CN105866300B - 一种氨基代谢物的测定方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种氨基代谢物的测定方法,其特征在于,对于10~20μl待测样品进行如下处理:(1)样品前处理;(2)还原处理:向前处理样品溶液中加入含有1~20mM三(2‑羧乙基)膦的硼酸缓冲溶液700~1400μl,得到还原后的样品溶液;(3)衍生化处理:向还原后的样品溶液加入衍生化试剂,衍生化氨基代谢物,固液分离其液相即衍生化样品溶液;(4)UPLC‑MS/MS检测:将衍生化样品溶液,用UPLC‑MS/MS方法多反应监测模式进行检测。本发明能够取得全面快速、可一次性检出还原型RSH和氧化型RSSR及检测限低灵敏度高等有益效果,尤其是在检测的广泛性和灵敏度方面实现质的飞跃。
Description
技术领域
本发明属于代谢组学领域,更具体地,涉及一种氨基代谢物的测定方法。
背景技术
氨基代谢物是一类具有生物活性含氮的低分子量有机化合物的总称,包括常见20种蛋白氨基酸、含巯基和二硫键氨基酸、多肽、儿茶酚胺、其它氨基酸及基衍生物、其它生物胺等。按照氢被取代的数目,可分为一级胺(伯胺)RNH2、二级胺(仲胺)R2NH、三级胺(叔胺)R3N、四级铵盐(季铵盐)R4N+X-。本发明主要涉及其中的一级胺和二级胺。氨基代谢物是代谢组学研究中重要的靶向代谢物,定量精准检测生物样品中含胺的代谢物对于生物研究和疾病标记物的发现尤为重要。例如,氨基酸及其衍生物是常见的生物标记物,谷胱甘肽具有清理自由基、抗氧化、抗衰老的重要生理作用,多巴胺是脑内极其重要的神经递质。由于氨基代谢物这类物质的重要功能和广泛分布,亟需一种针对氨基代谢物的全面快速、专一稳定、操作简便的精准定量测定方法,这对健康领域的基础研究具有显著意义。
氨基代谢物的测定方法应用于多个领域,包括临床诊断、生物医学、生物工程和食品科学等。目前市面上已有多种氨基酸商业化分析方法,主要是基于液相色谱-质谱的方法。氨基代谢物在进入液相色谱前需要进行衍生化步骤,主要起改善样品极性、增加紫外标记官能团和改善样品不稳定性的作用。氨基代谢物中,可以利用一级胺和二级胺的亲核性,对其进行衍生化处理。已报道的相关衍生化试剂很多种,主要是针对氨基代谢物中的常见氨基酸这一小类,且仍存在若干不足:(1)使用2,4-二硝基氯苯以及2,4-二硝基氟作为衍生化试剂,其衍生条件复杂苛刻,产物不稳定;(2)使用丹磺酰氯作为衍生化试剂,其衍生条件难以控制,对溶液环境pH值敏感,衍生产物不稳定,专一性差;(3)使用邻苯二甲醛(OPA)作为衍生化试剂,只能检测伯胺基氨基酸,不能检测脯氨酸类仲胺基氨基酸,且产物极不稳定;(4)使用9-氯甲酸芴甲酯(FMOC-Cl)作为衍生化试剂,FMOC-Cl水解产物FMOC-OH有荧光干扰,组氨酸和酪氨酸单、双衍生物比例不稳定,影响定量;(5)使用异硫氢酸苯酯(PITC)作为衍生化试剂,专属性差,需要排除水的干扰,不适用于水溶性样品的检测。目前对常见氨基酸的检测方法有很多种,也存在不足之处。离子交换色谱柱后衍生方法,检测时间长,仪器昂贵;液相色谱与紫外或荧光光学检测器联用,专属性差;气相色谱不适合热敏性氨基酸的检测;离子对色谱不需要衍生化,但易污染分析系统;毛细管电泳法重现性差。质谱(MS)方法具有高灵敏度高选择性等优点,与超高效液相色谱(UPLC)联用已广泛用于氨基酸的检测,可以实现快速高通量检测。
发明内容
针对现有技术的以上缺陷或改进需求,本发明提供了一种氨基代谢物的测定方法,其目的在于通过样品前处理及还原处理,区分样品中RSH化合物和RSSH化合物,同时结合衍生化步骤以及检测条件,拓宽检测范围提升检测,由此解决现有的检测技术检测种类有限、灵敏度不高的技术问题。
为实现上述目的,按照本发明的一个方面,提供了一种氨基代谢物的测定方法,其特征在于,对于10~20μl待测样品进行如下处理:
(1)样品前处理:
(1-1)向待检测的生物样品中加入浓度为1~5mM的N-乙基马来酰亚胺(NEM)磷酸缓冲溶液80~200μl,混匀室温反应1min至5min使得N-乙基马来酰亚胺与含自由巯基的氨基代谢物发生加成反应获得生物样品溶液;
(1-2)向步骤(1-1)中获取的生物样品溶液中加入浓度为0.1~1M的4-叔丁基苯硫酚的二甲基亚砜溶液或乙腈溶液10~20μl,室温反应1min至3min,去除生物样品溶液中多余的N-乙基马来酰亚胺,得到前处理样品溶液;
