JP7233666B2 - ポリスルフィドの安定化 - Google Patents

ポリスルフィドの安定化 Download PDF

Info

Publication number
JP7233666B2
JP7233666B2 JP2022503751A JP2022503751A JP7233666B2 JP 7233666 B2 JP7233666 B2 JP 7233666B2 JP 2022503751 A JP2022503751 A JP 2022503751A JP 2022503751 A JP2022503751 A JP 2022503751A JP 7233666 B2 JP7233666 B2 JP 7233666B2
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
iam
tme
polysulfides
tyrosine
hplc
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
JP2022503751A
Other languages
English (en)
Other versions
JPWO2021172523A5 (ja
JPWO2021172523A1 (ja
Inventor
秀 居原
真吾 笠松
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Bio-Xcelerator, Inc.
University Public Corporation Osaka
Original Assignee
Bio-Xcelerator, Inc.
University Public Corporation Osaka
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Bio-Xcelerator, Inc., University Public Corporation Osaka filed Critical Bio-Xcelerator, Inc.
Publication of JPWO2021172523A1 publication Critical patent/JPWO2021172523A1/ja
Publication of JPWO2021172523A5 publication Critical patent/JPWO2021172523A5/ja
Application granted granted Critical
Publication of JP7233666B2 publication Critical patent/JP7233666B2/ja
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C233/00—Carboxylic acid amides
    • C07C233/01—Carboxylic acid amides having carbon atoms of carboxamide groups bound to hydrogen atoms or to acyclic carbon atoms
    • C07C233/45—Carboxylic acid amides having carbon atoms of carboxamide groups bound to hydrogen atoms or to acyclic carbon atoms having the nitrogen atom of at least one of the carboxamide groups bound to a carbon atom of a hydrocarbon radical substituted by carboxyl groups
    • C07C233/46—Carboxylic acid amides having carbon atoms of carboxamide groups bound to hydrogen atoms or to acyclic carbon atoms having the nitrogen atom of at least one of the carboxamide groups bound to a carbon atom of a hydrocarbon radical substituted by carboxyl groups with the substituted hydrocarbon radical bound to the nitrogen atom of the carboxamide group by an acyclic carbon atom
    • C07C233/47—Carboxylic acid amides having carbon atoms of carboxamide groups bound to hydrogen atoms or to acyclic carbon atoms having the nitrogen atom of at least one of the carboxamide groups bound to a carbon atom of a hydrocarbon radical substituted by carboxyl groups with the substituted hydrocarbon radical bound to the nitrogen atom of the carboxamide group by an acyclic carbon atom having the carbon atom of the carboxamide group bound to a hydrogen atom or to a carbon atom of an acyclic saturated carbon skeleton
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C229/00—Compounds containing amino and carboxyl groups bound to the same carbon skeleton
    • C07C229/02—Compounds containing amino and carboxyl groups bound to the same carbon skeleton having amino and carboxyl groups bound to acyclic carbon atoms of the same carbon skeleton
    • C07C229/34—Compounds containing amino and carboxyl groups bound to the same carbon skeleton having amino and carboxyl groups bound to acyclic carbon atoms of the same carbon skeleton the carbon skeleton containing six-membered aromatic rings
    • C07C229/36—Compounds containing amino and carboxyl groups bound to the same carbon skeleton having amino and carboxyl groups bound to acyclic carbon atoms of the same carbon skeleton the carbon skeleton containing six-membered aromatic rings with at least one amino group and one carboxyl group bound to the same carbon atom of the carbon skeleton
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C233/00—Carboxylic acid amides
    • C07C233/01—Carboxylic acid amides having carbon atoms of carboxamide groups bound to hydrogen atoms or to acyclic carbon atoms
    • C07C233/16—Carboxylic acid amides having carbon atoms of carboxamide groups bound to hydrogen atoms or to acyclic carbon atoms having the nitrogen atom of at least one of the carboxamide groups bound to a carbon atom of a hydrocarbon radical substituted by singly-bound oxygen atoms
    • C07C233/17—Carboxylic acid amides having carbon atoms of carboxamide groups bound to hydrogen atoms or to acyclic carbon atoms having the nitrogen atom of at least one of the carboxamide groups bound to a carbon atom of a hydrocarbon radical substituted by singly-bound oxygen atoms with the substituted hydrocarbon radical bound to the nitrogen atom of the carboxamide group by an acyclic carbon atom
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C237/00—Carboxylic acid amides, the carbon skeleton of the acid part being further substituted by amino groups
    • C07C237/52—Carboxylic acid amides, the carbon skeleton of the acid part being further substituted by amino groups having the nitrogen atom of at least one of the carboxamide groups further acylated
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C323/00—Thiols, sulfides, hydropolysulfides or polysulfides substituted by halogen, oxygen or nitrogen atoms, or by sulfur atoms not being part of thio groups
    • C07C323/23—Thiols, sulfides, hydropolysulfides or polysulfides substituted by halogen, oxygen or nitrogen atoms, or by sulfur atoms not being part of thio groups containing thio groups and nitrogen atoms, not being part of nitro or nitroso groups, bound to the same carbon skeleton
    • C07C323/24—Thiols, sulfides, hydropolysulfides or polysulfides substituted by halogen, oxygen or nitrogen atoms, or by sulfur atoms not being part of thio groups containing thio groups and nitrogen atoms, not being part of nitro or nitroso groups, bound to the same carbon skeleton having the sulfur atoms of the thio groups bound to acyclic carbon atoms of the carbon skeleton
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C323/00—Thiols, sulfides, hydropolysulfides or polysulfides substituted by halogen, oxygen or nitrogen atoms, or by sulfur atoms not being part of thio groups
    • C07C323/50—Thiols, sulfides, hydropolysulfides or polysulfides substituted by halogen, oxygen or nitrogen atoms, or by sulfur atoms not being part of thio groups containing thio groups and carboxyl groups bound to the same carbon skeleton
    • C07C323/51—Thiols, sulfides, hydropolysulfides or polysulfides substituted by halogen, oxygen or nitrogen atoms, or by sulfur atoms not being part of thio groups containing thio groups and carboxyl groups bound to the same carbon skeleton having the sulfur atoms of the thio groups bound to acyclic carbon atoms of the carbon skeleton
    • C07C323/52—Thiols, sulfides, hydropolysulfides or polysulfides substituted by halogen, oxygen or nitrogen atoms, or by sulfur atoms not being part of thio groups containing thio groups and carboxyl groups bound to the same carbon skeleton having the sulfur atoms of the thio groups bound to acyclic carbon atoms of the carbon skeleton the carbon skeleton being acyclic and saturated
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N31/00—Investigating or analysing non-biological materials by the use of the chemical methods specified in the subgroup; Apparatus specially adapted for such methods

