CN107389839A - 一种油茶脂肪酸快速甲酯化的方法 - Google Patents

Abstract

本发明是一种油茶脂肪酸快速甲酯化的方法。将氢氧化钠‑甲醇溶液加入粉末样品中，混合均匀，用正庚烷将其甲酯化，完成反应。本发明操作简单，耗时少，样品用量少，只需要0.01g～0.1g样品就可以在50min内简单快速的完成油茶材料中脂肪酸甲酯化检测，比普通方法耗时减少约10倍，样品用量减少约50倍。本发明不仅解决了现有技术在油茶脂肪酸甲酯检测过程使用的先提取，再进行甲酯化的方法所带来的样品需量大、操作繁杂且耗时长等技术问题，而且为遗传转化后的油茶材料利用愈伤组织、叶片进行表型检测提供了重要技术支撑，为实现油茶分子育种奠定重要基础。

Description

一种油茶脂肪酸快速甲酯化的方法

技术领域

本发明属于油茶脂肪酸的分析方法技术领域，具体涉及一种油茶脂肪酸快速甲酯化方法。

背景技术

油茶(Camellia oleifera)是我国特有的木本食用油料树种，在我国林业产业建设、生态建设、食用植物油安全保障及国民健康水平提高等方面具有非常重要的作用。党和政府十分重视油茶产业的发展，把发展油茶等木本油料产业作为缓解我国食用植物油安全的重要途径。茶油不饱和脂肪酸含量高达90％以上，油酸含量约80％，还含有角鲨烯等稀有保健成分，茶油和橄榄油被联合国粮农组织推荐为最佳食用植物油，长期食用茶油有利于提高国民的健康水平。但是茶油中α-亚麻酸的含量仅为0.3％-0.4％，α-亚麻酸是只在植物体内合成的三价不饱和脂肪酸，是n-3多不饱和脂肪酸中唯一的人体必需的脂肪酸，在人体中不能自身合成，必须从食物中摄取，它具有降血脂血压、预防心脑血管疾病、增强智力等多方面的功能和作用。同时还发现，油茶产业普遍存在着单位面积产量低和经济效益差两大问题，中国共有油茶林4531.2万亩，年产茶油仅20多万吨，平均亩产茶油仅5.8kg，主要原因是良种化程度低，品种混乱，以及油茶炭疽病等重要病害影响生长发育。因此，可以通过油茶遗传转化体系，利用分子设计育种改善茶油性质而获得高含量的α-亚麻酸油茶植株或者改善油茶抗病能力而获得抗病植株，对于进一步提高茶油的保健品质和油茶植株的抗病能力具有重大的科学意义和产业开发价值。

对油茶油脂发育过程中脂肪酸的检测是改善茶油品质和提高茶油产量的重要工作；而植物的抗病能力与叶片脂肪酸密切相关。就前期的研究来看，油茶脂肪酸常规检测工作首先都要利用石油醚浸染和索式抽提仪器将油脂抽提出来，或者利用压榨技术提取油脂，之后，再进行脂肪酸甲酯化检测。这种常规检测工作所需样品量大，成本高，耗时长，操作复杂，不能对油脂含量低而无法提取油脂的油茶种仁、叶片或愈伤组织等材料进行检测，进而影响对油茶的种仁发育及油茶遗传转化的筛选。因此，非常需要一种无需提取油脂，且样品用量少，耗时少，操作简单的脂肪酸甲酯化检测方法，更为精确的检测油茶种仁油脂发育过程的变化，为茶油品质的改善提供重要依据；同时，应用这种方法不仅可以对实生苗或组培苗叶片脂肪酸进行检测，而且还可以对早期遗传转化体系获得的愈伤组织、叶片进行表型检测，大大减少了油茶遗传转化工作，这为油茶的转基因研究提供了一种重要技术手段。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术的不足，提供一种免去繁琐的油脂提取步骤，而且原料用量很少，反应更为快速的脂肪酸甲酯化方法，该方法处理原料得到的产物完全不影响对油茶脂肪酸甲酯进行定性定量分析和检测。

