CN110736795B - 一种基于靶向代谢组学的茶树鲜叶中代谢物空间分布的检测方法 - Google Patents

一种基于靶向代谢组学的茶树鲜叶中代谢物空间分布的检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明属于茶叶化合物检测技术领域，具体涉及一种基于靶向代谢组学的茶树鲜叶中代谢物空间分布的检测新方法。包括以下几个步骤：（1）茶树鲜叶的微尺度样品前处理；（2）茶树鲜叶中代谢物的提取；（3）对提取液进行化学衍生化；（4）基于靶向代谢组学的代谢物检测；（5）茶树鲜叶中代谢物空间分布的还原与可视化显示。采用本发明所述方法准确可靠、简单可行，可对茶树鲜叶中近50种代谢物的空间分布同时进行分析，对于茶树体内代谢物的合成与转运、茶树应对生物和非生物胁迫的研究等方面具有重要的意义。

Description

一种基于靶向代谢组学的茶树鲜叶中代谢物空间分布的检测 方法
技术领域
本发明属于茶叶化合物检测技术领域，更具体地说，涉及一种基于靶向代谢组学的茶树鲜叶中代谢物空间分布的检测新方法。
背景技术
茶是世界上最受欢迎的饮品之一，也是一种天然保健品。据统计，茶叶中含有450多种对人体有益的代谢物成分。了解代谢物在茶树鲜叶中的空间分布，对于研究代谢物在茶树鲜叶中如何进行生物合成和转运，以及茶树鲜叶如何对外界刺激进行应答，增强茶叶品质具有重要的意义。然而，目前缺乏茶树鲜叶中代谢物空间分布的检测方法，关于此方面的研究还非常少。现应用的茶树鲜叶代谢物空间分布的检测方法还有一些不足，如：利用质谱成像技术只能检测到少量高浓度的代谢物，需要昂贵的质谱仪器，并且化合物的离子化易受鲜叶表面蜡质层的影响；通过检测毫米级的碎片的代谢物还原出在该茶树鲜叶组织中的空间分布的方法，较难控制所需的高灵敏度；解吸电喷雾电离成像质谱方法可检测到的代谢物数量非常少。
发明内容
针对上述问题，本发明将靶向代谢组学方法与茶树鲜叶的微尺度制备相结合，采用高效液相-质谱联用技术，建立一种可对茶树鲜叶中的代谢物空间分布进行全面系统研究的检测新方法。该方法具有操作简便，成本低，覆盖的代谢物种类多等优点，具体技术方案如下：
一种基于靶向代谢组学的茶树鲜叶中代谢物空间分布的检测新方法，具体包括以下步骤：
(1)茶树鲜叶的微尺度样品前处理；
(2)茶树鲜叶中代谢物的提取：代谢物提取后高速离心，得到上清液即提取液；
(3)对提取液进行化学衍生化：将步骤(2)所述的提取液一分为二，对其中一份进行化学衍生化；
(4)基于靶向代谢组学对步骤(3)所述的两份提取液进行代谢物定量分析；
(5)茶树鲜叶中代谢物空间分布的还原与可视化显示。
所述的一种基于靶向代谢组学的茶树鲜叶中代谢物空间分布的检测方法，其特征在于所述步骤(1)中茶树鲜叶为茶树第1至第6叶。
所述的一种基于靶向代谢组学的茶树鲜叶中代谢物空间分布的检测方法，其特征在于所述步骤(1)中微尺度样品前处理为：利用手术刀和镊子将茶树鲜叶切割成相同边长的正方形小块，边长长度为1-3毫米，每个正方形小块在茶树鲜叶叶片中的位置进行记录编号，上述操作在冰上完成。
所述的一种基于靶向代谢组学的茶树鲜叶中代谢物空间分布的检测方法，其特征在于所述步骤(2)中代谢物提取为：将步骤(1)所述前处理后的茶树鲜叶放置于离心管中，以加入量50-200微升，浓度10-90％的乙腈水溶液为溶剂，温度20-90℃，时间5-60分钟，进行代谢物提取。
所述的一种基于靶向代谢组学的茶树鲜叶中代谢物空间分布的检测方法，其特征在于所述步骤(2)中离心条件为：离心机转速2000-15000转/分钟，时间3-20分钟。