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)

Description

本発明は新規なチロシン誘導体に係り、特に、チロシン誘導体を主成分として含有し、活性硫黄種を安定化してこれを検出できるようにするのに好適な材料、化合物、組成物、試薬等に関する。
システインヒドロポリスルフィド（CysSSH）、グルタチオンポリスルフィド（GSSH）などの反応性硫黄種／活性硫黄種（RSS）の生理学的重要性が、例えば、NATURE COMMUNICATIONS|8: 1177，Cysteinyl-tRNA synthetase governs cysteine polysulfidation and mitochondrial bioenergetics，27 October 2017に記載されている。
システインヒドロポリスルフィド（CysSSH）は、さまざまな生物で大量に発生するが、その生合成と生理学的機能についてはほとんど知られていない。大腸菌および哺乳動物細胞のシステイン含有タンパク質では広範な過硫化物の形成が明らかであり、硫化水素に関連する化学反応を含む翻訳後プロセスから生じると考えられている。
原核生物および哺乳類のシステイニル-tRNAシンテターゼ（CARS）によって触媒される反応である基質L-システインからの効果的なCysSSH合成が存在する。マウスおよびヒト細胞のミトコンドリアCARSをコードする遺伝子の標的破壊は、CARSが内因性のCysSSH産生に重要な役割を果たしていることを示し、これらの酵素がin vivoで主要なシステイン過硫黄合成酵素として機能することを示唆している。CARSは、同時翻訳システイン過硫化も触媒し、ミトコンドリアの生合成と生体エネルギーの調節に関与している。したがって、CARS依存性過硫化物産生の調査は、生理学的および病態生理学的条件における異常な酸化還元シグナル伝達を明らかにし、酸化ストレスおよびミトコンドリア機能障害に基づいた治療標的を示唆する可能性がある。
RSS代謝プロファイリングを使用して、活性硫黄メタボロミクス分析を確立することにより、原核生物と真核生物の両方で内生的および遍在的に生成されるかなりの量のRSSの生体内動態が明らかになるであろう。生体サンプル（マウス臓器や培養細胞など）からの活性硫黄種の定量解析法は2014年に報告されている（Ida T. et al., PNAS 2014）。
また、タンパク質ポリスルフィド（タンパク質システイン残基上の活性イオウ分子）の検出系として、modified tag switch assay（Ida T. et al., PNAS 2014; Mustafa A. Science 2009）やmaleimide assay（Gao XH. et al., eLife 2016, Yang R. et al., Immunity 2015）、pulldown assay (Doka E. Et al., Sci. Adv. 2016)、biotin-polyethylene glycol-conjugated maleimide gel shift assy（Jung M. et al., BBRC 2016）などが報告されている。
RSS代謝プロファイリングを使用して、活性硫黄メタボロミクス分析を確立することにより、原核生物と真核生物の両方で内生的および遍在的に生成されるかなりの量のRSSの生体内動態が明らかになるであろう。
ポリスルフィドの化学的性質は、その反応性または複雑なレドックス活性特性のため、完全には理解され、そして、解明されていない。検出試薬として公知な化合物は、いずれも活性硫黄種の分解を強力に促進することが分かっている。Redox Biology Volume 21（2019）101096 Science Directには、生体サンプルからの活性硫黄種の定量解析法の改良版として、β-(4-hydroxyphenyl) ethyl iodoacetamide（HPE-IAM）を用いた系を明らかにしている。
Redox Biology Volume 21（2019）101096 Science Direct
発明者は、RSS代謝プロファイリングを使用して、活性硫黄メタボロミクス分析を確立した。これにより、原核生物と真核生物の両方で内生的および遍在的に生成されるかなりの量のRSSの生体内動態が明らかになった。
しかしながら、本発明者が検討したところ、HPE-IAMを用いた場合であっても、RSS（活性硫黄種）の分解が生じてしまうことが分かった。
そこで、この発明は、RSSを分析できるようにするために、RSSの安定化を実現することを目的とする。
前記目的を達成するために、本発明は、新規なチロシン誘導体を提供する。本発明のチロシン誘導体は、下記の化学式によって特定される。
Figure 0007233666000001
 ａ－ｃの一つが“ＯＨ”であり、残りが“Ｈ”であり、
ｄは、ＣｎＨ２ｎαであり、αは“Ｈ”、又は、“ハロゲン原子”であり、ハロゲン原子は、好ましくは、“Ｉ”であり、ｎは１～５の整数であり、
ｅは、（ＮＨ）ｘ（ＣＯ）ｙＣｚＨ２ｚβであり、ｘは１又は０、ｙは１又は０、ｚは１～５の整数、βは“Ｈ”、又は、“ハロゲン原子”であり、ハロゲン原子は、好ましくは、“Ｉ”である。
本発明によれば、RSSの安定化が実現される。
Tyrosine Methyl Ester標品（A）と反応溶液（B）のHPLC解析結果を示すグラフである。 粗精製液のHPLC検出結果を示すグラフである。 粗精製液をLC-MC/MSで解析した結果したグラフである。 粗精製液をLC-MC/MSで解析した結果を示すグラフである。 チロシン誘導体とシステインとの反応性試験結果のグラフである。 新規チロシン誘導体を含む各アルキル化試薬の活性イオウ分子の安定化試験の結果を示すグラフである。 TME-IAMのGS-SS-SG保護効果のｐＨの影響試験の結果を示すグラフである。 TME-IAMのGS-SS-SG保護効果の反応モル比の影響試験の結果を示すグラフである。 TME-IAMのGS-SS-SG等との反応性試験の結果を示すグラフである。 TME-IAMおよびHPE-IAMのシステインヒドロポリスルフィド[CysS-(S)n-H]に対する反応性の比較を示す図である。 TME-IAMの細胞透過性を示すグラフである。 硫化水素に対するTME-IAMの反応性を示すグラフである。 N-ヨードアセチルチロシンのGS-SS-SG保護効果を示すグラフである。
本発明者は、本発明のチロシン誘導体が多様なポリスルフィドに安定化効果があることを解明した。例えば、グルタチオンポリスルフィド（酸化型グルタチオン三硫化物および酸化型グルタチオン四硫化物）の分解に対する保護効果は、多硫化物のアルカリ加水分解に対する、チロシン誘導体のヒドロキシフェニル残基により引き起こされる。
ポリスルフィドの加水分解は、ポリスルフィドに作用するヒドロキシルアニオンによってトリガーされ、ポリスルフィドにヘテロリシス切断をもたらして、ポリスルフィドをチオレートとスルフェン酸に分解する。加水分解はアルキル化試薬（IAMなど）とジメドンによって促進される。
チロシン誘導体はアルカリ性pHで起こる求電子的分解を防ぐ。チロシン誘導体のヒドロキシフェニル部分によって誘発されるポリスルフィドの安定化は、ポリスルフィドの化学的性質の理解を大幅に改善し、臨床検体を含むあらゆる種類の生体サンプルにうまく適用できる場合、RSSメタボロミクス分析に役立つ。
本発明のチロシン誘導体は、下記の化学式によって特定される。
Figure 0007233666000002
 ａ－ｃの一つが“ＯＨ”であり、残りが“Ｈ”であり、