为了实现上述目的，本发明采取的技术方案为：

一种油茶脂肪酸快速甲酯化方法，将氢氧化钠-甲醇溶液加入油茶粉末样品中，混合均匀后静置，用正庚烷将油茶脂肪酸甲酯化，完成反应。

所述的油茶脂肪酸快速甲酯化方法：粉末样品的用量为0.01-0.1g，优选0.05-0.1g。。

所述的油茶脂肪酸快速甲酯化方法：所述的油茶粉末样品包括种仁、叶片或者愈伤组织，样品粉碎至50～100目。

所述的油茶脂肪酸快速甲酯化方法：氢氧化钠-甲醇溶液的加入比例为5-10ml氢氧化钠-甲醇溶液/0.1g末样品，优选5ml氢氧化钠-甲醇溶液/0.1g粉末样品。

所述的油茶脂肪酸快速甲酯化方法：甲醇溶液中氢氧化钠的质量百分比为5-15％。

所述的油茶脂肪酸快速甲酯化方法：甲醇溶液中氢氧化钠的质量百分比优选为8-12％，进一步优选为10％。

所述的油茶脂肪酸快速甲酯化方法：混合均匀后静置反应10-60min，优选30分钟。

所述的油茶脂肪酸快速甲酯化方法：按照0.1g粉末样品/5ml-10ml正庚烷的比例，进行甲酯化，1-10min完成反应，优选2-10min，进一步优选5min。

本发明使用微量的样品粉末，在碱催化下直接用甲醇进行萃取，用正庚烷甲酯化，获取脂肪酸甲酯可用于气相色谱等分析。

本发明与现有技术相比具有如下优点：

1、样品使用量少，0.01-0.1g粉末即可检测；

2、无需提取茶油，减少了操作步骤；

3、操作简单，大大的减少了成本；

4、利用碱化甲醇浸染提高反应速度和脂肪酸甲酯化率的要求；

5、缩短样品甲酯化时间，50min左右完成检测大大的节省了时间成本。

6、本发明处理原料得到的产物完全不影响用于对茶油脂肪酸甲酯进行定性定量分析和检测。

7、本发明可以提前在表型上检测油茶转基因愈伤组织或苗子。

本发明首次提供一种油茶脂肪酸快速甲酯化提取的新工艺，即用有机溶剂抽提油脂，然后再用有机溶剂对脂肪酸进行甲酯化。采用本工艺，对设备要求低，与传统工艺相比，该工艺操作简单，成本低、速度快、对环境污染小，具有很好的科研价值。

附图说明

图1为油茶种仁不同发育时期脂肪酸成分的常规检测气相色谱图(实施例1的结果)；

图2-4为本发明不同实验条件组合油茶种仁粉末脂肪酸快速甲酯化气相色谱图(实施例2的结果)；

图5为本发明不同发育时期油茶种仁粉末脂肪酸快速甲酯化气相色谱图(实施例3的结果)；

图6为本发明不同油茶材料粉末脂肪酸快速甲酯化气相色谱图(实施例4的结果)。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。

油茶品种：‘华硕’

油茶干粉末的获得：取一定量的种子、叶片或者愈伤组织放在60℃烘箱中烘干至恒重，种子需去除外壳，将样品放至研磨中磨成粉末即可。

实施例1

选用了油茶‘华硕’品种不同发育期种仁考察茶油常规的脂肪酸检测。

1、茶油提取：

(1)按索氏的滤纸筒的粗细要求做好若干滤纸筒，用棉线绑紧，线头要短，滤纸筒编好号，纸筒底部要塞上脱脂棉，用铅笔塞好，防止油茶种仁粉抽提过程中漏出。

(2)根据索氏的每个样品重量要求4g≤G≦6g，每个品种的3次重复的样品总量要18克左右才能满足实验的需求。称出每个品系种子的重量，记录品种名和数据。再将种子的种壳去掉，称出种仁的重量记录，用粉碎机分别打磨至50～100目。

