筒第一端部相对的圆筒第二端部。小柱还包括色谱柱区段，该色谱柱区段具有连接到圆筒第二端部的色谱柱区段第一端部和与色谱柱区段第一端部相对的色谱柱区段第二端部。小柱还包括跨越色谱柱区段的色谱柱，该色谱柱包含吸附剂材料并且具有与圆筒第二端部流体连通的色谱柱第一端部和与色谱柱第一端部相对的色谱柱第二端部。小柱还包括位于色谱柱区段第一端部处并且与色谱柱第一端部流体连通的流动相源端口。吸附剂材料包括抗体附接到其上以选择性地保留分析物的颗粒、蛋白质附接到其上以保留特定类别的抗体的颗粒或酶附接到其上以对特定类别的分子执行特异性修饰的颗粒。
本技术的上述方面可以包括以下特征中的一者或多者。根据一个实施方案，吸附剂材料包括具有用于选择性地保留小分子、蛋白质或其他抗体的抗体的颗粒。根据另一个实施方案，吸附剂材料包括蛋白质A、G或L中的一种或多种附接到其上以保留特定类别的抗体的颗粒。根据另一个实施方案，吸附剂材料包括胰蛋白酶、胃蛋白酶、PNGaseF或IdeS中的一种或多种附接到其上以对特定类别的分子执行特异性消化或修饰的颗粒。
本技术的另一个方面涉及用于样品的清洗和分离的小柱。小柱包括圆筒，该圆筒具有开放的圆筒第一端部和与圆筒第一端部相对的圆筒第二端部。小柱还包括色谱柱区段，该色谱柱区段具有连接到圆筒第二端部的色谱柱区段第一端部和与色谱柱区段第一端部相对的色谱柱区段第二端部。小柱还包括色谱柱，该色谱柱跨越色谱柱区段并且具有与圆筒第二端部流体连通的色谱柱第一端部和与色谱柱第一端部相对的色谱柱第二端部。小柱还包括温度控制元件，该温度控制元件操作地联接到色谱柱区段并且被配置为控制色谱柱的温度。小柱还包括位于色谱柱区段第一端部处并且与色谱柱第一端部流体连通的流动相源端口。
本技术的上述方面可以包括以下特征中的一者或多者。根据一个实施方案，温度控制元件包括被配置为加热色谱柱区段的加热元件。根据另一个实施方案，加热元件被配置为在室温下已对色谱柱区段上样之后加热色谱柱区段。根据另一个实施方案，加热元件被配置为加热色谱柱区段以便在特定类型的色谱中产生窄峰宽。根据另一个实施方案，加热元件被配置为在介于约20-90℃之间的基本上恒定的温度下操作。根据另一个实施方案，温度控制装置包括被配置为冷却色谱柱的冷却元件。根据另一个实施方案，冷却元件被配置为冷却色谱柱以便在低于环境温度的温度下对色谱柱上样。
本技术的另一个方面涉及用于在包括圆筒和色谱柱的色谱小柱中清洗、提取和分离样品的方法。该方法包括将样品添加至圆筒；将溶剂的一部分添加至圆筒以清洗该样品；以及将样品的至少一部分上样到色谱柱上。该方法还包括使用操作地联接到色谱柱的温度控制装置来控制色谱柱的温度。该方法还包括在流动相源与色谱柱的第一端部之间形成第一连接，使得该连接绕过圆筒，并且在出口管线与色谱柱的第二端部之间形成第二连接。该方法还包括对从流动相源通过色谱柱到出口管线的流动相流加压。
本技术的上述方面可以包括以下特征中的一者或多者。根据一个实施方案，控制色谱柱的温度包括在对色谱柱上样之后加热色谱柱。根据另一个实施方案，控制色谱柱的温度包括在介于约20-90℃之间的基本上恒定的温度下操作温度控制装置以便在特定类型的色谱中实现窄峰宽。根据另一个实施方案，控制色谱柱的温度包括在介于约20-90℃之间的基本上恒定的温度下操作温度控制装置以便增强酶促或化学过程。在一个非限制性实施方案中，温度可高达约100摄氏度，然而液体的沸腾是不期望的。根据另一个实施方案，控制色谱柱的温度包括冷却色谱柱以在低于环境温度的温度下上样以便增强保留能力。根据另一个实施方案，该方法还包括用吸附剂材料填充该色谱柱的至少一部分，这些吸附剂材料包括抗体附接到其上以选择性地保留分析物的颗粒、蛋白质附接到其上以保留特定类别的抗体的颗粒或酶附接到其上以对特定类别的分子执行特异性修饰的颗粒。根据另一个实施方案，该方法还包括在使流动相通过具有第一吸附剂材料的色谱柱之后使流动相通过填充有第二吸附剂材料的色谱柱，其中第一吸附剂材料和第二吸附剂材料包括抗体附接到其上以选择性地保留分析物的颗粒、蛋白质附接到其上以保留特定类别的抗体的颗粒或酶附接到其上以对特定类别的分子执行特异性修饰的颗粒。
本技术具有许多优点。具体地讲，控制µSPE装置的温度的能力允许在特定温度下上样和洗脱，以便增强保留能力、特定类型色谱的窄峰宽，或增强特定化学过程。用具有与其结合的特定抗体的吸附剂材料填充µSPE装置可通过允许对目标分析物的捕集和浓缩来增加系统的灵敏度。