ｄは、ＣｎＨ２ｎαであり、αは“Ｈ”、又は、“ハロゲン原子”であり、ハロゲン原子は、好ましくは、“Ｉ”であり、ｎは１～５の整数であり、
ｅは、（ＮＨ）ｘ（ＣＯ）ｙＣｚＨ２ｚβであり、ｘは１又は０、ｙは１又は０、ｚは１～５の整数、βは“Ｈ”、又は、“ハロゲン原子”であり、ハロゲン原子は、好ましくは、“Ｉ”である。
前記チロシン誘導体は、下記化合物を含む。
Figure 0007233666000003
Figure 0007233666000004
Figure 0007233666000005
 本発明者は、これらチロシン誘導体が新規物質であることを、PubChem(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)によって確認している。本発明のチロシン誘導体は、ヨードアセトアミド誘導体でもある。
下記反応式は、ポリスルフィドが加水分解を受けて、分解されることを説明する化学反応であって、ポリスルフィドと求電子試薬、または、ジメドンとの反応の概略を示す。図GS-SS-SGの分解プロセスは、アルカリ誘導加水分解によって開始され、その結果、チオレートおよびスルフェニル部分が生成される。
Figure 0007233666000006
Figure 0007233666000007
特定の硫黄残基、例えば、GS-SS-SGの「-SS-」は、その隣接硫黄がヒドロキシル化（OH-付加）されてGSS-OHが除外される場合、求電子剤によって切断され、求電子アルキル化によってGSS-E付加物を生成し、最終的には、加水分解を伴う求電子性ポリスルフィドの分解を引き起こす。注目すべきこととして、TME-IAM、TEE-IAM、NAT-IAMなどの求電子性IAMを含むアルキル化剤でさえ、そのTME等のヒドロキシル部分がアルカリ加水分解を阻害するように機能的に活性である限り、強力なポリスルフィド安定化効果を持つ。
TME-IAM等のアルキル化剤は、ハロゲン（ヨウ素）が-SH（還元型S）に作用して、-S-AM-TMEを形成する。TME-IAM等のヒドロキシル基が-Sn-（n：2以上の整数）：酸化型イオウの加水分解を抑制する。もう1つの興味深い点は、この分解には、例えば、チオレドキシンとチオレドキシンレダクターゼによって媒介されることが判明しているような、標準的な内因性還元反応の影響を受ける通常の酸化還元プロセスが含まれない。
ポリ硫黄残基のヒドロキシル化は、TME-IAM等によって拮抗され、このヒドロキシル化はROSと内因性に発現する反作用還元システムによって媒介される酸化還元依存性反応とは完全に異なる。
チオレート部分は、モノブロモビマン（MBB）やN-エチルマレイミド（NEM）などの強力な求電子試薬によって急速にアルキル化される。スルフェニル部分は、他のチオール化合物、または、スルフェン酸プローブのジメドンと反応する。したがって、求電子試薬とジメドンは、ポリスルフィドのアルカリ加水分解の平衡にシフトを引き起こし、ポリスルフィドの分解を促進する。
RSSは、多くの種で豊富に内生的に生成されることがよく知られている。タンパク質の生合成中の翻訳プロセスだけでなく、基質のシステインから過硫化物や多硫化物を生成する特定の酵素として、主に、多機能性を持つシステイン過硫黄合成酵素の新しいファミリー、すなわちシステイニル-tRNAシンテターゼ（CARS）が発見された。この発見に関連して非常に重要なのは、CARSのミトコンドリアアイソフォーム（CARS2）が生体内で形成される、殆どの活性硫黄種に関与する主要な酵素であり、ミトコンドリアの生体エネルギー、すなわち硫黄呼吸に寄与する。
これらの硫化物代謝経路を調査するために、最初に、反応性硫黄メタボロミクス分析を開発した。これは、液体クロマトグラフィー質量分析（LC-MS）を利用し、チロシン誘導体による活性硫黄種のトラップまたは誘導体化と組み合わせることによるものである。このアプローチの特異性は、チロシン誘導体とさまざまなRSSおよびポリスルフィドとの化学反応の選択性に依存している。したがって、チロシン誘導体等のOH基を有する化合物を使用することが有効である。
これにより、ポリスルフィドの求電子分解を最小限に抑えることができるが、さまざまなヒドロポリスルフィドのスルフヒドリルの特定の求核置換が可能になる。この結果、硫黄メタボロミクス分析を通じてRSSの特定の検出と定量が保証される。
しかし、前記反応式に示すように、MBBやNEMなどの過酷な求電子剤は、ポリスルフィドの硫黄残基への求核攻撃に関与する可能性があり、これが広範囲のポリスルフィド分解につながる。実際、このプロセスはポリスルフィドのアルカリ誘起加水分解によって開始され、結果としてポリスルフィドからチオレート残基が生成され、MBBおよびNEMによって容易にアルキル化されるが、チロシン誘導体にはこれが認められなかった。
また、ジメドンがチオールまたはポリチオール部分のスルフェニルと反応する際のアルカリ加水分解平衡のシフトによって引き起こされる、このポリスルフィド分解をジメドンが促進する。したがって、独自の硫化物化学の正確な理解が得られない限り、特定のメタボロミクス分析は、多くの生物系に豊富に含まれるRSSおよび反応性ポリスルフィドの分析には適用できない。
たとえば、最も深刻な問題の1つは、NEMとMBBなどの過酷な試薬と硫化水素（H2S）との付加物が、NEM/MBBと、低分子量であるシステインおよびタンパク質システイン残基に結合したポリスルフィドとの反応で頻繁に観察されたことである。
これらの付加物は、MBB/NEMを使用したさまざまなサンプルの処理中に人為的に生成される可能性が高い。CARSは翻訳後または翻訳プロセス中にすべてのCys含有タンパク質のポリスルフィド化を誘導できることが分かっているため、これらの求電子試薬の反応性に関係なく、求電子化合物を使用したメタボロミクス分析において、そのような人工的なビスモノスルフィドアルキル付加物（R-S-R）の形成が最も深刻な問題である。
この困難さは、チロシン誘導体を使用して、人為的な劣化とR-S-Rの形成を最小限に抑えることができる場合でも存在する。発明者は、この技術的な問題を克服するために、LCタンデム質量分析（LC-MS/MS）と組み合わせた、チロシン誘導体トラッピングを使用して、新しい機構的アプローチを検討した。
発明者は、チロシン誘導体による比較的選択的なRSSトラップの実証に加えて、チロシン誘導体自体がポリスルフィドを安定化できることを発見した。実際、発明者は、ポリスルフィドを含む反応混合物にチロシン誘導体を添加すると、チロシン誘導体が強力なポリスルフィド維持効果を発揮することが分かった。この効果は、複数のチロシン誘導体の類似の化学構造（ヒドロキシフェニル基、又は、ヨードアセトアミド基）に起因する可能性がある。
チロシン誘導体のポリスルフィド安定化効果およびヒドロキシフェニル含有化合物は、多くのタンパク質における広範なタンパク質ポリスルフィド化の維持の分子メカニズムのより良い理解に重要な意味を持っている。
ポリスルフィドには、還元型と酸化型があり、R-(S)ｎ-SH（n=1,2,・・・・）が還元型であり、R-(S)ｎ-R（n=2,3,・・・・）が酸化型である。還元型ポリスルフィド（チオール化合物）がLC-MSMS分析されるようにするための疎水性付加とポリスルフィド安定化のために、既述のヒドロキシ化合物であって、還元型ポリスルフィドのチオール基に結合し、そして、安定化することができるものがよい。この化合物として、下記のように、既述のTME-IAMであってよい。
Figure 0007233666000008