所述的一种基于靶向代谢组学的茶树鲜叶中代谢物空间分布的检测方法，其特征在于所述步骤(2)中上清液一分为二即上清液等体积均匀分成两份。
所述的一种基于靶向代谢组学的茶树鲜叶中代谢物空间分布的检测方法，其特征在于步骤(3)中化学衍生所用的方法为丹磺酰氯衍生化：取其中一份提取液40微升于离心管中，加入50微升新鲜配制的10mg/ml丹磺酰氯乙腈溶液和30微升0.15mol/l的K2CO3/KHCO3缓冲溶液，pH为9.4，混匀后置于60℃水浴30分钟，然后以10000转/分钟的转速离心，时间5分钟，取上清液于进样瓶中等待检测分析。
所述的一种基于靶向代谢组学的茶树鲜叶中代谢物空间分布的检测方法，其特征在于步骤(4)中代谢物定量分析所用仪器为液相色谱串联质谱仪UPLC-TQSMicro；液相色谱条件为：Acquity UPLC BEH C18色谱柱，100×2.1mm，1.7μm，流动相为0.1％甲酸/水溶液和乙腈，流动相梯度设置如下：0分钟，10％B；3分钟，15％B；15分钟，65％B；19分钟，95％B；22分钟，95％B；22.5分钟，10％B；26分钟，10％B；流速0.35毫升/分钟，进样量5微升；所述质谱条件为：采用电喷雾离子源，离子化模式为正离子，电压为3kV，离子源加热温度设置为600℃，锥孔气流和脱溶剂气流分别设置为50和600升/小时。
所述的一种基于靶向代谢组学的茶树鲜叶中代谢物空间分布的检测方法，其特征在于所述步骤(4)中定量分析为基于外标曲线的定量分析。
所述的一种基于靶向代谢组学的茶树鲜叶中代谢物空间分布的检测方法，其特征在于所述步骤(5)中代谢物空间分布的还原为：根据每个正方形茶树鲜叶小块中代谢物的含量以及该正方形小块在茶树鲜叶叶片中的位置编号，还原出代谢物在整个茶树鲜叶叶片中的含量空间分布；可视化显示为：以热图的形式呈现代谢物在整个茶树鲜叶叶片中的含量空间分布。
本发明相比于茶树鲜叶中代谢物含量测定的现有技术，具有以下有益效果：
(1)可对茶树鲜叶中的代谢物种类进行全面的检测，覆盖了茶树鲜叶中近50种主要代谢物；
(2)对于茶树鲜叶中代谢物的检测不受鲜叶表面的蜡质层的影响；
(3)本发明结合了色谱分离技术，对于茶树鲜叶中的一些同分异构体也可以进行区分；
(4)可提供绝对定量的结果；
(5)该方法对所需仪器的性能要求较低、操作简便、成本低，在茶叶代谢物空间分布的检测与研究领域具有广阔的应用前景。
附图说明
图1是正常茶树叶片中代谢物的空间分布，其中绿色表示含量较高，白色表示含量较低。
图2是正常茶树叶片受针刺处理后叶片中代谢物的空间分布，其中红色表示含量较高，黑色表示含量较低。
具体实施方式
下面结合实施例作详细说明：本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
实施例1：
(1)茶树鲜叶的微尺度样品前处理：收集龙井43品种茶树鲜叶，位置为第一叶。利用手术刀和镊子将上述茶树鲜叶切割成边长为1.7毫米×1.7毫米的正方形小块，并将每个正方形小块在茶树鲜叶叶片中的位置进行记录编号，此操作在冰上完成。
(2)茶树鲜叶中代谢物的提取：将步骤(1)所述前处理后的茶树鲜叶放置于离心管中，以100微升50％乙腈水溶液为溶剂，提取温度20℃，提取时间30分钟进行茶树鲜叶中的代谢物提取；提取完成后高速离心，离心机转速10000转/分钟，时间10分钟，得到上清液即提取液。
(3)对提取液进行化学衍生化：将步骤(2)所述的提取液等体积均匀分成两份，各40微升，对其中一份进行化学衍生化，化学衍生所用方法为丹磺酰氯衍生化：取其中一份提取液40微升于离心管中，加入50微升新鲜配制的10mg/ml丹磺酰氯乙腈溶液和30微升0.15mol/l的K2CO3/KHCO3缓冲溶液，pH为9.4，混匀后置于60℃水浴30分钟，然后以10000转/分钟的转速离心，时间5分钟，取上清液于进样瓶中等待检测分析。
