CN114518424B - 一种神曲中氨基酸成分的含量测定方法及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明关于中药分析技术领域，尤其涉及一种神曲中氨基酸成分的含量测定方法及其应用。本发明通过对待测溶液制备方法及色谱条件的优化，构建的含量测定方法能够应用于不同批次神曲中14个氨基酸成分的同时定量研究，准确性好、灵敏度高、稳定性好、操作简便，可应用于后续神曲的质量控制。
Description
技术领域
本发明属于中药分析技术领域，尤其涉及一种神曲中氨基酸成分的含量测定方法及应用。
背景技术
神曲，又名六神曲、六曲，是由青蒿、辣蓼、苍耳草、苦杏仁、赤小豆与面粉、麦麸混合发酵而成的传统复方发酵制剂，具有消食调中、健脾和胃的功效，在临床上常用于治疗脾胃虚弱、饮食停滞、胸痞腹胀、小儿食积等症。
神曲尚未被现行药典收录，且各地标准不一，市售产品质量参差不齐。关于其化学成分的研究多局限于原料药所含化学成分，而在发酵过程中的转化规律较为复杂且研究较少，严重影响了神曲临床应用的安全性与有效性。蛋白酶作为神曲中消化酶的一种，可将大分子蛋白质分解，释放出游离的氨基酸。而目前关于神曲中氨基酸成分的变化规律尚未报道，因此需要建立神曲中氨基酸含量的检测方法，应用于神曲发酵过程氨基酸含量的检测，从而进一步探究其发酵机理以及对其进行质量控制。
发明内容
针对以上技术问题，本发明提供了一种神曲中氨基酸成分的含量测定方法和应用，该含量测定方法能够实现神曲中十余种氨基酸成分的同时定量检测，准确性好、灵敏度高、稳定性好、操作简便，可应用于神曲的质量控制。
为解决上述技术问题，本发明第一方面提供了一种神曲中氨基酸成分的含量测定方法：
对神曲粉末进行提取，得到神曲提取液；用三乙胺乙腈溶液和异硫氰酸苯酯乙腈溶液对所述神曲提取液进行衍生化，得到待测溶液；
用超高效液相色谱法对所述待测溶液中的氨基酸成分进行含量测定，所述超高效液相色谱法的色谱条件为：
色谱柱：C18键合硅胶色谱柱；
流动相：流动相A为0.1mol/L醋酸钠缓冲溶液，pH＝6.5；流动相B为乙腈；进行梯度洗脱，所述梯度洗脱的程序如下：
流速：0.28～0.32mL/min；
柱温：38～42℃；
检测波长为252～256nm。
相对于现有技术而言，本发明提供的含量检测方法能简单、快速、准确地测定神曲中十余种氨基酸成分的含量，且该方法准确性好、灵敏度高、稳定性好，可用于神曲中氨基酸成分含量测定等相关研究。
其中梯度洗脱具体是表示：0～4min流动相A的体积百分比由99％匀速降至85％，4～5min流动相A的体积百分比由85％匀速降至81％，5～6min流动相A的体积百分比由81％匀速降至79％，6～10min流动相A的体积百分比由79％匀速降至63％。
结合第一方面，所述氨基酸成分包括天冬氨酸、谷氨酸、丝氨酸、甘氨酸、谷氨酰胺、组氨酸、丙氨酸、脯氨酸、酪氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸和赖氨酸。
结合第一方面，所述色谱柱优选采用ACQUITYBEH C18柱，规格为2.1×100mm，1.7μm。
结合第一方面，流速、柱温、检测波长可进一步选用优选值，以获得更准确的检测结果，优选值分别为：流速0.3mL/min，柱温40℃，检测波长254nm。
结合第一方面，所述异硫氰酸苯酯乙腈溶液中异硫氰酸苯酯的浓度为0.1mol/L～0.5mol/L，进一步优选的浓度为0.4mol/L。
三乙胺乙腈溶液中三乙胺的浓度选用常规衍生化操作的浓度即可，如1mol/L。