ポリスルフィドへの疎水性の付加によって逆相HPLC分離が可能になる。チロシン誘導体を標識化することによって、内部標準物質として利用することができる。チロシン誘導体の“I”を他のハロゲン元素、Cl、F、Brに代えてもよい。ベンゼン環に結合したOHは、オルト、又は、メタの位置に結合してもよい。ベンゼン環を、脂肪族鎖状炭化水素、または、脂肪族環状炭化水素に代えてもよい。ベンゼンをナフタレン、アントラセン等多環式芳香族化合物に代えてもよい。また、ベンゼンを複素環式化合物に代えてもよい。
下記のものは還元型スルフィド、ポリスルフィドの例である。
Figure 0007233666000009
さらに、下記のものは酸化型ポリスルフィドの例である。
Figure 0007233666000010
Figure 0007233666000011
次に、チロシン誘導体の合成、定性分析について説明する。
1-1 試験材料と方法
1-1-1 Tyrosine Methyl Esterとヨード酢酸の脱水縮合反応（TME-IAMの合成）
1-1-1-1 合成
Ｌ-Tyrosine Methyl Ester 1mmolをN,N-ジメチルホルムアミドに溶解し、脱水縮合剤のN,N’-ジシクロヘキシルカルボジイミド2.2 mmolとヨード酢酸1 mmolを加えて氷上で2時間攪拌し、その後室温で1時間攪拌した。
試薬類
N-ヨードアセチルチロシンメチルエステル（TME-IAM）合成
Tyrosine Methyl Ester （東京化成）195.2 mg
N,N -ジメチルホルムアミド（片山化学）2 mL
N,N’-ジシクロヘキシルカルボジイミド（nacalai tesque）453.8 mg
ヨード酢酸（nacalai tesque）186.0 mg
1-1-1-2 生成物確認
合成したTME-IAMの確認のためTyrosine Methyl Ester溶液と反応溶液を希釈後、高速液体クロマトグラフィー（high performance liquid chromatography, HPLC）を用いて220 nm、250 nm、275 nmの吸光度を解析し、反応生成物を確認した。
試薬類
0.1% ギ酸
Formic Acid (abt.99％)（FUJIFILM）1mL
超純水999mL
メタノールLC/MS用（関東化学）
機器類
ポンプ：PU-2085 plus（JASCO）
オートサンプラー：AS-2051 plus（JASCO）
検出器：MD-2010 plus（JASCO）
デガッサー：DG-2085-54（JASCO）
グラジェントミキサー：MX-2080-32（JASCO）
カラムオーブン：CO-2065 plus（JASCO）
HPLC条件
A buffer：0.1% ギ酸
B buffer：メタノール
グラジェント：
Figure 0007233666000012
 流速：1 mL/min
流入量：5 μL
カラム：Mightysil RP-18 GP 75-3.0（5 μm）（関東化学）
1-1-2 TME-IAMの精製
1-1-2-1 ワコーゲル（C18）による粗精製
反応溶液にメタノール4 mLとワコーゲル（C18）1 gを加えた後、攪拌しながら0.1% ギ酸を6 mL加えた。これをエンプティリザーバーに充填してろ過し、さらに1 mLメタノールと0.1% ギ酸1 mLを混合後、エンプティリザーバーに加え溶出液を回収した。これを粗精製液とした。
試薬類
0.1% ギ酸
メタノール（関東化学）
ワコーゲルR100C18（Wako）
1-1-2-2 粗精製の確認
TME-IAMの精製確認のため粗精製液を希釈後、1-1-1-2と同様の条件で220 nm、250 nm、275 nmの吸光度を解析し、反応生成物の回収を確認した。
1-1-2-3 粗精製液中の生成物確認
精製液中のTME-IAMの存在確認のため粗精製液を希釈後、HPLC-タンデム型質量分析装置（LC-MS/MS）を用いた質量分析法によってTME-IAMの存在を確認した。
試薬類
0.1% ギ酸
メタノールLC/MS用（関東化学）
機器類
質量分析機：Xevo TQD（Waters）
HPLC：AllianceHPLC e2695（Waters）
HPLC条件
A buffer：0.1% ギ酸
B buffer：メタノール（LC/MS用）
グラジェント：
Figure 0007233666000013
 流速：0.3 mL/min
流入量：5 μL
カラム：Mightysil RP-18 GP 50-2.0（5 μm）（関東化学）
MS Scan条件
ES+
Q1 scan range（m/z）：50-600
Time（min）：0-9
Cone voltage（V）：10-35
1-1-2-4 TME-IAMの精製
粗精製液を分取カラムを用いたHPLCにインジェクトし、2分ごとの分画で回収した。得られた分画を1-1-1-2と同様の条件で220 nm、250 nm、275 nmの吸光度を解析することでTME-IAMの単離を確認した。
試薬類
0.1% ギ酸
メタノール（関東化学）
機器類
ポンプ：PU-2089 plus（JASCO）
検出器：875-UV（JASCO）
HPLC分画条件
A buffer：0.1% ギ酸
B buffer：メタノール
グラジェント：
Figure 0007233666000014
 流速：3 mL/min
検出波長：275 nm
流入量：1 mL
カラム：CAPCELL PAK C18 UG80 5 μm（SHISEIDO）
1-2 結果
1-2-1 生成物確認
HPLC解析により、反応溶液（図１（B））でTyrosine Methyl Ester標品（図１（A））と異なる新規ピークが検出された。
1-2-2 TME-IAMの精製
1-2-2-1 粗精製画分の確認
HPLC解析により、粗精製画分に反応産物が回収されていることを確認した（図２）。
1-2-2-2 粗精製液中の生成物確認
粗精製液をLC-MC/MSで解析した結果を図３の（Ａ）として示す。得られたクロマトグラムからm/z = 364のクロマトグラムを抽出するとTME-IAMのものと考えられるピークが見られた（図３の（Ｂ））。
1-2-2-3 粗精製液の精製
分取カラムを用いたHPLCにて粗精製画分を精製した結果を図４の（Ａ）に示す。各フラクションをHPLC解析した後、TME-IAMを含むフラクションのみを回収し、TME-IAMの精製標品とした（図４の（Ｂ））。
以上の合成と結果は、TME-IAMに関してのものである。TEE-IAMについては、TME-IAMのための出発原料をL-Tyrosine Methyl Ester (TME)からL-Tyrosine Ethyl Ester (TEE)に変更すればよく、NAT-IAMについては、N-Acetyl-L-tyrosine (NAT)に変更すればよく、定性分析の方法と結果の判定については、TME-IAMに対してのものと同じである。
次に、本発明に係るチロシン誘導体と、活性硫黄種との反応性について検討した。
200 mM リン酸buffer（pH 7.5） 50 μL（終濃度50 mM）と100 mM アルキル化試薬（TME-IAM, TEE-IAM, NAT-IAM, HPE-IAM）またはDMSO 2 μL（終濃度1 mM）、10 mM cysteine 2 μL（終濃度0.1 mM）、超純水146 μLを混合し、遮光下、37℃でインキュベートした。反応開始から1, 3, 8時間後に、反応溶液 10 μLと0.1% ギ酸 90 μLを混合し、反応を終了させた。未反応の10 μM cysteineをスタンダードとして用いてLC-MS/MS解析を行うことで、反応溶液中のcysteineの残存量を解析するとともに、各種アルキル化試薬によるcysteineアダクトの生成を解析した。
