CN102706974A

CN102706974A - 草地早熟禾脂肪酸含量测定方法

Info

Publication number: CN102706974A
Application number: CN2012101450529A
Authority: CN
Inventors: 许立新; 韩烈保; 黄炳茹
Original assignee: Beijing Forestry University
Current assignee: Beijing Forestry University
Priority date: 2012-05-10
Filing date: 2012-05-10
Publication date: 2012-10-03

Abstract

本发明提供了一种草地早熟禾脂肪酸含量测定方法，包括以下步骤：(1)取草地早熟禾叶片组织于玻璃瓶中；(2)加入含十七烷酸的硫酸；(3)排空玻璃瓶内空气、密封，水浴或金属浴；(4)冷却，加入氯化钠溶液和正己烷，涡旋、离心；(5)取离心后的上层油相，入GC-MS分析，根据样品峰图计算脂肪酸的含量。本发明提供的方法克服了样品间脂类提取效率不一致的问题，优化所需检测样品的植物组织样品量，节省甲酯化过程中的一系列试剂用量；简化了甲酯化的操作步骤，节约了上样之后GC-MS的检测分析时间；克服草地早熟禾甲酯化过程中碳化严重的问题，是一种低成本，快速，简单，高效的草地早熟禾脂肪酸分析方法。

Description

草地早熟禾脂肪酸含量测定方法

技术领域

本发明涉及脂肪酸的含量测定方法，具体地，涉及草地早熟禾脂肪酸含量测定方法。

背景技术

目前测定植物脂肪酸含量的方法技术多集中在油料作物，以及植物组织中的种子部分。关于植物叶片组织的脂肪酸含量的测定方法国外有拟南芥、菠菜等叶片组织脂肪酸含量的测定方法比较成熟。这些方法概况起来分为油脂提取、皂化和甲酯化三个主要步骤，所需试剂种类多，步骤繁复，花费时间长。

草地早熟禾(Poa Pretensis)属于多年生草本植物，须根系，具有根状茎，叶色青绿，观赏效果好，根茎繁殖，再生力强，耐修剪，抗寒能力强，耐旱性稍差，耐践踏，是非常重要的草坪草和牧草草种。在北方及中部地区，南方部分冷凉地区广泛用于公园、机关、学校、居住区、运动场等地绿化。其特性是喜冷凉湿润的气候，在我国北方部分地区，可保持较长的绿期，可在一定程度上满足园林四季常青的要求。但草地早熟禾对高温和干旱条件不适应，在北方夏季高温条件下，易感病，故该草种对种植管理要求较高，需要较高的水分、养分等投入。

草地早熟禾的耐旱性和其不饱和脂肪酸含量相关，科研工作者可通过不饱和脂肪酸含量的比较结果，不饱和脂肪酸含量较高的品种耐旱性也较好。可以通过选育、培育耐旱品种，以满足高温、干燥地区园林绿化的需要。因此，能够简易快速准确地测定草地早熟禾各脂肪酸的含量成为一个亟待解决的问题。

关于草地早熟禾叶片组织脂肪酸含量的测定方法，在现有技术中是一个空白。

发明内容

本发明的目的在于提供一种草地早熟禾脂肪酸含量测定方法。

本发明提供的草地早熟禾脂肪酸含量测定方法，包括以下步骤：

(1)取草地早熟禾新鲜叶片组织于玻璃瓶中；

(2)加入含十七烷酸的硫酸；

(3)排空玻璃瓶内空气、密封，水浴或金属浴；

(4)冷却，加入氯化钠溶液和正己烷，充分摇匀，离心；

(5)取离心后的上层油相，入GC-MS仪器分析，根据样品峰图计算脂肪酸的含量。

其中，步骤1)所述的叶片组织为0.2±0.02g全部展开的叶片组织，将其处理为小于1cm的叶段置于玻璃瓶中。

其中，步骤2)所述的硫酸浓度为1N(0.5mol/L)，硫酸与十七烷酸的体积质量比为1mL:0.1mg；加入硫酸与叶片组织的体积质量比为1mL:0.2g。

本发明的0.5mol/L硫酸是用甲醇稀释浓硫酸获得的。

其中，步骤3)所述水浴或金属浴的温度为60~80℃，时间为90~120min。

优选地，步骤3)所述水浴或金属浴的温度为80℃，时间为90min。

其中，步骤4)所述的冷却温度为-20～-10℃，冷却5~15min。

优选地，冷却温度为-20℃，冷却时间10min。

其中，步骤4)所述氯化钠溶液浓度为0.9%，其加入量与叶片组织的体积质量比为1.5mL:0.2g。

其中，步骤4)所述正己烷加入量与加入硫酸体积比例为1mL：0.2mL。

其中，步骤4)所述离心为1500~3000rpm，2-5min。

其中，步骤5)取1~3μL上层油相，入GC-MS仪器分析。

优选地，步骤5)取1μL上层油相，入GC-MS仪器分析。

在本发明的一个实施例中，使用气相色谱-质谱仪HP GG-MS(HP 6890GC和HP 5973MS)，采用60-mHP-5MS毛细管柱子，内直径0.25mm，气相色谱仪的程序参数设置如下：170℃10min，上升到220℃10min，气相流速1mL min^–1。用注射器注入1μL上层油相之后，启动程序。1个样品的脂类分析持续时间大约为40min。