结合第一方面，所述衍生化的时间为20～100min，所述衍生化的温度为20℃～50℃，进一步优选的时间为80min，温度为30℃。
结合第一方面，在对神曲粉末进行提取时，优选采用0～0.1mol/L盐酸溶液对神曲粉末进行超声提取。进一步优选用水对神曲粉末超声提取。
优选地，所述神曲粉末与所述盐酸溶液的质量体积比为1:20～100(g:mL)，进一步优选为1:50(g:mL)。
优选地，超声提取时间为20～40min，更优选采用30min。
结合第一方面，该含量测定方法还包括向所述待测溶液中加入正亮氨酸内标溶液，以待测溶液的峰面积与内标溶液的峰面积之比(即相对峰面积)进行计算，以减少衍生化对于样品前处理的影响所导致的计算结果误差。
本发明提供的上述含量测定方法可采用以下步骤进行神曲中氨基酸成分的含量测定：
步骤a、对神曲粉末进行提取，得到神曲提取液；
步骤b、配制待测氨基酸的混合对照品溶液；
步骤c、用衍生化试剂对神曲提取液和氨基酸的混合对照品溶液进行衍生化处理，得供试品溶液和衍生化对照品溶液；
步骤d、用上述超高效液相色谱法对供试品溶液和衍生化对照品溶液进行测定，用标准曲线法计算供试品中待测氨基酸成分的含量。
本发明第二方面提供了上述含量测定方法在神曲质量控制中的应用，所述质量控制包括用所述含量测定方法检测神曲中的天冬氨酸、谷氨酸、丝氨酸、甘氨酸、谷氨酰胺、组氨酸、丙氨酸、脯氨酸、酪氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸和赖氨酸。
附图说明
图1是本发明实施例1中衍生化对照品溶液的超高效液相色谱图；
图2是本发明实施例1中供试品溶液的超高效液相色谱图；
图3是本发明实施例23中发酵过程中14个氨基酸成分的含量变化折线图。
图4是本发明对比例1中供试品溶液的超高效液相色谱图；
图5是本发明对比例2中供试品溶液的超高效液相色谱图；
图6是本发明对比例3中供试品溶液的超高效液相色谱图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及具体实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
通过实验研究发现，神曲中含有多种氨基酸，包括天冬氨酸、谷氨酸、丝氨酸、甘氨酸、谷氨酰胺、组氨酸、丙氨酸、脯氨酸、酪氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸和赖氨酸等，各氨基酸的含量受发酵程度影响，而氨基酸的组成和含量对于神曲的临床有效性具有重要意义。因此，有必要对神曲中的氨基酸含量进行深入研究，以便于对其进行质量控制。但是，若对神曲的氨基酸成分进行逐一定量需要消耗大量时间，在其深入研究和将来在质量控制中的应用均较为不便。
为了能实现快速定量神曲中的多种氨基酸成分，本发明实施例提供了一种神曲中氨基酸成分的含量测定方法，该含量测定方法通过对待测溶液制备方法及色谱条件的优化，能够同时检测出神曲中的天冬氨酸、谷氨酸、丝氨酸、甘氨酸、谷氨酰胺、组氨酸、丙氨酸、脯氨酸、酪氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸和赖氨酸。
下面分多个实施例对本发明实施例进行进一步的说明。
以下实施例中，内标溶液的制备方法为：取内标正亮氨酸约5mg，加适量0.1mol/L盐酸溶液溶解，得到62.50μg/mL的内标溶液，置4℃冰箱中保存备用。
实施例1
本发明实施例提供了一种神曲中氨基酸成分的含量测定方法，包括如下步骤：
步骤a、神曲提取液的制备