機器類
質量分析機 ：Xevo TQD（Waters）
HPLC ：AllianceHPLC e2695（Waters）
HPLCグラジェント条件（cysteine残存量、cystine生成量の解析）
A buffer ：0.1% ギ酸入りアセトニトリル
B buffer ：100 mM ギ酸アンモニウム
Figure 0007233666000015
 流速 ：0.3 mL/min
流入量 ：5 μL
カラム ：Intrada amino acid column (50×2.0 mm inner diameter)（Imtakt）
HPLCグラジェント条件（各種アルキル化試薬によるcysteineアダクトの解析）
A buffer ：0.1%ギ酸
B buffer ：メタノール（LC/MS用）
Figure 0007233666000016
 流速 ：0.3 mL/min
流入量 ：5 μL
カラム ：Mightysil RP-18 GP 50-2.0（5 μm）（関東化学）
多反応モニタリング条件
Figure 0007233666000017
TME-IAMは、前記非特許文献記載のチロシン誘導体あるHPE-IAMと同程度のチオール基（システイン）との反応性を持つことが確認された。TEE-IAM、NAT-IAMは、TME-IAMおよびHPE-IAMと比べシステインとの反応性は低いことがわかった。結果を図５に示す。なお、HPE-IAMは下記の化学式である。
HPE-IAM：
Figure 0007233666000018
次に、新規チロシン誘導体を含む各アルキル化試薬の活性イオウ分子の安定化効果を評価した。活性イオウ分子のモデル化合物として酸化型グルタチオンテトタスルフィド（oxidized glutathione tetrasulfide, GS-SS-SG）を用いた。
200 mM リン酸buffer（pH 7.0） 50 μL（終濃度100 mM）と20 mM アルキル化試薬（TME-IAM, HPE-IAM, MBB, IAM）またはDMSO 5 μL（終濃度1 mM）、100 μM GS-SS-SG 10 μL（終濃度10 μM）、超純水 35 μLを混合し、遮光下、37℃でインキュベートした。反応開始から1, 2, 3, 4時間後に、反応溶液 10 μLと0.1% ギ酸 90 μLを混合し、反応を終了させた。未反応の1 μM GS-SS-SGをスタンダードとして用いてLC-MS/MS解析を行うことで、反応溶液中のGS-SS-SGの残存量を解析した。
機器類
質量分析機 ：Xevo TQD（Waters）
HPLC ：AllianceHPLC e2695（Waters）
HPLCグラジェント条件
A buffer ：0.1%ギ酸
B buffer ：メタノール（LC/MS用）
Figure 0007233666000019
 流速 ：0.3 mL/min
流入量 ：5 μL
カラム ：Mightysil RP-18 GP 50-2.0（5 μm）（関東化学）
多反応モニタリング条件
Figure 0007233666000020
GS-SS-SGは37℃、中性pH（pH 7.0）中でインキュベートするだけで自己分解することが知られており、公知のアルキル化試薬の中でも反応性の高い化合物であるmonobromobimane (MBB)を添加することで、その分解が促進される。
一方で、公知のヨードアセトアミド誘導体であるHPE-IAMを添加した場合は、GS-SS-SGの自己分解は優位に阻害された。さらに、TME-IAMを添加した群では4時間インキュベート後でも、約80％のGS-SS-SGが残存していたことから、新規アルキル化試薬であるTME-IAMは高い活性イオウ分子安定化活性を持つことが示された。結果を図６に示す。
次に、TME-IAMのGS-SS-SG保護効果のｐＨの影響を評価した。活性イオウ分子GS-SS-SGは酸性条件下で安定であり、アルカリ条件下では非常に不安定であることが明らかにされている。
200 mM リン酸buffer（pH 7.0, 7.5 8.0） 50 μL（終濃度100 mM）と20 mM TME-IAM溶液 5 μL（終濃度1 mM）、100 μM GS-SS-SG 10 μL（終濃度10 μM）、超純水 35 μLを混合し、遮光下、37℃でインキュベートした。反応開始から1時間後に、反応溶液 10 μLと0.1% ギ酸 90 μLを混合し、反応を終了させた。未反応の1 μM GS-SS-SGをスタンダードとして用いてLC-MS/MS解析を行うことで、反応溶液中のGS-SS-SGの残存量を解析した。
機器類
質量分析機 ：Xevo TQD（Waters）
HPLC ：AllianceHPLC e2695（Waters）
HPLCグラジェント条件
A buffer ：0.1%ギ酸
B buffer ：メタノール（LC/MS用）
Figure 0007233666000021
 流速 ：0.3 mL/min
流入量 ：5 μL
カラム ：Mightysil RP-18 GP 50-2.0（5 μm）（関東化学）
多反応モニタリング条件
Figure 0007233666000022
TME-IAMを共存させた系においては、弱アルカリ溶液（pH8.0）中で37℃、1時間インキュベート後においても約70%のGS-SS-SGが残存していた。これは公知のヨードアセトアミド誘導体HPE-IAMを添加した系よりも高い値だった。結果を図７に示す。
高感度に活性イオウ分子を検出するためには、安定な誘導体を形成することが重要である。そのためには、高濃度のアルキル化試薬を検体に添加する必要があるが、高濃度のアルキル化試薬の添加は活性イオウ分子の分解を促進することが知られている（非特許文献１）。そこで、活性イオウ分子GS-SS-SGを用いて、TME-IAMの活性イオウ分子安定化活性の処理濃度依存性を解析した。
200 mM リン酸buffer（pH 7.0） 50 μL（終濃度100 mM）とTME-IAM溶液5-20 μL（終濃度0.25, 0.5, 1, 2, 4 mM）、100 μM GS-SS-SG 10 μL（終濃度10 μM）、超純水 20-35 μLを混合し、遮光下、37℃でインキュベートした。反応開始から1時間後に、反応溶液 10 μLと0.1% ギ酸 90 μLを混合し、反応を終了させた。未反応の1 μM GS-SS-SGをスタンダードとして用いてLC-MS/MS解析を行うことで、反応溶液中のGS-SS-SGの残存量を解析した。
機器類
質量分析機 ：Xevo TQD（Waters）
HPLC ：AllianceHPLC e2695（Waters）
HPLCグラジェント条件
A buffer ：0.1%ギ酸
B buffer ：メタノール（LC/MS用）
Figure 0007233666000023
 流速 ：0.3 mL/min
流入量 ：5 μL
カラム ：Mightysil RP-18 GP 50-2.0（5 μm）（関東化学）
多反応モニタリング条件
Figure 0007233666000024
その結果、GS-SS-SGの400倍量濃度のTME-IAM存在下で37℃、1時間インキュベートした群においても、優位なGSSSSGの減少は認められなかった。すなわち、TME-IAMを用いることで、活性イオウ分子の誘導体形成およびその生成物の分解抑制チオール非常に高いことが分かった。結果を図８に示す。