(2)还原处理:向步骤(1-2)中获取的前处理样品溶液中加入含有1~20mM三(2-羧乙基)膦的硼酸缓冲溶液700~1400μl,得到还原后的样品溶液;
(3)衍生化处理:向步骤(2)中获得的还原后的样品溶液加入衍生化试剂,衍生化氨基代谢物,固液分离其液相即衍生化样品溶液;
(4)UPLC-MS/MS检测:将步骤(3)获得的衍生化样品溶液,用UPLC-MS/MS方法多反应监测模式进行检测。
优选地,所述氨基代谢物的测定方法,其步骤(1-1)所述磷酸缓冲溶液含有质量分数8%~15%的二甲基亚砜。
优选地,所述氨基代谢物的测定方法,其步骤(1-1)所述磷酸缓冲溶液含有1~10mM的抗坏血酸和/或1~10mM的乙二胺四乙酸。
优选地,所述氨基代谢物的测定方法,其步骤(1-2)中加入的4-叔丁基苯硫酚与N-乙基马来酰亚胺的摩尔比在5:1至100:1之间。
优选地,所述氨基代谢物的测定方法,其步骤(2)所述硼酸缓冲溶液pH值在8至9之间,硼酸根浓度为200mM,含有1~20mM的抗坏血酸。
优选地,所述氨基代谢物的测定方法,其步骤(3)所述衍生化试剂为:6-氨基喹啉-N-羟基琥珀酰亚氨基氨基甲酸酯或5-氨基异喹啉基-N-羟基琥珀酰亚胺基氨基甲酸酯。
优选地,所述氨基代谢物的测定方法,其所述衍生化试剂为5-氨基异喹啉基-N-羟基琥珀酰亚胺基氨基甲酸酯,衍生化具体步骤如下:
向步骤(2)获得的还原后的样品溶液,加入200~400μL浓度在10mg/mL至30mg/mL之间的5-氨基异喹啉基-N-羟基琥珀酰亚胺基氨基甲酸酯的乙腈溶液,55℃水浴中反应8~15min,调节pH值在2至4之间。
优选地,所述氨基代谢物的测定方法,其所述衍生化试剂按照如下方法新鲜制备:
取4~8mM的5-氨基异喹啉的乙腈溶液和8~10mM的N,N'-琥珀酰亚胺基碳酸酯的乙腈溶液,在1小时至2小时内将5-氨基异喹啉的乙腈溶液中逐滴加入DSC溶液中,使得5-氨基异喹啉与N,N'-琥珀酰亚胺基碳酸酯的摩尔比例在1:1至1:1.8之间,再室温反应24-48h,获得的反应液经过过滤再浓缩,得到黄色沉淀,即为所述衍生化试剂。
优选地,所述氨基代谢物的测定方法,其步骤(4)所述检测具体条件如下:
柱温为50℃;
流动相为A超纯水,流动相B为0.1%甲酸的甲醇溶液;
洗脱梯度:0–2min=1%,2–4min=1-3.8%,4–8min=3.8-22%,8–12min=22-25%,12–13min=25-60%,13.5–13.51min=60-80%,13.51–16min=95%;
流速为0.6mL/min,进样量为1μL。
优选地,所述氨基代谢物的测定方法,其MRM模式离子源条件:干燥气流量10L/min,干燥气温度315℃,雾化器压力50psi,鞘气温度350℃,鞘气流量10L/min,喷嘴电压500V,毛细管电压4000V,共同的子离子为m/z171。
总体而言,通过本发明所构思的以上技术方案与现有技术相比,能够取得以下技术效果:
本发明在样品前处理过程中,首先将RSH转化为稳定的化合物,然后将RSSH转化为RSH,通过后续的UPLC-MS/MS检测,一次测定样品中本来存在的RSH形成的稳定化合物和RSSH转化成的RSH,从而通过一次检测,分别定量检测样品中RSH和RSSH的含量。
优选技术方案,采用5-氨基异喹啉基-N-羟基琥珀酰亚胺基氨基甲酸酯(AIQC)作为衍生化试剂,能大幅提高检测灵敏度。
另外,本发明提供的技术方案,能一次检测117中氨基代谢物,相对于现有技术实现检测种类的突破。
总体而言,本发明能够取得全面快速、可一次性检出还原型RSH和氧化型RSSR及检测限低灵敏度高等有益效果,尤其是在检测的广泛性和灵敏度方面实现质的飞跃。
附图说明
图1是按照本发明对10种氨基代谢物的标准品溶液的检测结果;
图2是按照常规方法对10种氨基代谢物的标准品溶液的检测结果;
图3是按照本发明对117种氨基代谢物的标准品溶液的检测结果;
图4是按照本发明对117种氨基代谢物的标准品溶液的检测结果;
图5是按照本发明对117种氨基代谢物的标准品溶液的检测结果;
图6是按照本发明对117种氨基代谢物的标准品溶液的检测结果;