本公开提供了一种一次性小柱，从而避免了清洗小柱的需要并且避免了用过的小柱尚未完全清洗造成的污染。本技术的一些实施方案提供了成本足够低的小柱，使得它们可在一次或几次使用之后被丢弃。这些一次性小柱提供“脏”样品的分离，这些“脏”样品包含将趋于保留在小柱中并且抵抗有效清洁的组分。
本技术的实施方案允许µSPE装置以在线或离线方式上样。本技术的实施方案还允许从µSPE装置洗脱到容器中以用于非连续分析，在线到检测器，或在线到二级色谱维度，然后进行检测。
附图说明
通过以下结合附图所作的详细描述，将更充分地理解本发明。
图1示出了根据本技术的实施方案的小柱。
图2为根据本公开的实施方案的安装在提取系统的一部分内的小柱的实施方案的剖视图。
图3为根据本公开的实施方案的填充有吸附剂材料的小柱的另一个实施方案的剖视图。
图4为根据本公开的实施方案的填充有吸附剂材料的小柱的又一个实施方案的剖视图。
图5为根据本公开的实施方案的在与温度控制装置连通的孔板中的三个小柱的剖视图。
图6为根据本公开的实施方案的具有水夹套的小柱的色谱柱部分的剖视图。
图7A为根据本公开的实施方案的具有锥形壁的小柱的色谱柱部分的剖视图。
图7B为根据本公开的实施方案的具有直壁的小柱的色谱柱部分的剖视图。
图8为根据本公开的实施方案的具有带有可拆卸色谱柱区段的多个样品孔的孔板的剖视图。
图9示出了孔板的一部分的透视图，其中可插入多个小柱，诸如图1所示的小柱。
图10示出了根据本公开的实施方案的检测器响应，该检测器响应示出了最小和中等的系统分散。
图11提供了根据本技术的一个实施方案的方法。
图12提供了根据本技术的另一个实施方案的方法。
图13示出了根据本公开的实施方案的展示以电阻方式加热小柱的影响的色谱图。
图14示出了根据本公开的实施方案的展示另选洗脱溶剂的影响的色谱图。
图15示出了根据本公开的实施方案的包含抗体的样品的色谱图，该样品已由填充有蛋白质A连接的颗粒并洗脱到UV检测器的小柱捕获。
具体实施方式
现在将描述某些示例性实施方案，以便能够全面理解本文所公开的设备和方法的结构、功能、制造和使用的原理。附图中示出了这些实施方案中的一个或多个示例。本领域的技术人员将理解，本文具体描述且在附图中示出的装置和方法是非限制性示例性实施方案。结合一个示例性实施方案示出或描述的特征可与其他实施方案的特征组合。此类修改和变型旨在包括在本技术的范围内。
一般来讲，本技术涉及提供待执行的高度敏感MS和µLC/MS（微液相色谱/质谱）分析的装置和方法。在一个实施方案中，小柱设置有允许离线样品上样和在线洗脱的结构。在某些实施方案中，为了提供在线洗脱，定制小柱的一个或多个部分以支持色谱柱的加压，并且在一些情况下允许洗脱物被直接送至检测器而无需不必要的样品稀释或分散。因此，可执行高度敏感的MS和µLC/MS分析。如本文所用，“在线”是指作为由系统建立并在系统内的加压流体流的一部分的操作。相比之下，“离线”是指脱离此类加压流体流的操作。
在实施方案中，可将真空、正压或离心力施加到小柱以处理样品。真空、正压或离心力可用于处理约10µL-250µL的样品，捕集所关注的分析物，并洗掉不期望的杂质。这可用机器人自动取样机或由操作者手动完成。可离线地或优选在线地洗脱所上样的µSPE（微固相提取）板。在后一种方法中，将板置于单独的保持器/夹具中，并通过流动相流洗脱。这是以快速串行方式实现的；洗脱液被直接送至检测器（例如，质谱仪）或送至µLC以用于进一步分析。将µSPE装置设计成使得可洗脱µSPE孔而无需不必要的样品稀释或分散，从而允许进行高度敏感的MS和µLC/MS分析。
除了能够承受增加的压力之外，可对本文所述的µSPE装置的一些实施方案进行温度控制，以便在上样和/或洗脱期间定制小柱的温度。具体地讲，可将µSPE装置可操作地联接到温度控制装置（诸如加热或冷却元件），以便在特定温度下上样和洗脱，以便增强保留能力、特定类型色谱的窄峰宽，或增强特定化学过程。根据另外的实施方案，该µSPE装置可填充有特异性吸附剂材料，这些特异性吸附剂材料具有与其结合的特定抗体，以便允许捕集和浓缩目标分析物。