通过气相质谱联仪分析，与标准质谱数据库对比分析确定甲酯化脂肪酸的名称，并得到每个样品的峰图。采用内参法，即十七烷酸17:0的重量和质谱分析图上的峰面积计算其他脂肪酸的含量百分比。

草地早熟禾主要脂肪酸种类如下：

16:0棕榈酸，饱和脂肪酸；

16:1棕榈油酸，不饱和脂肪酸；

18:0硬脂酸，饱和脂肪酸；

18:2亚油酸，不饱和脂肪酸；

18:3亚麻酸，不饱和脂肪酸。

(注：分号前边数字代表脂肪酸碳链的长度，即碳原子的个数，分号后边代表碳链双键的个数)

假设某特定脂肪酸的重量含量为X μg，则其计算公式为：

X/Ax=100/A17:0，X=100×Ax/A17:0

公式中的A指代峰面积，Ax为某含量为X的脂肪酸的峰面积，A17:0为内参的峰面积。

所有脂肪酸重量含量之和Wt(单位μg)=W16:0+W16:1+W18:0+W18:2+W18:3

则某特定脂肪酸含量的百分比Px为：

Px=X/Wt×100%

本发明通过将草地早熟禾脂肪酸甲酯化，用GG-MS分析，通过上述公式计算得到各脂肪酸含量。

本发明还提供了上述测定方法在选育耐旱性草地早熟禾品种中的应用。

本发明提供的方法克服了样品间脂类提取效率不一致的问题，优化所需检测样品的植物组织样品量，节省甲酯化过程中的一系列试剂用量；简化了甲酯化的操作步骤，节约了上样之后GC-MS的检测分析时间；克服草地早熟禾甲酯化过程中碳化严重的问题，是一种低成本，快速，简单，高效的草地早熟禾脂肪酸分析方法。本发明通过摸索甲酯化过程每个步骤方法，克服了样品间脂类提取效率不一致以及碳化现象严重的问题，水浴或金属浴的条件控制为80℃，时间为90min，这个条件能够降低草地早熟禾叶片组织的碳化率，有利于后续实施步骤中的油相分离，减少干扰。本发明简化了草地早熟禾脂肪酸分析步骤，把脂类提取和皂化过程简为一个步骤完成，节约了所需试剂的使用量，是一种快速、高效的草地早熟禾脂肪酸含量分析方法。

具体实施方式

以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。

若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，实施例中所用的试剂，均为市售。

实施例1草地早熟禾脂肪酸甲酯化处理

1、脂类甲酯化前期准备

溶液试剂的准备：用甲醇稀释硫酸到1N(1mol/L H⁺)H₂SO₄。配制0.9%的NaCl溶液。准备好色谱纯级正己烷，十七烷酸(17:0)待用。

2、脂类甲酯化过程

取草地早熟禾0.2g新鲜叶片组织，迅速用剪刀把叶片剪短到1cm的长段，放入带盖子的测试玻璃瓶中。加入1mL 1N H₂SO₄，含有100μg的十七烷酸(17:0)作为内参，用氮吹仪N₂轻吹，赶走空气，迅速拧紧瓶盖。80℃水浴，加热90min，完成脂肪酸甲酯化过程。

3、脂类甲酯化后期处理

放入-20℃冰箱冷却10分钟。加入1.5mL 0.9%NaCl和200μL正己烷(Hexane，Sigma 34859)，充分摇匀，离心5min，转速1500rpm。用10μL量程的玻璃注射器，小心吸取上层油相，推进1μL入GC-MS进样器，用于GC-MS分析。

实施例2草地早熟禾脂肪酸甲酯化处理

1、脂类甲酯化前期准备

2、脂类甲酯化过程

取草地早熟禾0.2g新鲜叶片组织，迅速用剪刀把叶片剪短到0.8cm的长段，放入带盖子的测试玻璃瓶中。加入1mL 1N H₂SO₄，含有100μg的十七烷酸(17:0)作为内参，用氮吹仪N₂轻吹，赶走空气，迅速拧紧瓶盖。60℃金属浴，加热120min。完成脂肪酸甲酯化过程。