(3)每一品种的种仁粉用编好号的两个滤纸筒称出3份，每个滤纸筒装5g的样品粉，称量时要注意把了小量杯和滤纸筒的重量归零，记录种仁粉的重量。然后将装有种仁试样粉的滤纸筒上部用铅笔塞好棉花，封住开口，再用棉线绑紧，线头要短。

(4)每次将索氏的抽滤筒洗干净烘干后，待凉后称量，称出其重量并记录。将装有样品的滤纸筒对应的装进索氏的试样筒，将其拉上去。分别加入50ml的石油醚，再将其放到索氏的抽滤筒位置，拉下拉杆，检查抽滤筒拧紧后，打开阀门，放下试样筒，使试样侵入石油醚，进行抽提。

(5)索氏主要有三个提取时间，第一个提取时间是将试样在温度90℃下浸提4h，运行完毕后将试样拉上来。第二个提取时间是在温度90℃下喷淋抽提4h,运行完完毕后将关上阀门，使石油醚结束回流。第三个提取时间是使抽滤筒里的石油醚挥发到只剩下提取的油脂为止,提取温度90摄氏度。索氏的程序运行完后，抽滤筒里没有石油醚的味道后，将抽滤筒凉后称量其筒和油的重量，并记录。

2、茶油甲酯化

用移液管吸取约0.01g油样于锥形瓶中，用量筒量取40mL甲醇溶液于装有油样的锥形瓶中，加入0.5mol/l氢氧化钾-甲醇溶液与油样中，并加入几粒沸石，连接回流装置，在75℃水浴锅中加热回流30min，回流过程要不断摇动烧杯，直到溶液澄清为止，取出锥形瓶，冷却至室温。将烧瓶中的溶液转移到分液漏斗中，并用20ml正庚烷洗涤锥形瓶，将洗涤液也倒入分液漏斗中，再向分液漏斗加40ml蒸馏水，静置分层。再用20ml正庚烷萃取下层液，将其与酯层合并，再用20ml蒸馏水对酯相洗涤3次，直到废水呈中性为止。最后分离出酯相，收集到烧杯中。用无水硫酸钠干燥酯相，再倒入100ml容量瓶中，并定容。取1μl样品，用气相色谱仪进行分析(采用标准品比对)，结果表明油茶种仁中含有棕榈酸C16:0、硬脂酸C18:0、油酸C18:1、亚油酸C18:2Δ9,12、亚麻酸C18:3Δ9,12,15五种脂肪酸成分，不同发育时期脂肪酸成分之间的百分含量上有差异，其中油酸含量是随着种子成熟度的加深而提高的，饱和脂肪酸含量则随着种子成熟度的加深而降低(如表1和图1)，整个过程耗时10h左右，样品用量5g左右，且花后25周(25WAF)的油茶种子油脂含量少，至少要采积50g(湿重)的种子才能获得5g种仁。

表1油茶种仁不同发育时期脂肪酸成分的常规检测

实施例2

选用了油茶‘华硕’品种6月份的种仁考察茶油脂肪酸快速甲酯化检测的可行性。

分别称取25周的种仁粉末0.01g-0.1g置于50ml离心管中，分别加入10ml的5％-15％氢氧化钠-甲醇溶液，旋涡震动10min，静置10-60min。待反应完成后，分别加入5ml正庚烷，轻轻将溶液混匀，静置1-10min后分层，取0.5ml上层液于1.5ml离心管中，14000rpm离心5min，取1μl上层液上气相色谱仪对其脂肪酸甲酯成分进行分析(采用标准品比对)，具体实验条件组合见表2编号1-9。结果发现茶油脂肪酸快速甲酯化检测反应的优选实验条件：质量0.1g，氢氧化钠-甲醇溶液浓度10％，静置反应30min，甲酯化反应5min。该优选条件下茶油脂肪酸甲酯化效果最好，反应进行得最彻底，且无杂质，不影响茶油性质(如表2和图2-4)。