活性イオウ分子には、分子内に含まれるイオウ原子数の異なる化合物が存在することが明らかにされている。一般に、より多くのイオウ原子を含む化合物ほど反応性が高く、不安定な分子である。そこで、TME-IAMの活性イオウ分子安定化効果をイオウ原子含有数の異なる活性イオウ分子を用いて解析した。この解析では、GS-SS-SGに加え、酸化型グルタチオンペンタスルフィド（oxidized glutathione pentasulfide, GS-SSS-SG）および、酸化型グルタチオントリスルフィド（oxidized glutathione trisulfide, GS-S-SG）を用いた。
200 mM リン酸buffer（pH 7.0） 50 μL（終濃度100 mM）と100 mM TME-IAM溶液 5 μL（終濃度1 mM）、100 μM 酸化型グルタチオンポリスルフィド（GS-SSS-SG, GS-SS-SG, GS-S-SG）
10 μL（終濃度10 μM）、超純水 35 μLを混合し、遮光下、37℃でインキュベートした。反応開始から1時間後に、反応溶液 10 μLと0.1% ギ酸 90 μLを混合し、反応を終了させた。未反応の1 μM 各酸化型グルタチオンポリスルフィド（GS-SSS-SG, GS-SS-SG, GS-S-SG）をスタンダードとして用いてLC-MS/MS解析を行うことで、反応溶液中の酸化型グルタチオンポリスルフィドGS-SSS-SG, GS-SS-SG, GS-S-SG）の残存量を解析した。
機器類
質量分析機 ：Xevo TQD（Waters）
HPLC ：AllianceHPLC e2695（Waters）
HPLCグラジェント条件
A buffer ：0.1%ギ酸
B buffer ：メタノール（LC/MS用）
Figure 0007233666000025
 流速 ：0.3 mL/min
流入量 ：5 μL
カラム ：Mightysil RP-18 GP 50-2.0（5 μm）（関東化学）
多反応モニタリング条件
Figure 0007233666000026
その結果、非常に不安定なGS-SSS-SGにおいても、処理後30分でTME-IAMによる優位な分解抑制が認められた。結果を図９に示す。
TME-IAMがシステインヒドロポリスルフィド[CysS-(S)n-H]に対して持つ反応性について、HPE-IAMと比較して以下のように検証した。結果を図１０に示す。
100 μMのシスチンおよび300 μMのNa2S2を、37℃で5分間インキュベートすることによって調製されたCysSSH / CysS-(S)n-Hを、TME-IAMまたはHPE-IAM（それぞれ1 mM）と37℃で1時間反応させた。
次に、その反応混合物をLC-ESI-MS/MS分析に供して、CysSH / CysS-(S)n-HおよびHS-（ビス-S-付加物）のそれぞれの付加物を検出した。
なお、硫黄としての各化合物の濃度は、硫黄としての濃度=化合物としての濃度×化合物中の硫黄原子の数（たとえば、CysSSHの場合、硫黄としての濃度= 2×[CysSSH]）という式で計算される。図１０において、化合物および硫黄としてのそれぞれの付加物の濃度は、それぞれ斜めの縞の棒、縞なし棒として示されている。
図１０に示すように、TME-IAMを使用して検出されたCysSSHおよびシステインヒドロトリスルフィド（CysSSSH）の量は、HPE-IAMを使用して検出された量よりも大幅に多かった。それに対し、HS-（ビス-S付加物）硫化水素および過硫化物/多硫化物の分解に由来する生成物の量は、TME-IAMを使用して検出されたものよりもHPE-IAMグループの方が顕著に高かった。
この結果は、TME-IAMがIAM基を介してヒドロポリスルフィドのチオール残基と反応して安定な付加物を形成するのに対し、そのヒドロキシフェニル部分は加水分解を阻害することによってポリスルフィドを安定化させることを示唆している。
TME-IAMの細胞透過性とエステラーゼ感受性について、以下のテストをした。結果を図１１に示す。図１１には、TME-IAMで処理したHEK（ヒト胎児腎臓）293T細胞（A）とマウス肝臓ホモジネート（B）との、代表的なマスクロマトグラフが示されている。
HEK293T細胞を1mMのTME-IAMを用いて37℃で1時間処理した後、80％メタノール中で超音波処理してホモジナイズした。マウス肝臓組織も、1 mMのTME-IAMを含む80％メタノール中で超音波処理してホモジナイズし、37℃で1時間インキュベートした。それぞれを遠心分離後、得られた上清を収集し、0.1％のFA（ギ酸）を使用して10倍に希釈した。
次に、混合物をLC-ESI-MS/MS分析にかけ、TME-IAM、そのグルタチオン付加物（GS-AM-TME）、およびエステラーゼ依存性切断に由来する個々の副産物を検出した。それぞれ、Tyr-IAM（（2-ヨードアセチル）-l-チロシン）とGS-AM-Tyr（（2-ヨードアセチル）-1-チロシンのGSH付加物）である。
MS分析では、TME-IAMと（2-ヨードアセチル）-1-チロシン（Tyr-IAM）の両方（TME-IAM処理でTME-IAMのメチルエステル部分のエステラーゼ依存性切断に由来する生成物）が、ヒト胎児腎臓（HEK）293T細胞で観察された。（図１１Ａ）
さらに、GSHのTME-IAM付加物とエステラーゼ依存性切断に由来するその副産物（（2-ヨードアセチル）-1-チロシン[GS-AM-Tyr]のGSH付加物）との両方が、TME-IAM処理された細胞で観察された。（図１１Ａ）
これらの結果は、TME-IAMが細胞膜に浸透してチオールと反応できることを示しているが、細胞内エステラーゼによってメチルエステル部分で切断された生成物によって、アルキル化剤は急速に分解される可能性がある。
そのため、さらに、in vivoサンプルを反応性硫黄メタボローム分析に利用した場合にこれらの誘導体が形成される可能性を評価するため、1 mMのTME-IAMを含む80％メタノールで調製し、37℃で1時間インキュベートしたマウス肝臓組織をホモジネートしたものを、LC-ESI-MS/MSで分析した。
結果、TME-IAMのエステラーゼ依存性副産物であるTyr-IAMは、TME-IAMを含む80％メタノールでホモジナイズしたin vivoサンプルでは、ほとんど検出されなかった。（図１１Ｂ）
硫化水素に対するTME-IAMの反応性を、MBBの反応性を参考に比較して試験したものを、図１２に示す。図１２には、Na2Sとアルキル化剤のモル比が1：1（上）または1：10（下）の場合の代表的なマスクロマトグラフが示されている。
0.1 mMまたは1 mMのTME-IAM（図１２右）またはMBB（図１２左）を0.1 mMのNa2Sの存在下で37°Cで1時間インキュベートした。結果、反応混合物中のそれぞれのHS-付加物およびbis-S-付加物が、LC-ESI-MS/MS分析によって検出された。
反応混合物は、YMC-Triart C18カラム（内径50×2.0 mm）を備えたAlliance e2695システムによって分離され、その後、移動相としてメタノールを使用して直線勾配（30～99％、5分）で、0.1％FA（formic acid）の存在下、流速0.3 mL/min、40°C、で溶出された。
結果、この実験では、MBBとTME-IAMの両方が硫化水素と反応してビスＳ付加物を形成することを確認できた。
また、N-ヨードアセチルチロシン（本発明のチロシン誘導体の構造式のeをOHに置換したもの）は、TME-IAMと同程度のGS-SS-SG保護効果があることが明らかになった。結果を図１２に示す。なお、N-ヨードアセチルチロシンは下記の化学式である。
N-ヨードアセチルチロシン：
Figure 0007233666000027