图7是按照本发明对于细胞样品的检测结果。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白,以下结合附图及实施例,对本发明进行进一步详细说明。应当理解,此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明,并不用于限定本发明。此外,下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及到的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。
本发明提供的氨基代谢物的测定方法,对于10~20μl待测样品进行如下处理:
(1)样品前处理:
(1-1)向待检测的生物样品中加入浓度为1~5mM的N-乙基马来酰亚胺(NEM)磷酸缓冲溶液80~200μl,混匀室温反应1~5min使得NEM与含自由巯基的氨基代谢物(RSH)发生加成反应获得生物样品溶液,所述磷酸缓冲溶液pH值7.0,磷酸根浓度100mM;反应式如下:
优选地,所述磷酸缓冲溶液含有质量分数8%~15%的二甲基亚砜(DMSO);
更优选地,所述磷酸缓冲溶液含有1~10mM的抗坏血酸(Vc)和/或1~10mM的乙二胺四乙酸(EDTA)。
加入NEM目的是与RSH发生加成反应形成化学性质稳定的化合物,用于后续的UPLC-MS/MS检测,所加入的DMSO可促进该加成反应,降低对反应条件的要求。加入Vc和/或EDTA的作用是利用它们的抗氧化性,保护反应底物RSH的自由巯基和其它容易氧化的物质如多巴胺在整个反应过程中不被氧化。
(1-2)向步骤(1-1)中获取的生物样品溶液中加入浓度为0.1~1M的4-叔丁基苯硫酚(tBBT)的二甲基亚砜溶液或乙腈溶液10~20μl,室温反应1~3min,去除生物样品溶液中多余的NEM,得到前处理样品溶液;tBBT与NEM摩尔比在5:1至100:1之间。反应式如下:
加入tBBT的目的是去除生物样品溶液中多余的NEM,因为NEM会与氨基反应,降低后续步骤(3)的衍生化效率,影响定量结果,反应后获得前处理样品溶液。
(2)还原处理:向步骤(1-2)中获取的前处理样品溶液中加入含有1~20mM三(2-羧乙基)膦(TCEP)的硼酸缓冲溶液(pH=8-9,200mM)700~1400μl,使得含二硫键化合物(RSSR)还原成为RSH,得到还原后的样品溶液。反应式如下:
所述硼酸缓冲溶液,pH值在8至9之间,硼酸根浓度为200mM,优选含有1~20mM的Vc。
TCEP与Vc协同具有较强的抗氧化作用(Brein,A.等,Analytical Chemistry2011,83,7523-7530),在本方法设计时首先确定加入TCEP和Vc保护RSH的自由巯基和其它容易氧化的物质如多巴胺在整个反应过程中不被氧化。样品还原处理过程中的抗氧化功能,由TCEP与Vc协同完成。由于TCEP会与RSSR反应生成RSH,在检测时会与样品中本身含有的RSH无法区分,因此进一步设计样品前处理步骤(1-1)使原有的RSH变成稳定化合物,这样可在后续UPLC-MS/MS检测时将生物样品中的还原型的RSH和氧化型的RSSR一次性检出。
(3)衍生化处理:向步骤(2)中获得的还原后的样品溶液加入衍生化试剂,衍生化氨基代谢物,固液分离其液相即衍生化样品溶液。
衍生化试剂可采用6-氨基喹啉-N-羟基琥珀酰亚氨基氨基甲酸酯(AQC)或5-氨基异喹啉基-N-羟基琥珀酰亚胺基氨基甲酸酯(AIQC)。
衍生化试剂与伯胺和仲胺反应,改变了氨基代谢物的极性,使得衍生化产物在色谱柱中易分离,同时易质子化,在质谱中容易检测,提高氨基代谢物的检测灵敏度。
所述衍生化试剂优选为:AIQC,具体步骤如下:
向步骤(2)获得的还原后的样品溶液,加入200~400μL浓度在10mg/mL至30mg/mL之间的AIQC的乙腈溶液,55℃水浴中反应8~15min,调节pH值在2至4之间,优选采用甲酸调节pH值。
衍生化反应式:
采用甲酸调节pH至的具体步骤为:加入5-20μl甲酸,使溶液为酸性(pH约为2-4),防止衍生后产物上的NEM基团水解。
所述衍生化试剂AIQC,优选按照以下步骤新鲜配制:
取4~8mM的5-氨基异喹啉的乙腈溶液和8~10mM的N,N'-琥珀酰亚胺基碳酸酯(DSC)的乙腈溶液,在1小时至2小时内将5-氨基异喹啉的乙腈溶液中逐滴加入DSC溶液中,使得5-氨基异喹啉与DSC的摩尔比例在1:1至1:1.8之间,再室温反应24-48h,获得的反应液经过过滤再浓缩,得到黄色沉淀,即为所述衍生化试剂AIQC。
合成衍生化试剂反应式:
(4)UPLC-MS/MS检测:将步骤(3)获得的衍生化样品溶液,用UPLC-MS/MS方法多反应监测模式(MRM模式)进行检测。
优选检测条件如下:
柱温为50℃,流动相为A超纯水(MilliQ),流动相B为0.1%甲酸的甲醇溶液。洗脱梯度:(B%):0–2min=1%,2–4min=1-3.8%,4–8min=3.8-22%,8–12min=22-25%,12–13min=25-60%,13.5–13.51min=60-80%,13.51–16min=95%。流速为0.6mL/min,进样量为1μL。色谱柱优选采用Agilent Zorbax Eclipse XDB-C18Rapid Resolution HD2.1x100mm,1.8μm(Agilent Technologies,US)。
ESI-QqQ-MS采用正离子模式的MRM方法,离子源条件:干燥气流量10L/min,干燥气温度315℃,雾化器压力50psi,鞘气温度350℃,鞘气流量10L/min,喷嘴电压500V,毛细管电压4000V。扫描模式为MRM模式,共同的子离子为m/z 171。
以下为实施例:
提供了7个实施例及相应图表,实施例1和2分别是常规方法和本方法,通过对比可知本方法在一次性检出RSH和RSSR方面的优势;实施例3和4是不同衍生化试剂的比较,表明优选的AIQC在性能上的优势,尤其是灵敏度方面。
实施例1
本发明提供的氨基代谢物的测定方法,对于10μl含有10种氨基代谢物的标准品溶液(富含常见还原型的RSH和氧化型的RSSR,见表1)进行如下处理:
(1)样品前处理:
(1-1)向待检测的生物样品中加入浓度为5mM的NEM磷酸缓冲溶液200μl,混匀室温反应5min,使得NEM与含RSH发生加成反应获得生物样品溶液;反应式如下:
所述磷酸缓冲溶液pH值7.0,磷酸根浓度100mM,含有质量分数15%的DMSO、10mM的Vc和10mM的EDTA。
(1-2)向步骤(1-1)中获取的生物样品溶液中加入浓度为1M的tBBT的乙腈溶液20μl,室温反应3min,去除生物样品溶液中多余的NEM,得到前处理样品溶液。反应式如下:
(2)还原处理:向步骤(1-2)中获取的前处理样品溶液中加入含有20mM TCEP的硼酸缓冲溶液(pH=8.8,200mM)700μl,使得RSSR还原成为RSH,得到还原后的样品溶液。反应式如下:
所述硼酸缓冲溶液,pH值为8.8,硼酸根浓度为200mM,含有20mM的Vc。
(3)衍生化处理:向步骤(2)中获得的还原后的样品溶液加入衍生化试剂,衍生化氨基代谢物,固液分离其液相即衍生化样品溶液。
所述衍生化试剂为:AIQC,具体步骤如下:
向步骤(2)获得的还原后的样品溶液,加入400μL浓度为30mg/mL的AIQC的乙腈溶液,55℃水浴中反应15min,采用甲酸调节pH值在2至4之间。
衍生化反应式:
采用甲酸调节pH至的具体步骤为:加入5-20μl甲酸,使溶液为酸性(pH约为2-4),防止衍生后产物上的NEM基团水解。
(4)UPLC-MS/MS检测:将步骤(3)获得的衍生化样品溶液,用UPLC-MS/MS方法MRM模式进行检测。
检测条件如下:
色谱条件:仪器:Agilent 6460UPLC-ESI-QqQ;色谱柱:Eclipse XDB-C-18(1.8μm,2.1*200mm);流速:0.5-0.6ml/min,温度:50℃,进样量:1μl;流动相:A:超纯水,B:CH3OH(1%HCOOH);正离子模式质谱条件:离子源:ESI源;扫描模式:MRM模式;
干燥气温度:315℃;干燥气流速:10L/min;喷雾器压力:50psi;鞘流气温度:350℃;鞘流气流速:10L/min;毛细管电压:4000V;辅助电压:500V。
检测结果如图1,对于10种标品均可一次性精准检出。
表1 10种氨基代谢物的标准品成分表
实施例2
应用常规的氨基代谢物的测定方法(Brein,A.等,Analytical Chemistry 2011,83,7523-7530),对于10μl含有10种氨基代谢物的标准品溶液(富含常见还原型的RSH和氧化型的RSSR,见表1)进行如下处理:
(1)还原保护:加入含有1mM TCEP的硼酸缓冲溶液(pH=8.8,200mM)700μl,所述硼酸缓冲溶液,pH值为8.8,硼酸根浓度为200mM,含有20mM的Vc。
(2)衍生化处理:向步骤(1)中获得的样品溶液加入衍生化试剂,衍生化氨基代谢物,固液分离其液相即衍生化样品溶液。