图1中示出了示例性µSPE小柱101。如图所示，小柱101为具有由相同材料制成的圆筒区段103和色谱柱区段109的一体构造。如图所示，小柱101具有打开的圆筒第一端部102。可将用于样品制备的样品插入圆筒区段103（如，用于样品清洗和用于上样到色谱柱上）。即，圆筒位于圆筒第一端部102（参见图1）和圆筒第二端部206（参见图2）之间的内部可为未填充的并且可被构造成容纳样品。色谱柱区段109包括填充有固定相/吸附剂（未示出）的色谱柱。在一些实施方案中，吸附剂材料包括具有用于选择性地保留小分子、蛋白质或其他抗体的抗体的颗粒。另选地或除此之外，吸附剂材料可具有附接到其上的酶，以便对特定类别的分子执行特异性修饰。吸附剂材料可包括例如蛋白质A、G或L中的一种或多种附接到其上以保留特定类别的抗体的颗粒。在另一个实施方案中，吸附剂材料可包括胰蛋白酶、胃蛋白酶、PNGaseF或IdeS中的一种或多种附接到其上以对特定类别的分子执行特异性消化或修饰的颗粒。色谱柱可具有10至2000个理论板的分离能力。设置在色谱柱区段109内的色谱柱可具有任何实际大小尺寸。例如，色谱柱内径可大至约10mm。一般来讲，较小的内径尺寸诸如5mm、4mm、2mm或1mm将是更实用的。色谱柱的尺寸可被设定成具有任何可行的长度。在一些实施方案中，色谱柱可具有至少2mm的长度。并且在一些实施方案中，色谱柱的长度和内径彼此相关联。例如，色谱柱可具有比其直径大至少约2倍的长度。此外，色谱柱的内径在其整个长度上可为相同的大小或基本上相同的大小。另选地，直径可以是渐变的，使得直径沿着色谱柱的长度减小或增大。通过用具有与其结合的抗体的吸附剂填充色谱柱，可以选择性地保留色谱柱内抗体被设计用于的分析物（即小分子、蛋白质、其他抗体等）。
图2示出根据本公开的实施方案的安装在提取系统的一部分内的小柱201的剖视图。小柱201具有圆筒区段203内的圆筒204和色谱柱区段209内的色谱柱205。将溶剂源220插入小柱201的圆筒204中，使得其绕过圆筒204的开放空间并且直接连接到色谱柱205的第一端部207。应当理解，相同的溶剂源220可用于通过相对于小柱201更高地定位溶剂源220来将清洗溶剂提供到圆筒204中，使得溶剂可被释放到圆筒204中以清洗样品并将样品上样到色谱柱上（即，在色谱分离之前）。另选地，可提供不同的源用于清洗目的。
出口230连接到色谱柱205的第二端部208。出口230被构造成具有配件231，该配件托住小柱201围绕色谱柱205的部分，从而为色谱柱提供附加的结构支撑并且避免色谱柱205和周围的小柱部分在压力下变形。即，配件231通过支撑色谱柱区段209的外部来增强色谱柱区段209。出口管线221包含与色谱柱205的第二端部210的流体连接，以直接进行µLC/MS分析。
通过在溶剂源220和色谱柱205之间提供直接流体连接，可将上样到固定相上的样品的洗脱直接送至LC色谱柱和/或检测器。为了提供这些连接，定制色谱柱区段209以提供适当的结构，从而承受通过色谱柱205的流动流的加压和/或通过色谱柱205的样品的分离的压力。在一些实施方案中，所定制的结构允许色谱柱区段209承受约5000psi或更大（例如，6000psi、8000psi、10000psi、12000psi、15000psi）的压力。可利用多种设计来提供此类连接。在图2中，出口230包括配件231，该配件托住并固定色谱柱区段209以提供此类连接。即，色谱柱区段209已被增强以提供压力密闭连接。在图3中，以不同方式定制小柱的结构以允许将流动源220直接连接到色谱柱的第一端部207以用于在线洗脱。
图3示出了根据本公开的实施方案的填充有色谱柱305内的吸附剂材料的小柱301的剖视图。在该示例性实施方案中，小柱301具有包括圆筒区段303和色谱柱区段309的一体设计（例如，不可拆卸）。小柱301可由聚合物材料（诸如HDPE）制成，该聚合物材料可被注塑成型以提供适当的形式。为了提供高压操作，可将由高压材料制成的管例如金属管或由高强度聚合物制成的管（并且不同于模制小柱）插入并固定在小柱301内以提供一体设计。色谱柱305可通过热收缩、粘合剂或机械滑动配合设计固定在小柱301内。在该示例性实施方案中，色谱柱305填充有吸附剂材料，如上所述。
在一些实施方案中，色谱柱305内的吸附剂材料包括具有用于选择性地保留小分子、蛋白质或其他抗体的抗体的颗粒。另选地或除此之外，吸附剂材料可具有附接到其上的酶，以便对特定类别的分子执行特异性修饰。吸附剂材料可包括例如蛋白质A、G或L中的一种或多种附接到其上以保留特定类别的抗体的颗粒。在另一个实施方案中，吸附剂材料可包括胰蛋白酶、胃蛋白酶、PNGaseF或IdeS中的一种或多种附接到其上以对特定类别的分子执行特异性消化或修饰的颗粒。