Claims (7)

  1. 下記化学式からなる新規なチロシン誘導体。
    Figure 0007233666000028
     ａ－ｃの一つが“ＯＨ”であり、残りが“Ｈ”であり、
    ｄは、ＣｎＨ２ｎαであり、αは“Ｈ”、又は、“ハロゲン原子”であり、ｎは１～５の整数であり、
    ｅは、（ＮＨ）ｘ（ＣＯ）ｙＣｚＨ２ｚβであり、ｘは１又は０、ｙは１又は０、ｚは１～５の整数、βは“Ｈ”、又は、“ハロゲン原子”であり、
    αもしくはβの少なくとも一方は、ハロゲン原子である。
  2. 下記化学式からなる、請求項１記載の新規なチロシン誘導体。
    Figure 0007233666000029
  3. 請求項１または２に記載のチロシン誘導体を主成分として含む、ポリスルフィドの加水分解を抑制するための化合物。
  4. 前記チロシン誘導体がポリスルフィドのチオール基と結合している請求項３記載の化合物。
  5. ポリスルフィドのチオール基と結合し、当該チオール基をアルキル化する、請求項３記載の化合物。
  6. ポリスルフィドに結合した請求項３記載の化合物を検出して、前記ポリスルフィドの定性、定量分析を可能にする、ポリスルフィドの分析方法。
  7. ポリスルフィドに請求項３記載の化合物を作用させて、前記ポリスルフィドの加水分解を抑制する方法。
JP2022503751A 2020-02-28 2021-02-26 ポリスルフィドの安定化 Active JP7233666B2 (ja)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2020034471 2020-02-28
JP2020034471 2020-02-28
PCT/JP2021/007397 WO2021172523A1 (ja) 2020-02-28 2021-02-26 ポリスルフィドの安定化