(4)基于靶向代谢组学对步骤(3)所述的两份提取液进行代谢物定量分析，代谢物定量分析所用仪器为液相色谱串联质谱仪UPLC-TQSMicro，液相色谱条件为：Acquity UPLCBEH C18色谱柱，100×2.1mm，1.7μm，流动相为0.1％甲酸/水溶液和乙腈，流动相梯度设置如下：0分钟，10％B；3分钟，15％B；15分钟，65％B；19分钟，95％B；22分钟，95％B；22.5分钟，10％B；26分钟，10％B；流速0.35毫升/分钟，进样量5微升；所述质谱条件为：采用电喷雾离子源，离子化模式为正离子，电压为3kV，离子源加热温度设置为600℃，锥孔气流和脱溶剂气流分别设置为50和600升/小时；定量分析为基于外标曲线的定量分析。茶树鲜叶中主要代谢物多反应监测(MRM)定量分析离子对列表，如表1所示。
(5)代谢物空间分布的还原：根据每个正方形茶树鲜叶小块中代谢物的含量结果以及该正方形小块在茶树鲜叶叶片中的位置编号，还原出代谢物在整个茶树鲜叶叶片中的含量空间分布；可视化显示：以热图的形式呈现代谢物在整个茶树鲜叶叶片中的含量空间分布，如图1。
表1是茶树鲜叶中主要代谢物多反应监测(MRM)定量分析离子对列表
Figure BDA0002237782920000051
Figure BDA0002237782920000061
Figure BDA0002237782920000071
实施例2：
(1)茶树鲜叶的微尺度样品前处理：收集龙井43品种茶树鲜叶，位置为第一叶，叶脉上2处地方进行针刺处理，针刺位置为图2圆圈处，然后放置30min。利用手术刀和镊子将上述茶树鲜叶切割成边长为1.7毫米×1.7毫米的正方形小块，并将每个正方形小块在茶树鲜叶叶片中的位置进行记录编号，此操作在冰上完成。
(2)茶树鲜叶中代谢物的提取：将步骤(1)所述前处理后的茶树鲜叶放置于离心管中，以100微升50％乙腈水溶液为溶剂，提取温度20℃，提取时间30分钟进行茶树鲜叶中的代谢物提取；提取完成后高速离心，离心机转速10000转/分钟，时间10分钟，得到上清液即提取液。
(3)对提取液进行化学衍生化：将步骤(2)所述的提取液等体积均匀分成两份，各40微升，对其中一份进行化学衍生化，化学衍生所用方法为丹磺酰氯衍生化：取其中一份提取液40微升于离心管中，加入50微升新鲜配制的10mg/ml丹磺酰氯乙腈溶液和30微升0.15mol/l的K2CO3/KHCO3缓冲溶液，pH为9.4，混匀后置于60℃水浴30分钟，然后以10000转/分钟的转速离心，时间5分钟，取上清液于进样瓶中等待检测分析。
(4)基于靶向代谢组学对步骤(3)所述的两份提取液进行代谢物定量分析，代谢物定量分析所用仪器为液相色谱串联质谱仪UPLC-TQSMicro，液相色谱条件为：Acquity UPLCBEH C18色谱柱，100×2.1mm，1.7μm，流动相为0.1％甲酸/水溶液和乙腈，流动相梯度设置如下：0分钟，10％B；3分钟，15％B；15分钟，65％B；19分钟，95％B；22分钟，95％B；22.5分钟，10％B；26分钟，10％B；流速0.35毫升/分钟，进样量5微升；所述质谱条件为：采用电喷雾离子源，离子化模式为正离子，电压为3kV，离子源加热温度设置为600℃，锥孔气流和脱溶剂气流分别设置为50和600升/小时；定量分析为基于外标曲线的定量分析。