图4示出了根据本公开的实施方案的填充有吸附剂材料的可拆卸圆筒和色谱柱设计的剖视图。在该示例性实施方案中，不同于圆筒区段和色谱柱区段两者由一体单件材料形成，小柱401由两件材料形成，这两件材料由不同材料制成并且可彼此分离或拆卸。圆筒区段403包括夹具420，该夹具将圆筒区段403密封到色谱柱区段409。夹具420将这两个件保持并固定在一起，但可为压力激活的，使得可根据需要移除圆筒区段403，尤其是在不再需要圆筒区段403时的在线洗脱期间（例如，在样品已被清洗并上样到色谱柱上之后）。圆筒区段403和色谱柱区段409以及夹具420的公差受到高度控制，使得当圆筒区段403夹持到色谱柱区段409时，圆筒区段和色谱柱区段的圆色谱柱形部分对准（即，具有共线轴）。使用两件式设计，色谱柱区段409可由与用于圆筒区段403的高压聚合物不同的高压聚合物形成。例如，色谱柱区段409可由PEEK形成以允许高压操作（例如，在15,000psi及以上）。圆筒区段403可由不同的材料诸如聚丙烯形成。在该示例性实施方案中，色谱柱405可填充有吸附剂材料，如上所述。色谱柱区段409还操作地联接到温度控制元件410。在一个示例性实施方案中，使用温度控制元件410修改在色谱柱区段409处或该色谱柱区段附近的设备的温度可增强色谱性能。根据各种实施方案，温度控制元件410可联接到夹具部分420或色谱柱405。色谱柱区段409可例如使用热电加热元件以电阻方式、电感方式或以一些其他合适的方式加热。在一个实施方案中，控制色谱柱温度的能力允许使用者在室温下上样以增强保留能力，然后在更高温度下洗脱。在另选的实施方案中，系统可在恒定高温下操作以便使特定类型的色谱中的峰宽变窄，或者可在恒定温热温度下操作以便增强特定酶促或化学过程。在其他实施方案中，温度控制元件410可使用热电元件或斯特林发动机冷却色谱柱区段409。根据各种实施方案，冷却色谱柱的能力可允许使用者在低于环境温度的温度下对色谱柱上样以便进一步增强保留能力，以加强依赖于温度的工作流诸如氢-氘交换或在线化学衍生化，或保持化学稳定性。
图5提供了根据本技术的与温度控制装置连通的另一种可能的小柱结构的剖视图。板500是容纳多个小柱501a、501b和501c的一体式模制聚合物结构（诸如HDPE）。虽然图5示出了三个小柱，但各种网格或其他布置（例如，96个小柱/样品孔）中可包括任何数量的小柱。每个小柱或样品孔501a、501b和501c包括圆筒504和色谱柱505。为了沿着小柱501a、501b和501c提供加强，增强材料的壁或裙状部510围绕每个小柱设置以增强圆筒504和色谱柱505之间的连接以支撑小柱的外部，从而避免或最小化在小柱处于压力下时色谱柱或小柱壁的变形。在该示例性实施方案中，小柱结构包括温度控制元件512，该温度控制元件类似于上文参考图4所述的温度控制元件。温度控制元件可与至少部分地围绕样品孔501a、501b、501c中的一者或全部的色谱柱505定位的壁或裙状部510连通。应当理解，具有多个样品孔的板可能需要与该板的不同部分热连通的多个温度控制元件，以便控制每个样品孔的色谱柱处的温度。在一个示例性实施方案中，壁或裙状部510由导热材料制成以便有助于控制样品孔的色谱柱的温度。
图6中以横截面示出了提供附加支撑以允许在线洗脱的另一个示例性设计。在该实施方案中，色谱柱602设置有夹具，特别是在色谱柱602周围和围绕该色谱柱分配压力的流体夹套或水夹套605。水夹套605可为可对色谱柱605或小柱的其他部件施加压力（由图6中的箭头指示）以便保持小柱的结构的任何流体夹套。水夹套605可在外表面603上施加小于或大于色谱柱602的内部压力的压力。即，水夹套605可施加使色谱柱区段609的任何膨胀最小化的压力。当水夹套605的压力大于色谱柱602的内部流体压力时，水夹套605径向压缩色谱柱602，这可增强色谱性能。色谱柱区段609中可包括一个或多个力集中器615（例如，凹口或切口），以进一步将色谱柱区段609固定并密封到圆筒604。在该示例性实施方案中，小柱结构还包括温度控制元件612，该温度控制元件类似于上文参考图4所述的温度控制元件，其热连接到色谱柱区段609。
将有助于压力连接的小柱的另一种可能构型或定制应用于色谱柱区段的外部。图7A示出了示例性锥形小柱701，其中围绕色谱柱703的侧壁702是锥形的。相比之下，图7B示出了示例性直壁小柱705，其具有围绕色谱柱707的直壁706。通过利用锥形壁的狭窄部分，锥形壁可提供更容易地将小柱上样到样品孔中的优点。另外，锥形对于小柱的结构强度可能是期望的。孔或配件（例如，与色谱柱的连接）可被设计成具有倒锥形以便接纳锥形小柱，同时提供足够紧密的连接以便支撑小柱壁。根据一些实施方案，热控制装置诸如上述热控装置也可与小柱701、705热连通。