所述衍生化试剂为:AQC,具体步骤如下:
向步骤(1)中获得的样品溶液,加入20μL浓度为10mM的AQC的乙腈溶液,55℃水浴中反应15min。
衍生化反应式:
(3)UPLC-MS/MS检测:将步骤(3)获得的衍生化样品溶液,用UPLC-MS/MS方法MRM模式进行检测。
检测条件如下:
色谱条件:仪器:Agilent 6460UPLC-ESI-QqQ;色谱柱:Eclipse XDB-C-18(1.8μm,2.1*200mm);流速:0.5-0.6ml/min,温度:50℃,进样量:1μl;流动相:A:超纯水,B:CH3OH(1%HCOOH);正离子模式质谱条件:离子源:ESI源;扫描模式:MRM模式;
干燥气温度:315℃;干燥气流速:10L/min;喷雾器压力:50psi;鞘流气温度:350℃;鞘流气流速:10L/min;毛细管电压:4000V;辅助电压:500V。
检测结果如图2,仅能检测出7种标品,氧化型的3种RSSR无法检出。此外,样品中本身的还原型RSH的检测结果跟实际不符。图2中的GSH、Cysteine和Cysteamine的含量比图1显著增加,是因为GSSG、Cystine和Cystamine在步骤(1)中被还原成GSH、Cysteine和Cysteamine,因此根据图2所得到的GSH、Cysteine和Cysteamine浓度信息跟实际不符。
实施例3
本发明提供的氨基代谢物的测定方法,对于10μl含有117种氨基代谢物的标准品溶液(见表2)进行如下处理:
(1)样品前处理:
(1-1)向待检测的生物样品中加入浓度为1mM的NEM磷酸缓冲溶液80μl,混匀室温反应1min,使得NEM与含RSH发生加成反应获得生物样品溶液;反应式如下:
所述磷酸缓冲溶液pH值7.0,磷酸根浓度100mM,含有质量分数8%的DMSO、1mM的VC和1mM的EDTA。
(1-2)向步骤(1-1)中获取的生物样品溶液中加入浓度为0.1M的tBBT的二甲基亚砜溶液10μl,室温反应1min,去除生物样品溶液中多余的NEM,得到前处理样品溶液。反应式如下:
(2)还原处理:向步骤(1-2)中获取的前处理样品溶液中加入含有1mM TCEP的硼酸缓冲溶液(pH=8,200mM)700μl,使得RSSR还原成为RSH,得到还原后的样品溶液。反应式如下:
所述硼酸缓冲溶液,pH值为8,硼酸根浓度为200mM,含有1mM的Vc。
(3)衍生化处理:向步骤(2)中获得的还原后的样品溶液加入衍生化试剂,衍生化氨基代谢物,固液分离其液相即衍生化样品溶液。
所述衍生化试剂为:AIQC,具体步骤如下:
向步骤(2)获得的还原后的样品溶液,加入200μL浓度为10mg/mL的AIQC的乙腈溶液,55℃水浴中反应8min,采用甲酸调节pH值在2至4之间。
衍生化反应式:
采用甲酸调节pH至的具体步骤为:加入5-20μl甲酸,使溶液为酸性(pH约为2-4),防止衍生后产物上的NEM基团水解。
(4)UPLC-MS/MS检测:将步骤(3)获得的衍生化样品溶液,用UPLC-MS/MS方法MRM模式进行检测。
检测条件如下:
色谱条件:仪器:Agilent 6460UPLC-ESI-QqQ;色谱柱:EclipseXDB-C-18(1.8μm,2.1*200mm);流速:0.5-0.6ml/min,温度:50℃,进样量:1μl;流动相:A:超纯水,B:CH3OH(1%HCOOH);正离子模式质谱条件:离子源:ESI源;扫描模式:MRM模式;
干燥气温度:315℃;干燥气流速:10L/min;喷雾器压力:50psi;鞘流气温度:350℃;鞘流气流速:10L/min;毛细管电压:4000V;辅助电压:500V。
检测结果如图3,对于117种标品均可在14分钟以内一次性精准检出。
表3 117种氨基代谢物的标准品成分表
实施例4
本发明提供的氨基代谢物的测定方法,对于10μl含有117种氨基代谢物的标准品溶液(见表2)进行如下处理:
(1)样品前处理:
(1-1)向待检测的生物样品中加入浓度为1mM的NEM磷酸缓冲溶液80μl,混匀室温反应1min,使得NEM与含RSH发生加成反应获得生物样品溶液;反应式如下:
所述磷酸缓冲溶液pH值7.0,磷酸根浓度100mM,含有质量分数8%的DMSO、1mM的EDTA。
(1-2)向步骤(1-1)中获取的生物样品溶液中加入浓度为0.1M的tBBT的二甲基亚砜溶液10μl,室温反应1min,去除生物样品溶液中多余的NEM,得到前处理样品溶液。反应式如下:
(2)还原处理:向步骤(1-2)中获取的前处理样品溶液中加入含有1mM TCEP的硼酸缓冲溶液(pH=8,200mM)700μl,使得RSSR还原成为RSH,得到还原后的样品溶液。反应式如下:
所述硼酸缓冲溶液,pH值为8,硼酸根浓度为200mM,含有1mM的Vc。
(3)衍生化处理:向步骤(2)中获得的还原后的样品溶液加入衍生化试剂,衍生化氨基代谢物,固液分离其液相即衍生化样品溶液。
所述衍生化试剂为:AQC,具体步骤如下:
向步骤(2)获得的还原后的样品溶液,加入200μL浓度为10mg/mL的AQC的乙腈溶液,55℃水浴中反应8min,采用甲酸调节pH值在2至4之间。
衍生化反应式:
采用甲酸调节pH至的具体步骤为:加入5-20μl甲酸,使溶液为酸性(pH约为2-4),防止衍生后产物上的NEM基团水解。
(4)UPLC-MS/MS检测:将步骤(3)获得的衍生化样品溶液,用UPLC-MS/MS方法MRM模式进行检测。
检测条件如下:
色谱条件:仪器:Agilent 6460UPLC-ESI-QqQ;色谱柱:Eclipse XDB-C-18(1.8μm,2.1*200mm);流速:0.5-0.6ml/min,温度:50℃,进样量:1μl;流动相:A:超纯水,B:CH3OH(1%HCOOH);正离子模式质谱条件:离子源:ESI源;扫描模式:MRM模式;
干燥气温度:315℃;干燥气流速:10L/min;喷雾器压力:50psi;鞘流气温度:350℃;鞘流气流速:10L/min;毛细管电压:4000V;辅助电压:500V。
检测结果如图4,对于117种标品均可在14分钟以内一次性精准检出。与实施例3相比,检测性能指标检测限(LOD)明显差于实施例3(见表3),意味着实施例3的检测灵敏度强于实施例4。
表3使用相同衍生化方法比较AIQC和AQC的灵敏度
注:LODa为AIQC衍生柱上检测限,LODb为AQC衍生柱上检测限
实施例5
本发明提供的氨基代谢物的测定方法,对于15μl含有117种氨基代谢物的标准品溶液(见表2)进行如下处理:
(1)样品前处理:
(1-1)向待检测的生物样品中加入浓度为2.5mM的NEM磷酸缓冲溶液160μl,混匀室温反应3min,使得NEM与含RSH发生加成反应获得生物样品溶液;反应式如下:
所述磷酸缓冲溶液pH值7.0,磷酸根浓度100mM,含有质量分数10%的DMSO、6mM的Vc和5mM的EDTA。
(1-2)向步骤(1-1)中获取的生物样品溶液中加入浓度为0.5M的tBBT的二甲基亚砜溶液15μl,室温反应2min,去除生物样品溶液中多余的NEM,得到前处理样品溶液。反应式如下:
(2)还原处理:向步骤(1-2)中获取的前处理样品溶液中加入含有10mM TCEP的硼酸缓冲溶液(pH=8.8,200mM)1000μl,使得RSSR还原成为RSH,得到还原后的样品溶液。反应式如下:
所述硼酸缓冲溶液,pH值为8.8,硼酸根浓度为200mM,含有10mM的Vc。
(3)衍生化处理:向步骤(2)中获得的还原后的样品溶液加入衍生化试剂,衍生化氨基代谢物,固液分离其液相即衍生化样品溶液。
所述衍生化试剂为:AIQC,具体步骤如下:
向步骤(2)获得的还原后的样品溶液,加入300μL浓度为20mg/mL的AIQC的乙腈溶液,55℃水浴中反应10min,采用甲酸调节pH值在2至4之间。
衍生化反应式:
采用甲酸调节pH至的具体步骤为:加入5-20μl甲酸,使溶液为酸性(pH约为2-4),防止衍生后产物上的NEM基团水解。
(4)UPLC-MS/MS检测:将步骤(3)获得的衍生化样品溶液,用UPLC-MS/MS方法MRM模式进行检测。
检测条件如下:
色谱条件:仪器:Agilent 6460UPLC-ESI-QqQ;色谱柱:Eclipse XDB-C-18(1.8μm,2.1*200mm);流速:0.5-0.6ml/min,温度:50℃,进样量:1μl;流动相:A:超纯水,B:CH3OH(1%HCOOH);正离子模式质谱条件:离子源:ESI源;扫描模式:MRM模式;
干燥气温度:315℃;干燥气流速:10L/min;喷雾器压力:50psi;鞘流气温度:350℃;鞘流气流速:10L/min;毛细管电压:4000V;辅助电压:500V。
检测结果如图5,对于117种标品均可在14分钟以内一次性精准检出。
实施例6
