CN107796893B - 一种同时测定芍药种子中8种内源激素含量的hplc方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种同时测定芍药种子中多种内源激素含量的HPLC方法，步骤如下：a、制备供试品溶液；b、制备对照品溶液；c、分别将供试品溶液和对照品溶液注入高效液相色谱仪检测；d、根据检测结果计算得到芍药种子中的各激素含量。本发明方法可以同时测定芍药种子中8种内源激素，准确可靠、简便快速，为芍药种子的休眠机理研究、促进种子萌发提供了有效的理论依据。
Description
技术领域
本发明属于种子分析技术领域，具体涉及一种同时测定芍药种子中8种内源激素含量的HPLC方法。
背景技术
芍药(Paeonia lactiflora)兼观赏、油用、药用价值于一体，应用广泛，市场需求量大。目前农业生产上生产芍药主要采用块茎繁殖，但容易造成种质退化及药用和繁殖的竞争，而种子繁殖成本低、技术简便、繁殖系数大，能够迅速形成生产力。但由于芍药种子具有独特的上胚轴和下胚轴双休眠萌发特性，对其花期调控、育种工作的进行、种质资源的保护带来诸多不便，对芍药资源的开发利用造成障碍。
迄今为止，芍药种子特殊的双重休眠机理仍不清楚。研究表明，植物休眠由内源激素控制，休眠的起始、终止和调控以及休眠各阶段的变化均受激素调节，是由多种激素之间的平衡所控制。研究种子休眠和萌发过程中内源激素含量的变化规律，有助于研究其休眠的生理原因，为种子解除休眠和促进萌发提供理论依据。
目前对芍药种子中内源激素进行检测时，方法主要有酶联免疫法和高效液相色谱法，但测定的激素种类仅涉及赤霉素、脱落酸等不超过4种，种类较少。考虑到芍药中的有机酸成分众多，仅通过少数几种激素的含量来分析其休眠机理可靠性不高。为了全面分析其休眠机理，有必要对检测激素的种类进行扩展。
发明内容
本发明的目的在于提供一种同时测定芍药种子中多种内源激素含量的HPLC方法。
本发明提供了一种同时测定芍药种子中多种内源激素含量的HPLC方法，步骤如下：
a、制备供试品溶液：
取芍药种子粉末，以甲醇为溶剂提取，离心、浓缩，再分别经石油醚、乙酸乙酯萃取，浓缩，用流动相溶解、过滤，得供试品溶液；
b、制备对照品溶液：
取各激素对照品，混合，加乙腈溶解，配制成混合对照品溶液；
c、分别将供试品溶液和对照品溶液注入高效液相色谱仪检测，色谱条件如下：
色谱柱：C18色谱柱；
流动相：流动相A为体积分数为0.1％的磷酸水溶液，B为乙腈，梯度洗脱程序为：0.01～15min，5％～15％B；15～20min，15％～25％B；20～40min，25％～35％B；40～45min，35％～90％B；45～50min，90％B；
检测波长：分别为210nm和254nm；
d、根据检测结果计算得到芍药种子中的各激素含量。
其中，所述内源激素为玉米素、反式玉米素核苷、激动素、赤霉素、吲哚乙酸、水杨酸、脱落酸和/或吲哚丁酸。
其中，步骤a中，以甲醇为溶剂提取的方法为：取芍药种子粉末2重量份，加入体积分数为80％的甲醇溶液5体积份、石英砂0.02重量份及PVPP0.02重量份，研磨后，加入甲醇15体积份，4℃放置24h。
重量份与体积份的对应关系为：g/mL。
PVPP：交联聚乙烯聚吡咯烷酮。
其中，步骤a中，所述离心的条件为4℃，10000r/min离心10min。
其中，步骤c中，所述色谱柱的规格为：内径4.6mm，长度250mm，填料粒径5μm；优选的色谱柱型号为Agilent Eclipse XDB-C18色谱柱。
其中，步骤c中，所述梯度洗脱程序为：0.01～15min，5％B；15～20min，15％B；20～40min，25％B；40～45min，35％B；45～50min，90％B。
其中，所述色谱条件的柱温为35℃；流速为1.0mL/min。
其中，所述供试品溶液的进样量为10μL。
本发明通过对色谱条件的优化，可以同时测定芍药种子中8种内源激素，包括玉米素(ZT)、反式玉米素核苷(ZR)、激动素(KT)、赤霉素(GA)、吲哚乙酸(IAA)、水杨酸(SA)、脱落酸(ABA)以及吲哚丁酸(IBA)的含量，并且线性关系优异，稳定性、精密度、重复性试验的RSD均小于3％，而且样品回收率高。该方法准确可靠、简便快速，为芍药种子的休眠机理研究、促进种子萌发提供了有效的理论依据。
显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