另选地或除了增强小柱的部件和/或与出口管线的连接（如图2所示）以提供增强的流体连接之外，可定制其他小柱部件。例如，在图2中，可定制色谱柱205的第一端部207以增强与流动相源220的连接。即，在某些实施方案中，第一端部207被成形为与向色谱柱205提供流动相源220的流体管线配合。此类形状的示例包括使第一端部207成锥形，或使色谱柱205与从流动相源220延伸的线密封的力配合构型。此外，也可定制色谱柱205的第二端208以提供与出口管线221的压力密闭的流体连接。被设计成与出口管线221配合的洗脱物释放端口210可提供此类压力密闭的连接。洗脱物释放端口210可被成形（例如，锥形或力配合构型）以与建立到出口230的连接的管线221配合。
在一些实施方案中，可提供玻璃料和/或密封件以将色谱柱和吸附剂容纳在一起。例如，参见图2，玻璃料可在色谱柱的端部207、208中的一者或每一者处定位并固定在色谱柱内。保护吸附剂免受环境影响的一个或多个密封件也可设置在色谱柱205的端部207和208处。选地，包含玻璃料和密封件以具有基本上不妨碍流体流动的形状因子和附接件。即，优选的是附接或包括基本上不分散洗脱峰也不降低色谱分离效率的玻璃料。
一般来讲，根据本技术并且在图1A、图2、图3、图4、图5和图6中的每一个中示出的圆筒区段提供用于清洗样品和/或将样品上样到µSPE装置内的色谱柱上的开放容器或未填充空间。在将流动相源直接连接至上样色谱柱之前，可在上样之前清洗或处理样品。圆筒区段可包括漏斗部分，诸如图2所示的漏斗部分215，以帮助将样品上样到色谱柱中。
旨在用于色谱分离的样品可包括具有各种组分的基质内的样品。制备用于色谱系统的样品可包括清洗样品的步骤，其中特定溶剂被引入到样品材料上。该溶剂可溶解基质的一种或多种组分，使得这些组分可随后从样品容器中移除，留下样品的纯化形式。可使用多个清洗步骤来增加基质的非期望组分被移除的程度或提供不同的溶剂，使得基质的不同组分被移除。可用多种溶剂执行清洗，包括水性溶剂和有机溶剂、溶剂的混合物或包括溶解的组分诸如pH调节剂的溶剂。溶剂可以是例如甲醇、乙醇、乙腈、四氢呋喃、二甲氧基乙烷、氯丁烷、二氯苯、戊酮、丙酮、氯仿、环己烷、乙醚、乙酸乙酯、戊烷、己烷、庚烷、轻石油、甲苯、水以及它们的组合。另外，溶剂可为或可包括加压气体，诸如二氧化碳、六氟化硫、氯氟烃，尤其是在控制压力和温度使得溶剂在临界点处或临界点附近保持流体形式的情况下。也可从上述中选择流动相。虽然流动相和清洗溶剂可为相同的，但可注意到，优选地将选择清洗溶剂以溶解基质中的组分而不是样品中的组分，以便留下样品以用于分离。可使用除溶剂的组分之外的其他性质，以有利于在适当的步骤中溶解基质的非样品部分或样品。这些性质的示例可包括温度、压力或与溶液接触的持续时间。
如上所述，清洗和上样发生在圆筒区段。圆筒为未填充的空间，其可包括漏斗部分，诸如图2所示的漏斗部分215。色谱柱区段可包含选自HDPE（高密度聚乙烯）、PEEK（聚醚醚酮）、PA（聚酰胺）、PP（聚丙烯）、PVD（聚偏二氟乙烯）、陶瓷和金属的材料。小柱可另外包括夹套或其他增强壁。围绕色谱柱或色谱柱区段的夹套通常包括用于提供增加的耐压性以防止或最小化色谱柱区段变形的材料。夹套可由与色谱柱区段类似的材料形成，并且在一些实施方案中，可包括加压流体囊以抵消色谱柱中的流体力。夹套的示例在图2中被示出为夹套231。夹套231集成到出口230中，然而夹套231也可以是系统的单独部件。夹套可被构造成围绕色谱柱区段，以便为色谱柱提供加强并且增加色谱柱承受高压的能力。夹套的使用可提供特定优点，因为小柱的其他部分可在色谱柱部分和圆筒部分处由单一材料制成，并且可由较轻的材料制成，从而减少结构的重量、成本和体积，并且允许单一材料连续构造，而夹套可向装置提供必要的结构刚度，从而允许高压。另外，夹套可被设计成可重复使用的或为托盘或小柱的保持位置的部件。类布置可降低与夹套的使用相关联的成本和浪费。图6中提供了夹套的另一个示例，其中加压流体囊于抵消内部色谱柱压力。根据一些实施方案，夹套231可连接到本文所述的温度控制元件，以便将色谱柱加热或冷却至所需温度。
在一些实施方案中，小柱的色谱柱部分可不同于色谱柱的圆筒部分。例如，图3示出了具有圆筒区段304和色谱柱区段305的小柱301，该圆筒区段和色谱柱区段由不同材料制成，但固定在一起或以其他方式不可拆卸。色谱柱区段309包括固定在色谱柱区段309内的色谱柱305，该色谱柱区段具有与圆筒区段一致形成的外部307。图4示出了两部分小柱设计，其中圆筒区段403能够使用夹具420从色谱柱区段409拆卸。具有单独部件的小柱可提供各种优点，诸如允许针对圆筒使用较低强度的材料并且针对色谱柱部分使用较高强度的材料，这可降低装置的成本和重量。此外，如果不同的圆筒和色谱柱区段是可互换的，则系统可更容易地针对特定使用者的需要进行优化。