3、脂类甲酯化后期处理

放入-20℃冰箱冷却15分钟。加入1.5mL 0.9%NaCl和200μL正己烷(Hexane，Sigma 34859)，涡旋20sec,离心2min，转速3000rpm。用10μL量程的玻璃注射器，小心吸取上层油相，推进3μL入GC-MS进样器，用于GC-MS分析。

实施例3GC-MS分析草地早熟禾脂肪酸

1、脂类含量分析：

将实施例1处理过的样品使用气相色谱-质谱仪HP GG-MS(HP6890GC and HP 5973MS)，采用60-mHP-5MS毛细管柱子，内直径0.25mm，气相色谱仪的程序参数设置如下：170℃10min，上升到220℃10min，气相流速1mL min^–1。注射器注入样品之后，启动程序。1个样品的脂类分析持续时间约为40分钟。

2、通过气相质谱分析，得到每个样品的峰图。采用内参法，即十七烷酸17:0的重量和质谱分析图上的峰面积计算其他脂肪酸的含量百分比。

草地早熟禾脂主要肪酸种类如下：

16:0棕榈酸，饱和脂肪酸；

16:1棕榈油酸，不饱和脂肪酸；

18:0硬脂酸，饱和脂肪酸；

18:2亚油酸，不饱和脂肪酸；

18:3亚麻酸，不饱和脂肪酸。

假设某特定脂肪酸的重量含量为Xμg，则其计算公式为：

X/Ax=100/A17:0，X=100×Ax/A17:0

所有脂肪酸重量含量之和Wt(单位μg)=W16:0+W16:1+W18:0+W18:2+W18:3

则某特定脂肪酸含量的百分比Px为：

Px=X/Wt×100%

实施例4本发明方法与常规方法的对比试验

一、本发明方法

1、用甲醇稀释硫酸到1N(1mol/L H⁺)H₂SO₄。配制0.9%的NaCl溶液。准备好色谱纯级正己烷，十七烷酸(17:0)待用。

植物材料的准备：剪取3份草地早熟禾品种‘Midnight’(来源于美国新泽西州立罗格斯大学II农场，邮编08901，地址：59Dudley RD，New Brunswick，New Jersey，USA。)3份新鲜叶片样品，命名M1，M2，M3，3份品种‘Brilliant’(来源同品种‘Midnight’)新鲜叶片组织，命名为B1，B2，B3。M1，M2，M3，B1，B2，，B3分别放入6个玻璃测试瓶中。样品重量见表1。

表1样品重量

Figure 2012101450529100002DEST_PATH_IMAGE001

2、每个玻璃测试瓶中，都加入1mL 1N H₂SO₄，含有100μg的十七烷酸(17:0)作为内参，用氮吹仪N₂轻吹，赶走空气，迅速拧紧瓶盖。80℃水浴，90分钟。

3、放入-20℃冰箱冷却10分钟。

4、从冰箱中取出，加入1.5mL 0.9%NaCl和200μL正己烷(Hexane，Sigma 34859)，涡旋20sec,离心2min，转速2000rpm。

5、用10μL量程的玻璃注射器，小心吸取上层油相，推进1μL入GC-MS进样器，用于GC-MS分析。

6、通过气相质谱分析，得到每个样品的质谱数据库比对后结果。采用内参法，利用17:0的重量计算其他脂肪酸的含量百分比。6个样品经过GC-MS分离和质谱数据库的比对，确定脂肪酸类别名称和峰面积，结果如下表2：

表2各样品中脂肪酸的峰面积

Figure 2012101450529100002DEST_PATH_IMAGE002

Figure 2012101450529100002DEST_PATH_IMAGE003

7.根据公式X=100×Ax/A17:0，和步骤6.中所述各个脂肪酸的峰面积结果，由内参17:0重量为100μg来计算其他脂肪酸的重量。

以M1为例子，16:0(μg)的重量为：100×11.68/3.65=320μg;

16:1(μg)的重量为：100×1.1/3.65=30.14μg;

18:0(μg)的重量为：100×0.52/3.65=14.25μg;

18:2(μg)的重量为：100×12.73/3.65=348.76μg;

18:3(μg)的重量为：100×57.98/3.65=1588.48μg。

M1样品的脂肪酸总量为：Wt=320+30.14+14.25+348.76+1588.48=2301.622μg。

其他5个样品，同样方法可得各个脂肪酸重量，如表3所示：

表3待测样品中各脂肪酸含量检测结果（μg）

Figure 2012101450529100002DEST_PATH_IMAGE004

根据上表，每种脂肪酸的百分比含量即可除以总量得出样品每种脂肪酸的百分比含量，如表4：

表4待测样品中各脂肪酸含量(%)