本发明提供的氨基代谢物的测定方法,对于20μl含有117种氨基代谢物的标准品溶液(见表2)进行如下处理:
(1)样品前处理:
(1-1)向待检测的生物样品中加入浓度为5mM的NEM磷酸缓冲溶液200μl,混匀室温反应5min,使得NEM与含RSH发生加成反应获得生物样品溶液;反应式如下:
所述磷酸缓冲溶液pH值7.0,磷酸根浓度100mM,含有质量分数15%的DMSO、10mM的Vc和10mM的EDTA。
(1-2)向步骤(1-1)中获取的生物样品溶液中加入浓度为1M的tBBT的乙腈溶液20μl,室温反应3min,去除生物样品溶液中多余的NEM,得到前处理样品溶液。反应式如下:
(2)还原处理:向步骤(1-2)中获取的前处理样品溶液中加入含有20mM TCEP的硼酸缓冲溶液(pH=9,200mM)1400μl,使得RSSR还原成为RSH,得到还原后的样品溶液。反应式如下:
所述硼酸缓冲溶液,pH值为9,硼酸根浓度为200mM,含有20mM的Vc。
(3)衍生化处理:向步骤(2)中获得的还原后的样品溶液加入衍生化试剂,衍生化氨基代谢物,固液分离其液相即衍生化样品溶液。
所述衍生化试剂为:AIQC,具体步骤如下:
向步骤(2)获得的还原后的样品溶液,加入400μL浓度为30mg/mL的AIQC的乙腈溶液,55℃水浴中反应15min,采用甲酸调节pH值在2至4之间。
衍生化反应式:
采用甲酸调节pH至的具体步骤为:加入5-20μl甲酸,使溶液为酸性(pH约为2-4),防止衍生后产物上的NEM基团水解。
(4)UPLC-MS/MS检测:将步骤(3)获得的衍生化样品溶液,用UPLC-MS/MS方法MRM模式进行检测。
检测条件如下:
色谱条件:仪器:Agilent 6460UPLC-ESI-QqQ;色谱柱:Eclipse XDB-C-18(1.8μm,2.1*200mm);流速:0.5-0.6ml/min,温度:50℃,进样量:1μl;流动相:A:超纯水,B:CH3OH(1%HCOOH);正离子模式质谱条件:离子源:ESI源;扫描模式:MRM模式;
干燥气温度:315℃;干燥气流速:10L/min;喷雾器压力:50psi;鞘流气温度:350℃;鞘流气流速:10L/min;毛细管电压:4000V;辅助电压:500V。
检测结果如图6,对于117种标品均可在14分钟以内一次性精准检出。
实施例7
本发明提供的氨基代谢物的测定方法,对于10μl细胞样品提取液进行如下处理:
(1)样品前处理:
(1-1)向待检测的生物样品中加入浓度为2.5mM的NEM磷酸缓冲溶液80μl,混匀室温反应1min,使得NEM与含RSH发生加成反应获得生物样品溶液;反应式如下:
所述磷酸缓冲溶液pH值7.0,磷酸根浓度100mM,含有质量分数10%的DMSO、10mM的Vc和10mM的EDTA。
(1-2)向步骤(1-1)中获取的生物样品溶液中加入浓度为1M的tBBT的二甲基亚砜溶液10μl,室温反应3min,去除生物样品溶液中多余的NEM,得到前处理样品溶液。反应式如下:
(2)还原处理:向步骤(1-2)中获取的前处理样品溶液中加入含有20mM TCEP的硼酸缓冲溶液(pH=8.8,200mM)700μl,使得RSSR还原成为RSH,得到还原后的样品溶液。反应式如下:
所述硼酸缓冲溶液,pH值为8.8,硼酸根浓度为200mM,含有1mM的Vc。
(3)衍生化处理:向步骤(2)中获得的还原后的样品溶液加入衍生化试剂,衍生化氨基代谢物,固液分离其液相即衍生化样品溶液。
所述衍生化试剂为:AIQC,具体步骤如下:
向步骤(2)获得的还原后的样品溶液,加入200μL浓度为30mg/mL的AIQC的乙腈溶液,55℃水浴中反应10min,采用甲酸调节pH值在2至4之间。
衍生化反应式:
采用甲酸调节pH至的具体步骤为:加入10μl甲酸,使溶液为酸性(pH约为2-4),防止衍生后产物上的NEM基团水解。
(4)UPLC-MS/MS检测:将步骤(3)获得的衍生化样品溶液,用UPLC-MS/MS方法MRM模式进行检测。
检测条件如下:
色谱条件:仪器:Agilent 6460UPLC-ESI-QqQ;色谱柱:Eclipse XDB-C-18(1.8μm,2.1*200mm);流速:0.5-0.6ml/min,温度:50℃,进样量:1μl;流动相:A:超纯水,B:CH3OH(1%HCOOH);正离子模式质谱条件:离子源:ESI源;扫描模式:MRM模式;