本技术的另一方面涉及一种利用一次性提取-分离色谱小柱的系统，其中该系统包括：孔板，该孔板包括多个小柱孔；第一溶剂供应源，该第一溶剂供应源被构造成将第一溶剂递送到该多个小柱孔中的任一个小柱孔内的提取-分离色谱小柱的圆筒部分；流动相源，该流动相源被构造成将流动相溶剂递送到该多个小柱孔中的任一个小柱孔内的提取-分离色谱小柱的色谱柱的第一端部；以及出口通道，该出口通道被构造成从与色谱柱的第一端部相对的色谱柱的第二端部接纳溶剂。这些板可以单一或可能可拆卸的方式廉价地形成，以形成一次性µSPE装置。图8示出了包括若干小柱或孔801的示例性一次性装置800的剖视图，其中圆筒部分803可从分离部分809拆卸。
图9示出了根据本公开的实施方案的包括板905的µSPE装置，该板具有用于插入一个或多个小柱901的开口910。利用可插入板中的小柱的优点在于，该板可被设计成任何所需形式（例如，96孔板形式、转盘形式）。板内上样的µSPE小柱既可以离线洗脱，也可以优选地在线洗脱。在后一种方法中，将板置于单独的保持器/夹具中，并通过流动相流洗脱。流动相直接连接到色谱柱以产生通过色谱柱的加压流以用于洗脱。这是以快速串行方式实现的；洗脱液被直接送至检测器（例如，质谱仪）或送至µLC以用于进一步分析。将µSPE装置设计成使得可洗脱µSPE孔而无需不必要的样品稀释或分散，从而允许进行高度敏感的MS和µLC/MS分析。根据一些实施方案，温度控制元件诸如上述温度控制元件可与板905热连通，以便控制小柱901的色谱柱处或该色谱柱附近的温度。应当理解，具有用于容纳大量小柱的多个开口的板可能需要与该板的不同部分热连通的多个温度控制元件，以便控制每个小柱的色谱柱处的温度。在一个示例性实施方案中，板905由导热材料制成以便有助于控制样品孔的色谱柱的温度。
图10示出了根据本技术的一个实施方案的µSPE装置上的梯度洗脱。所示的响应示出，由于小柱充当小色谱柱，所以使用小柱可能使分析物与背景部分分离。大约10-20的峰值容量可使用0.8mm×10mm SPE孔实现，如曲线1001所示。由于SPE装置使分散最小化，因此与遵循SPE装置的0.2µL2系统（即，二级色谱分离）相比，峰值容量和灵敏度增强，该系统不控制分散以及根据本技术的装置。曲线1002示出了包括0.2µL2色谱柱的系统的梯度响应。
图11示出了根据本技术的方法。一般来讲，方法1100涉及清洁和分离µSPE小柱内的样品。方法1100提供流动相到色谱柱的直接连接，从而绕过圆筒区段。方法1100包括若干步骤。步骤1110提供将样品添加至色谱小柱的圆筒中。可手动添加或通过自动取样器装置添加样品。步骤1120要求将溶剂的一部分添加至圆筒以清洗该样品。在一些情况下，可执行一系列清洗步骤以更好地提供样品的清洗。清洗溶剂可通过色谱柱从圆筒中移除，或可通过从圆筒中抽吸该溶剂来移除以避免或限制其暴露于色谱柱。步骤1130要求将样品的至少一部分上样到色谱柱上。可通过提供溶液来完成上样，该溶液可在一定压力下进入圆筒中。另外，可向色谱柱的相对端部施加负压以便促进上样。一旦样本已被溶剂化，就可通过重力上样样本。在某些实施方案中，用于分离的流动相可适用于对色谱柱上样。
步骤1140要求使用温度控制装置控制色谱柱的温度。如上所述，温度控制装置可包括例如加热和/或冷却装置，诸如热电装置、电阻式温度控制装置、感应式温度控制装置、斯特林发动机或一些其他合适的装置。控制色谱柱处或该色谱柱附近的小柱温度的能力可允许使用者在室温下对小柱上样以增强保留能力并在更高温度下洗脱，在恒定高温下操作以便使特定类型的色谱中的峰宽变窄，在恒定温热温度下操作以便增强酶促或化学过程，在低于环境温度的温度下上样以进一步增强保留能力，加强依赖于温度的工作流（例如，氢-氘交换或在线化学衍生化），或冷却系统以保持化学稳定性。在一些实施方案中，加热元件被配置为加热装置，使得其在介于约20-90℃之间的基本上恒定的温度下操作。例如，酶促反应（例如，解吸）通常在约37℃，或介于20-90℃之间，或甚至在100℃下执行。在核酸应用中，可通过高达90℃的温度实现变性（即，将双链形式变为单链）。
步骤1150要求在流动相源与色谱柱的第一端部之间形成第一连接，使得该连接绕过圆筒，并且在出口管线与色谱柱的第二端部之间形成第二连接。步骤1150要求对从流动相源通过色谱柱到出口管线的流动相流加压。对通过色谱柱的流动相流加压允许色谱分离在色谱柱内进行以便分离先前已上样的样品。