附图说明
图1为各内源激素混合标准色谱图。
图2为芍药种子样品测定色谱图。
图3为洗脱方案1的样品色谱图。
图4为洗脱方案2的样品色谱图。
图5为洗脱方案3的样品色谱图。
图6为洗脱方案4的样品色谱图。
图7为洗脱方案5的样品色谱图。图1-7中，编号均代表：1-ZT，2-ZR，3-KT，4-GA，5-IAA，6-SA，7-ABA，8-IBA。
具体实施方式
下面以实施例作进一步说明，但本发明不局限于这些实施例。
实施例1本发明方法测定芍药种子的内源激素含量
1、供试品溶液的制备
取芍药种子粉末2g，加入4℃预冷的体积浓度为80％甲醇溶液5mL、0.02g石英砂以及0.02g PVPP(交联聚乙烯聚吡咯烷酮)，于研钵中迅速研磨成浆，用15mL冰甲醇(4℃)将样品传至具塞三角瓶中，保鲜膜密封后4℃冰箱中冷浸提24h。于4℃下以10000r/min离心10min得上清液，残渣中再加10mL80％冰甲醇离心10min后合并上清液，于35℃下减压、浓缩至原体积的1/3，加石油醚30mL萃取三次，弃醚相，水相用20mL乙酸乙酯萃取三次，合并酯相，35℃下减压、浓缩至干，流动相定容至2mL，经0.22μm微孔滤膜过滤后入样品瓶，即得芍药种子供试品溶液。
2、混合对照品溶液的制备
分别取玉米素(ZT)、反式玉米素核苷(ZR)、激动素(KT)、赤霉素(GA)、吲哚乙酸(IAA)、水杨酸(SA)、脱落酸(ABA)以及吲哚丁酸(IBA)对照品，加乙腈溶解，过滤，配成质量浓度分别为0.2mg/mL、0.22mg/mL、0.4mg/mL、3mg/mL、0.4mg/mL、0.5mg/mL、0.4mg/mL、0.4mg/mL的溶液，过滤，即得对照品溶液。
取各对照品溶液分别为0.1mL、0.5mL、0.2mL、1mL、0.2mL、0.08mL、2mL、0.2mL置同一10mL容量瓶中，加乙腈稀释至刻度，摇匀，即得玉米素2μg·mL-1、反式玉米素核苷11μg·mL-1、激动素8μg·mL-1、赤霉素300μg·mL-1、吲哚乙酸8μg·mL-1、水杨酸4μg·mL-1、脱落酸80μg·mL-1、水杨酸8μg·mL-1的混合对照品溶液。
3、8种内源激素含量测定标准曲线的建立
色谱柱为Agilent Eclipse XDB-C18色谱柱(4.6×250mm，5μm)；
流动相A为体积浓度0.1％磷酸水溶液，B为乙腈，采用梯度洗脱，梯度洗脱程序见表1。
表1梯度洗脱程序
柱温为35℃；流速为1mL·min-1；检测波长为210nm和254nm。将各标准溶液进样1μL、5μL、10μL、15μL、20μL，建立标准曲线，计算每种激素线性回归方程。
4、样品中激素含量的测定
按上述标准曲线色谱条件对制备的样品溶液进行测定，制备的样品溶液进样量为10μL，利用线性回归方程，计算样品中8种激素的含量。
以下通过试验例具体说明本发明的有益效果：
试验例1本发明的方法学验证
一、仪器与试药
LC-20A高效液相色谱仪(日本岛津公司)；高速冷冻离心机(安徽中科中佳)；旋蒸仪(瑞士Buchi公司)；BT124S电子天平(德国Sartorius公司)。
激素对照品ZT(批号13114-27-7)、ZR(批号6025-53-2)、KT(批号525-79-1)、GA(批号77-06-5)、IAA(批号87-51-4)、SA(批号69-72-7)、ABA(批号14375-45-2)、IBA(批号133-32-2)对照品均购自合肥博美生物科技有限公司，纯度均大于98％；甲醇(色谱纯，美国Fisher公司)；乙腈(色谱纯，美国J.T.Baker公司)；磷酸(优级纯，成都市科龙化工试剂厂)；无水乙醇(分析纯，成都市科龙化工试剂厂)。
二、实验方法
2.1色谱条件与系统适应性
色谱条件为：色谱柱为Agilent Eclipse XDB-C18色谱柱(4.6×250mm，5μm)；流动相A为体积浓度0.1％磷酸水溶液，B为乙腈，采用梯度洗脱，梯度洗脱程序见表1，柱温为35℃；流速为1mL·min-1；检测波长为210nm和254nm，进样量为10μL。
按照实施例1的方法分别制备对照品溶液和供试品溶液，进样量为10μL时的色谱图见图1-2。
2.2标准曲线的建立