干燥气温度:315℃;干燥气流速:10L/min;喷雾器压力:50psi;鞘流气温度:350℃;鞘流气流速:10L/min;毛细管电压:4000V;辅助电压:500V。
检测结果如图7和表4,14分钟检测出细胞样品中的32种氨基代谢物,说明了本发明方法在真实生物样品中能得到很好应用,即使是氨基代谢物浓度较低的细胞样品中
表4细胞样品中检测到的氨基代谢物的种类
以上实施例显示本发明相对于现有技术具有全面快速、可一次性检出还原型RSH和氧化型RSSR及检测限低灵敏度高的优点。
本领域的技术人员容易理解,以上所述仅为本发明的较佳实施例而已,并不用以限制本发明,凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等,均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (7)
1.一种氨基代谢物的测定方法,其特征在于,对于10~20μl待测样品进行如下处理:
(1)样品前处理:
(1-1)向待检测的生物样品中加入浓度为1~5mM的N-乙基马来酰亚胺(NEM)磷酸缓冲溶液80~200μl,混匀室温反应1min至5min使得N-乙基马来酰亚胺与含自由巯基的氨基代谢物发生加成反应获得生物样品溶液;
(1-2)向步骤(1-1)中获取的生物样品溶液中加入浓度为0.1~1M的4-叔丁基苯硫酚的二甲基亚砜溶液或乙腈溶液10~20μl,室温反应1min至3min,去除生物样品溶液中多余的N-乙基马来酰亚胺,得到前处理样品溶液;
(2)还原处理:向步骤(1-2)中获取的前处理样品溶液中加入含有1~20mM三(2-羧乙基)膦的硼酸缓冲溶液700~1400μl,得到还原后的样品溶液;
(3)衍生化处理:向步骤(2)中获得的还原后的样品溶液加入衍生化试剂,衍生化氨基代谢物,固液分离其液相即衍生化样品溶液;
其中,所述衍生化试剂为5-氨基异喹啉基-N-羟基琥珀酰亚胺基氨基甲酸酯;衍生化具体步骤如下:
向步骤(2)获得的还原后的样品溶液,加入200~400μL浓度在10mg/mL至30mg/mL之间的5-氨基异喹啉基-N-羟基琥珀酰亚胺基氨基甲酸酯的乙腈溶液,55℃水浴中反应8~15min,调节pH值在2至4之间;
(4)UPLC-MS/MS检测:将步骤(3)获得的衍生化样品溶液,用UPLC-MS/MS方法多反应监测模式进行检测;所述检测具体条件如下:
柱温为50℃;
流动相为A超纯水,流动相B为0.1%甲酸的甲醇溶液;
洗脱梯度:0–2min=1%,2–4min=1-3.8%,4–8min=3.8-22%,8–12min=22-25%,12–13min=25-60%,13.5–13.51min=60-80%,13.51–16min=95%;
流速为0.6mL/min,进样量为1μL。
2.如权利要求1所述的氨基代谢物的测定方法,其特征在于,步骤(1-1)所述磷酸缓冲溶液含有质量分数8%~15%的二甲基亚砜。
3.如权利要求2所述的氨基代谢物的测定方法,其特征在于,步骤(1-1)所述磷酸缓冲溶液含有1~10mM的抗坏血酸和/或1~10mM的乙二胺四乙酸。
4.如权利要求1所述的氨基代谢物的测定方法,其特征在于,步骤(1-2)中加入的4-叔丁基苯硫酚与N-乙基马来酰亚胺的摩尔比在5:1至100:1之间。
5.如权利要求1所述的氨基代谢物的测定方法,其特征在于,步骤(2)所述硼酸缓冲溶液pH值在8至9之间,硼酸根浓度为200mM,含有1~20mM的抗坏血酸。
6.如权利要求1所述的氨基代谢物的测定方法,其特征在于,所述衍生化试剂按照如下方法新鲜制备:
取4~8mM的5-氨基异喹啉的乙腈溶液和8~10mM的N,N'-琥珀酰亚胺基碳酸酯的乙腈溶液,在1小时至2小时内将5-氨基异喹啉的乙腈溶液中逐滴加入DSC溶液中,使得5-氨基异喹啉与N,N'-琥珀酰亚胺基碳酸酯的摩尔比例在1:1至1:1.8之间,再室温反应24-48h,获得的反应液经过过滤再浓缩,得到黄色沉淀,即为所述衍生化试剂。
7.如权利要求1所述的氨基代谢物的测定方法,其特征在于,MRM模式离子源条件:干燥气流量10L/min,干燥气温度315℃,雾化器压力50psi,鞘气温度350℃,鞘气流量10L/min,喷嘴电压500V,毛细管电压4000V,共同的子离子为m/z171。
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