图12提供了根据本技术的另一个实施方案的方法1200。除了上文相对于图11所述的步骤之外，色谱柱还可填充有吸附剂材料，该吸附剂材料包括具有与其直接结合的抗体的粒子。在二维色谱系统中，第一色谱柱可填充有第一吸附剂材料，并且第二色谱柱可填充有第二吸附剂材料，以便使在色谱系统的不同维度处针对不同分析物。
步骤1210包括用第一吸附剂材料填充第一色谱柱，并且步骤1220包括用第二吸附剂材料填充第二色谱柱。吸附剂材料可包括例如具有用于选择性地保留小分子、蛋白质或其他抗体的抗体的颗粒。另选地或除此之外，吸附剂材料可具有附接到其上的酶，以便对特定类别的分子执行特异性修饰。吸附剂材料可包括例如蛋白质A、G或L中的一种或多种附接到其上以保留特定类别的抗体的颗粒。在另一个实施方案中，吸附剂材料可包括胰蛋白酶、胃蛋白酶、PNGaseF或IdeS中的一种或多种附接到其上以对特定类别的分子执行特异性消化或修饰的颗粒。
在步骤1230中，一旦色谱柱已填充有吸附剂材料，就使流动相通过第一色谱柱。在步骤1240中，在流动相离开第一色谱柱时，其然后可穿过第二色谱柱。在色谱过程的不同水平处针对不同分析物的能力允许对色谱方法的控制增强。
图13示出了根据本公开的实施方案的包含小分子的样品的色谱图，并且展示了加热小柱的影响。如上所述，小柱或小柱的一部分可被以电阻方式加热，或使用另一种合适的加热技术来加热。图13所示的示例性色谱图是包含已由µSPE装置捕获的小分子的样品的色谱图，该µSPE装置已填充有抗体连接的颗粒并已与质谱仪在线进行洗脱。该色谱图展示了加热小柱以便实现窄峰宽的影响。该曲线图示出了各种曲线1301-1311和一条曲线1313，其中在曲线1301-1311中，在各种电压水平下加热小柱，在曲线1313中，未加热小柱。具体地讲，曲线1301、1303、1305、1307、1309和1311是含有小分子的样品的色谱图，其中分别使用19V、17V、15V、13V、10V和5V的电压加热小柱。
图14示出了根据本公开的实施方案的包含小分子的样品的色谱图，并且展示了另选洗脱溶剂的影响。如上所述，小柱或µSPE装置的一部分可填充有吸附剂或颗粒，这些吸附剂或颗粒具有与其结合的蛋白质A/G/L。图14所示的示例性色谱图是包含已由µSPE装置捕获的小分子的样品的色谱图，该µSPE装置已填充有抗体连接的颗粒并已与质谱仪在线进行洗脱。该色谱图展示了使用另选洗脱溶剂的影响。具体地讲，对于曲线1401，使用40% MeCN+1.0% FA的溶液，对于曲线1403，使用30%MeCN+1.0% FA的溶液，对于曲线1405，使用20%MeCN+1.0% FA的溶液，对于曲线1401，使用40%MeCN+1.0% FA的溶液，以及对于曲线1407，使用10% MeCN+1.0% FA的溶液。
由于通常在生物反应器中制备抗体，因此随时监测存在的量十分重要。通过以自动化方式直接从反应器中取样并使样品通过包含蛋白质A/G/L附接到其上的颗粒的µSPE装置，然后可以将抗体在线洗脱到检测器，到第二色谱维度，然后进行检测或洗脱到反应系统。在示例性反应系统内，洗脱液可与衍生化试剂混合以改善检测/色谱性能，然后进行检测。在另选的实施方案中，示例性反应系统可使洗脱液通过固定化酶反应器（IMER）以特定方式（轻链/重链、去糖基化、分解代谢等）消化抗体，然后进行色谱和检测。
图15示出了根据本公开的实施方案的包含抗体的样品的色谱图，该样品已由填充有蛋白质A连接的颗粒并洗脱到UV检测器的小柱捕获。该色谱图内的每个曲线表示不同体积的上样。在该特定非限制性示例中，使用介于约1µL-25µL之间的上样体积。在另选的实施方案中，多至100微升已用于类似的实验。
根据本公开的各种实施方案，上述多个µSPE装置的组合可用于更复杂的工作流。一种此类复杂的工作流可包括捕获在蛋白质A填充的µSPE装置上的抗体，然后使洗脱液通过PNGaseF填充的µSPE装置以提供用于定量/量化的去糖基化纯化的抗体。另一个示例性工作流可包括使用抗体填充的µSPE装置捕获蛋白质，然后使洗脱液通过胰蛋白酶填充的µSPE装置以允许肽谱/替代肽定量工作流。另一个示例性工作流可包括通过胃蛋白酶填充的µSPE装置注入样品，然后在C18填充的µSPE装置上捕集，从而允许捕获所生成的肽以供LC-MS后续分析（在线或离线、肽谱或定量）。
本领域的普通技术人员将会了解基于上述实施例的本发明的另外的特征和优点。因此，本发明不受已经具体示出和描述的内容的限制，由所附权利要求所指示的除外。

Claims (18)

1.一种用于清洗和分离样品的小柱，所述小柱包括：
圆筒，所述圆筒具有开放的圆筒第一端部和与所述圆筒第一端部相对的圆筒第二端部；