(5)代谢物空间分布的还原：根据每个正方形茶树鲜叶小块中代谢物的含量结果以及该正方形小块在茶树鲜叶叶片中的位置编号，还原出代谢物在整个茶树鲜叶叶片中的含量空间分布；可视化显示：以热图的形式呈现代谢物在整个茶树鲜叶叶片中的含量空间分布，如图2。

Claims (7)

1.一种基于靶向代谢组学的茶树鲜叶中代谢物空间分布的检测方法，其特征在于包括以下步骤：
（1）茶树鲜叶的微尺度样品前处理，微尺度样品前处理为：利用手术刀和镊子将茶树鲜叶切割成相同边长的正方形小块，边长长度为1-3毫米，每个正方形小块在茶树鲜叶叶片中的位置进行记录编号，上述操作在冰上完成；
（2）茶树鲜叶中代谢物的提取：代谢物提取后高速离心，得到上清液即提取液；
（3）对提取液进行化学衍生化：将步骤（2）所述的提取液一分为二，对其中一份进行化学衍生化；
化学衍生所用的方法为丹磺酰氯衍生化：取其中一份提取液40微升于离心管中，加入50微升新鲜配制的10 mg/ml丹磺酰氯乙腈溶液和30微升0.15mol/l 的K2CO3/KHCO3缓冲溶液，pH为9.4，混匀后置于60℃水浴30分钟，然后以10000转/分钟的转速离心，时间5分钟，取上清液于进样瓶中等待检测分析；
（4）基于靶向代谢组学对步骤（3）的两份提取液进行代谢物定量分析；
代谢物定量分析所用仪器为液相色谱串联质谱仪UPLC-TQSMicro；液相色谱条件为：Acquity UPLC BEH C18色谱柱，100 × 2.1 mm，1.7 μm，流动相为0.1％甲酸/水溶液和乙腈，流动相梯度设置如下：0分钟，10% B；3分钟，15% B；15分钟，65% B；19分钟，95% B；22分钟，95% B；22.5分钟，10% B；26分钟，10% B；流速0.35 毫升/分钟，进样量5微升；质谱条件为：采用电喷雾离子源，离子化模式为正离子，电压为3 kV，离子源加热温度设置为600℃，锥孔气流和脱溶剂气流分别设置为50和600升/小时；
（5）茶树鲜叶中代谢物空间分布的还原与可视化显示。
2.根据权利要求1所述的一种基于靶向代谢组学的茶树鲜叶中代谢物空间分布的检测方法，其特征在于所述步骤（1）中茶树鲜叶为茶树第1至第6叶。
3.根据权利要求1所述的一种基于靶向代谢组学的茶树鲜叶中代谢物空间分布的检测方法，其特征在于所述步骤（2）中代谢物提取为：将步骤（1）所述前处理后的茶树鲜叶放置于离心管中，以加入量50-200微升，浓度10-90%的乙腈水溶液为溶剂，温度20-90℃，时间5-60分钟，进行代谢物提取。
4.根据权利要求1所述的一种基于靶向代谢组学的茶树鲜叶中代谢物空间分布的检测方法，其特征在于所述步骤（2）中离心条件为：离心机转速2000-15000转/分钟，时间3-20分钟。
5.根据权利要求1所述的一种基于靶向代谢组学的茶树鲜叶中代谢物空间分布的检测方法，其特征在于所述步骤（2）中上清液一分为二即上清液等体积均匀分成两份。
6.根据权利要求1所述的一种基于靶向代谢组学的茶树鲜叶中代谢物空间分布的检测方法，其特征在于所述步骤（4）中定量分析为基于外标曲线的定量分析。
7.根据权利要求1所述的一种基于靶向代谢组学的茶树鲜叶中代谢物空间分布的检测方法，其特征在于所述步骤（5）中代谢物空间分布的还原为：根据每个正方形茶树鲜叶小块中代谢物的含量以及该正方形小块在茶树鲜叶叶片中的位置编号，还原出代谢物在整个茶树鲜叶叶片中的含量空间分布；可视化显示为：以热图的形式呈现代谢物在整个茶树鲜叶叶片中的含量空间分布。
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GR01 Patent grant
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