二、常规方法

1、脂类提取：采集草地早熟禾‘Midnight’和‘Brilliant’新鲜叶片各两个样品，命名为：M4，M5，M6，B4，B5，B6质量分布如下表。

表5对比试验样品重量

Figure 2012101450529100002DEST_PATH_IMAGE005

2、把新鲜组织样品放入研钵中，加入6mL氯仿：甲醇(1:1，v/v)，戴口罩，在通风工作橱里用研钵和研磨棒迅速研磨提取组织中的脂类(不超过15min)。

3、加入2.7mL的KCl-H₃PO₄溶液，浓度为(2M KCl，0.2M H₃PO₄)迅速研磨离心，取油相放于新管中。

4、皂化：加入2mL 10%KOH(用甲醇/水，比例为4/1稀释)，水浴80℃加热90min。

甲酯化恢复：加入1mL 1.8M H₂SO₄。

5、分两次加入总体积为300μL(含有100ug 17:0作为内参)的正己烷，N₂轻吹，在此过程中，吹重氮甲烷进行甲酯化过程。N₂继续轻吹，确保去除其他气体，拧紧玻璃瓶盖。

6、注射器取3μL油相，用于GC-MS上样分析。

7、通过气相质谱分析，得到每个样品的质谱数据库比对后结果。采用内参法，利用17:0的重量计算其他脂肪酸的含量百分比。6个样品经过GC-MS分离和质谱数据库的比对，确定脂肪酸类别名称和峰面积，结果如下表6：

表6对比试验中各样品中脂肪酸的峰面积

8、根据公式X=100×Ax/A17:0，和上一步骤中所述各个脂肪酸的峰面积结果，由内参17:0重量为100μg来计算其他脂肪酸的重量。如表7所示：

表7待测样品中各脂肪酸含量检测结果（μg）

根据上表，每种脂肪酸的百分比含量即可除以总量得出样品每种脂肪酸的百分比含量，如表8：

表8对比试验样品中各脂肪酸含量(%)

对结果利用统计学软件SAS进行多重比较分析，上述两种测量方法(本发明方法和常规方法)都可以应用于检测草地早熟禾脂肪酸含量品种间的差异性。具体来说，不饱和脂肪酸18:2和18:3的含量通过两种方法测定的结果无显著差异，但显示出显著品种差异。

本实施例的检测结果说明，本发明方法能够简易快速地测定草地早熟禾各脂肪酸的含量，简化了常规脂类分析步骤，减少皂化甲酯化过程中药品使用量和使用种类(尤其是有毒有害气体重氮甲烷和氯仿的使用)，节约实验时间和待测叶片组织的使用量，且测定分析结果与常规脂类提取皂化方法一样，结果稳定可靠。可见本发明方法简化了草地早熟禾脂肪酸分析步骤，把脂类提取和皂化过程简为一个步骤完成，节约了所需试剂的使用量，是一种快速、高效的草地早熟禾脂肪酸含量分析方法。

Claims

1.一种草地早熟禾脂肪酸含量测定方法，包括以下步骤：

1)取草地早熟禾新鲜叶片组织于玻璃瓶中；

2)加入含十七烷酸的硫酸；

3)排空玻璃瓶内空气、密封，水浴或金属浴；

4)冷却，加入氯化钠溶液和正己烷，充分摇匀，离心；

5)取离心后的上层油相，入GC-MS仪器分析，根据样品峰图计算脂肪酸的含量。

2.如权利要求1所述的测定方法，其特征在于，步骤1)所述的叶片组织为0.2±0.02g全部展开的叶片组织，将其处理为小于1cm的叶段置于玻璃瓶中。

3.如权利要求1所述的测定方法，其特征在于，步骤2)所述的硫酸浓度为0.5mol/L，硫酸与十七烷酸的体积质量比为1mL∶0.1mg；加入硫酸与叶片组织的体积质量比为1mL∶0.2g。

4.如权利要求1所述的测定方法，其特征在于，步骤3)所述水浴或金属浴的温度为60～80℃，时间为90～120min。

5.如权利要求1所述的测定方法，其特征在于，步骤4)所述的冷却温度为-20～-10℃，冷却时间5～15min。

6.如权利要求1所述的测定方法，其特征在于，步骤4)所述氯化钠溶液浓度为0.9％，其加入量与叶片组织的体积质量比为1.5mL∶0.2g。

7.如权利要求1所述的测定方法，其特征在于，步骤4)所述正己烷加入量，与加入硫酸体积比例为1mL∶0.2mL。

8.如权利要求1所述的测定方法，其特征在于，步骤4)所述离心为1500～3000rpm，2～5min。

9.如权利要求1所述的测定方法，其特征在于，步骤5)取1～3μL上层油相，入GC-MS仪器分析。

10.如权利要求1～9任一所述的测定方法在选育耐旱性草地早熟禾中的应用。