色谱柱区段，所述色谱柱区段具有连接到所述圆筒第二端部的色谱柱区段第一端部和与所述色谱柱区段第一端部相对的色谱柱区段第二端部；
跨越所述色谱柱区段的色谱柱，所述色谱柱包含吸附剂材料并且具有与所述圆筒第二端部流体连通的色谱柱第一端部和与所述色谱柱第一端部相对的色谱柱第二端部；以及
位于所述色谱柱区段第一端部处的流动相源端口，所述流动相源端口构造成绕过所述圆筒第一端部和所述圆筒的开放空间并且与所述色谱柱第一端部直接流体连接；
其中所述吸附剂材料包括抗体附接到其上以选择性地保留分析物的颗粒、蛋白质附接到其上以保留特定类别的抗体的颗粒或酶附接到其上以对特定类别的分子执行特异性修饰的颗粒。
2.根据权利要求1所述的小柱，其中所述吸附剂材料包括具有用于选择性地保留小分子或蛋白质的颗粒。
3.根据权利要求1所述的小柱，其中所述吸附剂材料包括蛋白质A、G或L中的一种或多种附接到其上以保留特定类别的抗体的颗粒。
4.根据权利要求1所述的小柱，其中所述吸附剂材料包括胰蛋白酶、胃蛋白酶、PNGaseF或IdeS中的一种或多种附接到其上以对特定类别的分子执行特异性消化或修饰的颗粒。
5.一种用于清洗和分离样品的小柱，所述小柱包括：
圆筒，所述圆筒具有开放的圆筒第一端部和与所述圆筒第一端部相对的圆筒第二端部；
色谱柱区段，所述色谱柱区段具有连接到所述圆筒第二端部的色谱柱区段第一端部和与所述色谱柱区段第一端部相对的色谱柱区段第二端部；
色谱柱，所述色谱柱跨越所述色谱柱区段并且具有与所述圆筒第二端部流体连通的色谱柱第一端部和与所述色谱柱第一端部相对的色谱柱第二端部；
温度控制元件，所述温度控制元件操作地联接到所述色谱柱区段并且被配置为控制所述色谱柱的温度；以及
位于所述色谱柱区段第一端部处的流动相源端口，所述流动相源端口构造成绕过所述圆筒第一端部和所述圆筒的开放空间并且与所述色谱柱第一端部直接流体连接。
6.根据权利要求5所述的小柱，其中所述温度控制元件包括被配置为加热所述色谱柱区段的加热元件。
7.根据权利要求6所述的小柱，其中所述加热元件被配置为在室温下已对所述色谱柱区段上样之后加热所述色谱柱区段。
8.根据权利要求6所述的小柱，其中所述加热元件被配置为加热所述色谱柱区段以便在特定类型的色谱中产生窄峰宽。
9.根据权利要求6所述的小柱，其中所述加热元件被配置为在介于约20-90℃之间的基本上恒定的温度下操作。
10.根据权利要求5所述的小柱，其中所述温度控制元件包括被配置为冷却所述色谱柱的冷却元件。
11.根据权利要求10所述的小柱，其中所述冷却元件被配置为冷却所述色谱柱以便在低于环境温度的温度下对所述色谱柱上样。
12.一种用于在色谱小柱中清洗、提取和分离样品的方法，其中所述色谱小柱是根据权利要求1至11中任一项所述的小柱，所述方法包括：
将样品添加至所述圆筒；
将溶剂的一部分添加至所述圆筒以清洗所述样品；
将所述样品的至少一部分上样到所述色谱柱上；
使用操作地联接到所述色谱柱的温度控制装置来控制所述色谱柱的温度；
在流动相源与所述色谱柱的第一端部之间形成第一连接，使得所述连接绕过所述圆筒，并且在出口管线与所述色谱柱的第二端部之间形成第二连接；以及
对从所述流动相源通过所述色谱柱到所述出口管线的流动相流加压。
13.根据权利要求12所述的方法，其中控制所述色谱柱的温度包括在对所述色谱柱上样之后加热所述色谱柱。
14.根据权利要求12所述的方法，其中控制所述色谱柱的温度包括在介于约20-90℃之间的基本上恒定的温度下操作所述温度控制装置以便在特定类型的色谱中实现窄峰宽。
15.根据权利要求12所述的方法，其中控制所述色谱柱的温度包括在介于约20-90℃之间的基本上恒定的温度下操作所述温度控制装置以便增强酶促或化学过程。
16.根据权利要求12所述的方法，其中控制所述色谱柱的温度包括冷却所述色谱柱以在低于环境温度的温度下上样以便增强保留能力。
17.根据权利要求12所述的方法，还包括用吸附剂材料填充所述色谱柱的至少一部分，所述吸附剂材料包括抗体附接到其上以选择性地保留分析物的颗粒、蛋白质附接到其上以保留特定类别的抗体的颗粒或酶附接到其上以对特定类别的分子执行特异性修饰的颗粒。
18.根据权利要求17所述的方法，还包括在使流动相通过具有第一吸附剂材料的色谱柱之后使所述流动相通过填充有第二吸附剂材料的色谱柱，其中所述第一吸附剂材料和所述第二吸附剂材料包括抗体附接到其上以选择性地保留分析物的颗粒、蛋白质附接到其上以保留特定类别的抗体的颗粒或酶附接到其上以对特定类别的分子执行特异性修饰的颗粒。
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