Publications (3)

Publication Number Publication Date
JPWO2021172523A1 JPWO2021172523A1 (ja) 2021-09-02
JPWO2021172523A5 JPWO2021172523A5 (ja) 2022-09-26
JP7233666B2 true JP7233666B2 (ja) 2023-03-07

Family

ID=77491275

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2022503751A Active JP7233666B2 (ja) 2020-02-28 2021-02-26 ポリスルフィドの安定化

Country Status (5)

Country Link
US (1) US20230147021A1 (ja)
EP (1) EP4112597A4 (ja)
JP (1) JP7233666B2 (ja)
CN (1) CN115515928B (ja)
WO (1) WO2021172523A1 (ja)

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1059531A1 (en) * 1999-06-09 2000-12-13 Alfred Prof. Dr. Nordheim Labelling of peptides and proteins
AU2002952747A0 (en) * 2002-11-18 2002-12-05 Ludwig Institute For Cancer Research Method for analysing peptides
CN105866300B (zh) * 2016-06-15 2017-06-16 博莱克科技（武汉）有限公司 一种氨基代谢物的测定方法

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ADBERHALDEN, Emil; GUGGENHEIM, Markus，Further Contribution to Knowledge of 3,5-Diiode-1-tyrosine，Berichte der Deutschen Chemischen Gesellschaft，1908年，vol.41，pp.2852-2857
GUERITTE, Francoise et al.，Antitumor compounds in vinblastine group: nor-5'-anhydrovinblastine derivatives，European Journal of Medicinal Chemistry，1983年，vol.18, no.5，pp.419-424

Also Published As

Publication number Publication date
EP4112597A1 (en) 2023-01-04
CN115515928A (zh) 2022-12-23
WO2021172523A1 (ja) 2021-09-02
JPWO2021172523A1 (ja) 2021-09-02
EP4112597A4 (en) 2024-04-10
CN115515928B (zh) 2024-05-10
US20230147021A1 (en) 2023-05-11

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Hamid et al. Polysulfide stabilization by tyrosine and hydroxyphenyl-containing derivatives that is important for a reactive sulfur metabolomics analysis
Huang et al. Use of isotope differential derivatization for simultaneous determination of thiols and oxidized thiols by liquid chromatography tandem mass spectrometry
Thevis et al. Characterization of two major urinary metabolites of the PPARδ-agonist GW1516 and implementation of the drug in routine doping controls
Baez et al. Mass spectrometry in studies of protein thiol chemistry and signaling: opportunities and caveats
Ohnuma et al. Activation of the Nrf2/ARE pathway via S-alkylation of cysteine 151 in the chemopreventive agent-sensor Keap1 protein by falcarindiol, a conjugated diacetylene compound
Takata et al. Methods in sulfide and persulfide research
Uutela et al. Discovery of dopamine glucuronide in rat and mouse brain microdialysis samples using liquid chromatography tandem mass spectrometry
Devarie-Baez et al. Direct methods for detection of protein S-nitrosylation
CN109836394B (zh) 一种用于识别硫化氢的近红外荧光探针及其制备方法和应用
Ito et al. Hydrophilic interaction liquid chromatography–tandem mass spectrometry for the quantitative analysis of mammalian-derived inositol poly/pyrophosphates
Lan et al. A simple liquid chromatography tandem mass spectrometric method for fast detection of hydrogen sulfide based on thiolysis of 7-nitro-2, 1, 3-benzoxadiazole ether
Dias et al. Analytical methods to monitor dopamine metabolism in plasma: Moving forward with improved diagnosis and treatment of neurological disorders
Smith et al. The challenge of detecting modifications on proteins
Sun et al. A label-free Sirtuin 1 assay based on droplet-electrospray ionization mass spectrometry
Mao et al. New method for HPLC separation and fluorescence detection of malonaldehyde in normal human plasma
Benkova et al. Determination of plasma aminothiols by high performance liquid chromatography after precolumn derivatization with N-(2-acridonyl) maleimide
JP7233666B2 (ja) ポリスルフィドの安定化
Meng et al. A red emitting fluorescent probe for imaging mitochondrial hydrogen polysulfide in living cells and tissues
Chen et al. Chemical proteomic profiling of protein 4′‐phosphopantetheinylation in mammalian cells
Payne et al. Can dimedone be used to study selenoproteins? An investigation into the reactivity of dimedone toward oxidized forms of selenocysteine
Liu et al. Isotope dilution mass spectrometry for the quantification of sulfane sulfurs
Kataoka et al. Determination of cysteamine and cystamine by gas chromatography with flame photometric detection
Yukinaga et al. Glutathione S-transferase pi trapping method for generation and characterization of drug–protein adducts in human liver microsomes using liquid chromatography–tandem mass spectrometry
US20230139837A1 (en) Photo-Cleavable Surfactants
Zhu et al. Phenol-selective mass spectrometric analysis of jet fuel

Legal Events

Date Code Title Description
A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20220617

A621 Written request for application examination

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621

Effective date: 20220617

A871 Explanation of circumstances concerning accelerated examination

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A871

Effective date: 20220617

AA64 Notification of invalidation of claim of internal priority (with term)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A241764

Effective date: 20220705

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20220826

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20221011

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20221209

TRDD Decision of grant or rejection written
A01 Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01

Effective date: 20230131

A61 First payment of annual fees (during grant procedure)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61

Effective date: 20230214

R150 Certificate of patent or registration of utility model

Ref document number: 7233666

Country of ref document: JP

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150