称取玉米素(ZT)、反式玉米素核苷(ZR)、激动素(KT)、赤霉素(GA)、吲哚乙酸(IAA)、水杨酸(SA)、脱落酸(ABA)以及吲哚丁酸(IBA)对照品，加乙腈配成质量浓度分别为0.002mg/mL、0.011mg/mL、0.008mg/mL、0.3mg/mL、0.008mg/mL、0.004mg/mL、0.4mg/mL、0.008mg/mL的对照品溶液，分别进样1μL、5μL、10μL、15μL、20μL，按照实施例1中的色谱条件测定峰面积，以质量为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，得到每种激素线性回归方程及线性范围。
精密度试验、稳定性试验、重复性试验、回收率试验按常规方法进行。
三、实验结果
3.1色谱峰的归属
由图1-2可知，根据单标对照品保留时间，保留时间分别为ZT：3.059min、ZR:12.344min、KT:13.261min、GA:25.066min、IAA:29.439min、SA:30.521min、ABA:33.055min、IBA:48.908min，确定激素单体在混标中的位置。
从对照品溶液中可以检测出8种激素单体，样品溶液中待检的激素单体也能和其他杂峰分开，各组分的分离度良好。
3.2线性关系考察
各激素线性回归方程及线性范围见表2，本方法测定8种激素在0.002～8μg范围内呈良好的线性关系(r值均≥0.9997)。
表2各激素的线性回归方程及线性范围
可见，各激素对照品在各自质量浓度范围内线性关系良好，说明本发明方法线性范围广，准确度高。
3.3稳定性试验
在0，1，2，4，8，12，24h进样，共进样7次，ZT、ZR、KT、GA、IAA、SA、ABA、IBA峰面积的RSD分别为1.35％，1.64％，1.23％，1.58％，1.27％，1.45％，2.04％，2.21％。
可见，对照品溶液配制24h内，使用本发明方法，各激素的相对标准偏差均远远小于10％，稳定性良好。
3.4精密度试验
分别进对照品溶液10μL，重复进样7次，ZT、ZR、KT、GA、IAA、SA、ABA、IBA峰面积的RSD分别为1.32％，1.4％，0.74％，0.99％，1.02％，0.97％，1.15％，1.42％。
可见，使用本发明色谱系统，各激素的相对标准偏差均远远小于10％，精密度良好。
3.5重复性试验
取同一批样品，按样品制备方法制备7份，分别进样10μL，ZT、ZR、KT、GA、IAA、SA、ABA、IBA含量的RSD分别为0.56％，2.45％，1.92％，1.81％，1.07％，1.59％，1.96％，2.34％。
可见，使用本发明方法，各激素的相对标准偏差均远远小于10％，说明本发明方法重复性良好。
3.6回收率试验
按本方法液相色谱条件，精密移取一定量的对照品溶液加入到样品中，按本方法液相色谱条件进行操作，与样品溶液同时测定，ZT、ZR、KT、GA、IAA、SA、ABA、IBA回收率分别为98.32％，97.55％，97.13％，97.72％，99.17％，99.68％，97.49％，96.29％，RSD分别为1.3％，1.26％，1.27％，1.64％，1.05％，1.49％，1.71％，1.92％。
可见，使用本发明方法，样品回收率较高，说明本发明方法准确度高。
试验例2本发明方法对不同芍药种子的测定结果
取三批芍药种子，按照实施例1的方法进样分析，根据线性回归方程计算各激素含量。
结果见表3。
表3各激素含量
可见，本发明方法可以测定不同芍药种子中的内源激素含量。
试验例3本发明方法中洗脱条件的考察
取实施例1制备的芍药种子供试品溶液，分别考察了6种不同方案的洗脱条件的分离效果，其他条件同实施例1。
6种洗脱方案及色谱图峰的分离效果如下：
方案1：梯度洗脱程序设计见表4，芍药种子样品色谱图见图3，各成分峰分离情况见表5。
表4方案1的梯度洗脱程序
表5方案1的八种激素色谱分离情况
注：色谱峰的分离度达到1.5以上视为两个色谱峰完全分离
由图3表5及可知：8种激素中，仅反式玉米素核苷(ZR)能有效分离，其他成分均未达到分离要求。
方案2：梯度洗脱程序设计见表6，芍药种子样品色谱图见图4，各成分峰分离情况见表7。
表6方案2的梯度洗脱程序
表7方案2的八种激素色谱分离情况
注：色谱峰的分离度达到1.5以上视为两个色谱峰完全分离
由图4及表7可知：8种激素中，仅脱落酸(ABA)能有效分离，其他成分均未达到分离要求。
方案3：梯度洗脱程序设计见表8，芍药种子样品色谱图见图5，各成分峰分离情况见表9。
表8方案3的梯度洗脱程序
表9方案3的八种激素色谱分离情况