表2不同实验条件组合对茶油脂肪酸甲酯化效果的影响

实施例3

选用了油茶‘华硕’品种不同发育期种仁考察茶油脂肪酸快速甲酯化检测的可行性。

分别称取花后25周(25WAF)、35周(35WAF)、45周(45WAF)、55周(55WAF)的种仁粉末0.1g置于50ml离心管中，分别加入10ml的10％氢氧化钠-甲醇溶液，旋涡震动10min，静置30min。待反应完成后，分别加入5ml正庚烷，轻轻将溶液混匀，静置5min后分层，取0.5ml上层液于1.5ml离心管中，14000rpm离心5min，取1μl上层液上气相色谱仪对其脂肪酸甲酯成分进行分析(采用标准品比对)。结果发现根据优选的实验条件，在50min内完成茶油脂肪酸甲酯化反应，且不改变茶油的性质(如表3和图5)。

表3不同发育时期油茶种仁粉末脂肪酸甲酯含量比较结果

实施例4

选用了油茶‘华硕’品种的一年生实生苗叶片、继代培养一年的组培苗叶片、由叶片诱导培养三个月的愈伤组织考察油茶脂肪酸快速甲酯化检测的可行性。

分别称取实生苗叶片和组培苗叶片的0.1g粉末置于50ml离心管中，分别加入10ml的10％氢氧化钠-甲醇溶液，旋涡震动10min，静置30min。待反应完成后，分别加入5ml正庚烷，轻轻将溶液混匀，静置5min后分层，取1ml上层液于1.5ml离心管中，分别加入500μl体积的黑炭粉末，充分混匀后14000rpm离心5min，取上层液重复离心3次，最后取1μl上层液上气相色谱仪对其脂肪酸甲酯成分进行分析(采用标准品比对)。结果发现实生苗叶片、组培苗叶片和愈伤组织中只有棕榈酸C16:0、油酸C18:1、亚油酸C18:2Δ9,12、亚麻酸C18:3Δ9,12,15四种脂肪酸，其中实生苗叶片中棕榈酸C16:0的百分含量最高，其次是亚麻酸C18:3Δ9,12,15，而组培苗叶片和愈伤组织中亚麻酸C18:3Δ9,12,15含量最高(如表4)，从分析的峰图看在同等质量的样品中(如图6)，实生苗叶片所含脂肪酸含量最多，而组培苗叶片和愈伤组织相似，相对较少，这与实生苗的抗逆性比组培苗要强有关系。

表4不同油茶材料粉末脂肪酸甲酯含量比较结果

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (8)

1.一种油茶脂肪酸快速甲酯化的方法，其特征在于：

将氢氧化钠-甲醇溶液加入油茶粉末样品中，混合均匀，静置，用正庚烷将油茶脂肪酸甲酯化，完成反应。

2.根据权利要求1所述的油茶脂肪酸快速甲酯化的方法，其特征在于：粉末样品的用量为0.01-0.1g，优选0.05-0.1g。

3.根据权利要求1所述的油茶脂肪酸快速甲酯化的方法，其特征在于：所述的油茶粉末样品包括种仁、叶片或者愈伤组织，样品粉碎至50-100目。

4.根据权利要求1或2或3所述的油茶脂肪酸快速甲酯化的方法，其特征在于：氢氧化钠-甲醇溶液的加入比例为5-10ml氢氧化钠-甲醇溶液/0.1g粉末样品，优选5ml氢氧化钠-甲醇溶液/0.1g粉末样品。

5.根据权利要求4所述的油茶脂肪酸快速甲酯化的方法，其特征在于：甲醇溶液中氢氧化钠的质量百分比为5-15％。

6.根据权利要求5所述的油茶脂肪酸快速甲酯化的方法，其特征在于：甲醇溶液中氢氧化钠的质量百分比优选为8-12％，进一步优选为10％。

7.根据权利要求1所述的油茶脂肪酸快速甲酯化的方法，其特征在于：混合均匀后静置反应10-60min，优选30min。

8.根据权利要求1所述的油茶脂肪酸快速甲酯化的方法，其特征在于：按照0.1g粉末样品/5ml-10ml正庚烷的比例，进行甲酯化，1-10min完成反应，优选2-10min，进一步优选5min。