注：色谱峰的分离度达到1.5以上视为两个色谱峰完全分离
由图5及表9可知：8种激素中，仅反式玉米素核苷(ZR)和激动素(KT)能有效分离，其他成分均未达到分离要求。
方案4：梯度洗脱程序设计见表10，芍药种子样品色谱图见图6，各成分峰分离情况见表11。
表10方案4的梯度洗脱程序
表11方案4的八种激素色谱分离情况
注：色谱峰的分离度达到1.5以上视为两个色谱峰完全分离
由图6及表11可知：8种激素中，仅吲哚丁酸(IBA)能有效分离，其他成分均未达到分离要求，尤其是玉米素(ZT)、激动素(KT)、赤霉素(GA)分离效果差。
方案5：梯度洗脱程序设计见表12，芍药种子样品色谱图见图7，各成分峰分离情况见表13。
表12方案5的梯度洗脱程序
表13方案5的八种激素色谱分离情况
注：色谱峰的分离度达到1.5以上视为两个色谱峰完全分离
由图7及表13可知：8种激素中，仅赤霉素(GA)、水杨酸(SA)能有效分离，其他成分均未达到分离要求，尤其是玉米素(ZT)、反式玉米素核苷(ZR)分离效果差。
方案6：梯度洗脱程序设计见表14，芍药种子样品色谱图见图2，各成分峰分离情况见表15。
表14方案6的梯度洗脱程序
表15方案6的八种激素色谱分离情况
注：色谱峰的分离度达到1.5以上视为两个色谱峰完全分离
由图2及表15可知：只有在本发明优化的方案6的梯度洗脱系统下，8种激素均能有效分离，分离度好，且整体峰都可以。
因此，最终确定的洗脱程序为方案6。
综上，本发明通过对色谱条件的优化，可以同时测定芍药种子中8种内源激素，包括玉米素(ZT)、反式玉米素核苷(ZR)、激动素(KT)、赤霉素(GA)、吲哚乙酸(IAA)、水杨酸(SA)、脱落酸(ABA)以及吲哚丁酸(IBA)的含量，为芍药种子的休眠机理研究、促进种子萌发提供了有效的理论依据。
Claims (8)
1.一种同时测定芍药种子中多种内源激素含量的HPLC方法，其特征在于：步骤如下：
a、制备供试品溶液：
取芍药种子粉末，以甲醇为溶剂提取，离心、浓缩，再分别经石油醚、乙酸乙酯萃取，浓缩，用流动相溶解、过滤，得供试品溶液；
b、制备对照品溶液：
取各激素对照品，混合，加乙腈溶解，配制成混合对照品溶液；
c、分别将供试品溶液和对照品溶液注入高效液相色谱仪检测，色谱条件如下：
色谱柱：C18色谱柱；
流动相：流动相A为体积分数为0.1％的磷酸水溶液，B为乙腈，梯度洗脱程序为：0.01～15min，5％～15％B；15～20min，15％～25％B；20～40min，25％～35％B；40～45min，35％～90％B；45～50min，90％B；
检测波长：分别为210nm和254nm；
d、根据检测结果计算得到芍药种子中的各激素含量；所述内源激素为玉米素、反式玉米素核苷、激动素、赤霉素、吲哚乙酸、水杨酸、脱落酸和吲哚丁酸。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤a中，以甲醇为溶剂提取的方法为：取芍药种子粉末2重量份，加入体积分数为80％的甲醇溶液5体积份、石英砂0.02重量份及PVPP0.02重量份，研磨后，加入甲醇15体积份，4℃放置24h。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤a中，所述离心的条件为4℃，10000r/min离心10min。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤c中，所述色谱柱的规格为：内径4.6mm，长度250mm，填料粒径5μm。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：色谱柱型号为Agilent Eclipse XDB-C18色谱柱。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤c中，所述梯度洗脱程序为：0.01～15min，5％B；15～20min，15％B；20～40min，25％B；40～45min，35％B；45～50min，90％B。
7.根据权利要求1-6任意一项所述的方法，其特征在于：所述色谱条件的柱温为35℃；流速为1.0mL/min。
8.根据权利要求1-6任意一项所述的方法，其特征在于：所述供试品溶液的进样量为10μL。
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