取神曲样品粉末(过3号筛)约0.5g，精密称定，置于25mL容量瓶，加水适量，超声处理(功率600W，频率35kHz)30min，放冷，加入1mol/L盐酸溶液2.5mL，加水定容至25mL。12700rpm离心10min，取上清液，即为神曲提取液。
步骤b、氨基酸混合对照品溶液的制备
取14种对照品(天冬氨酸、谷氨酸、丝氨酸、甘氨酸、谷胺酰胺、组氨酸、丙氨酸、脯氨酸、酪氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、赖氨酸)适量，精密称定，分别用0.1mol/L盐酸溶液溶解，配制成浓度分别为天冬氨酸2.060mg/mL、谷氨酸4.180mg/mL、丝氨酸3.956mg/mL、甘氨酸2.128mg/mL、谷氨酰胺4.160mg/mL、组氨酸2.016mg/mL、丙氨酸2.343mg/mL、脯氨酸3.986mg/mL、酪氨酸4.246mg/mL、缬氨酸4.960mg/mL、异亮氨酸2.218mg/mL、亮氨酸1.969mg/mL、苯丙氨酸2.103mg/mL、赖氨酸2.367mg/mL的对照品储备液。取各储备液适量，配制成混合对照品溶液，含天冬氨酸98.88μg/mL、谷氨酸200.6μg/mL、丝氨酸110.8μg/mL、甘氨酸76.61μg/mL、谷氨酰胺299.5μg/mL、组氨酸52.42μg/mL、丙氨酸187.4μg/mL、脯氨酸637.8μg/mL、酪氨酸67.94μg/mL、缬氨酸79.36μg/mL、异亮氨酸70.98μg/mL、亮氨酸110.3μg/mL、苯丙氨酸71.50μg/mL、赖氨酸94.68μg/mL。
步骤c、通过衍生化制备供试品溶液及衍生化对照品溶液
分别取神曲提取液和混合对照品溶液各200μL置离心管中，加内标溶液20μL，分别加入1mol/L三乙胺乙腈溶液、0.4mol/L异硫氰酸苯酯乙腈溶液各100μL，混匀，30℃下放置80min进行衍生化，随后加正己烷400μL，振荡，静置分层，取下层溶液100μL，加200μL水稀释，混匀，12700rpm离心10min，取上清液，即得供试品溶液和衍生化对照品溶液。
步骤d、用Waters ACQUITY UPLC H-Class PLUS超高效液相色谱仪对上述衍生化对照品溶液和供试品溶液进行测定，色谱条件为：
色谱柱：ACQUITYBEH C18(2.1×100mm，1.7μm)；
柱温：40℃；
进样量：2μL；
流速：0.3mL/min；
检测波长：254nm；
流动相：流动A相为0.1mol/L醋酸钠缓冲溶液(pH＝6.5)，流动B相为乙腈；
梯度洗脱程序为：
衍生化对照品溶液的超高效液相色谱图如图1所示；
供试品溶液的超高效液相色谱图如图2所示。
采用标准曲线法计算样品中14个成分的含量，公式如下：
其中，w为神曲粉末中14个氨基酸成分的含量，单位为mg/g；
Cs-n为14个氨基酸成分混合对照品溶液的浓度，单位为mg/mL；
RAn分别为供试品溶液中14个氨基酸成分的相对峰面积；
RAs-n分别为衍生化对照品溶液中14个氨基酸成分的相对峰面积；
n为不同氨基酸；
W为待测神曲粉末的实际称样量，单位为g。
检验例1
本发明检验例提供了实施例1中神曲中氨基酸成分含量测定的方法学研究：
(1)线性关系和检测限、定量限研究
按照实施例1中步骤b的方法制备神曲氨基酸混合对照品溶液，逐级稀释成系列不同浓度，再按照实施例1中步骤c的方法分别进行衍生化处理，制成不同浓度的衍生化对照品溶液，采用超高效液相色谱法测定各氨基酸的峰面积，色谱条件同实施例1中的步骤d，并以正亮氨酸为内标计算相对峰面积。平行进样2次，以各氨基酸对照品浓度为横坐标x(μg/mL)，相应浓度的对照品相对峰面积为纵坐标y，绘制回归方程；以信噪比S/N＝3为检测限(LOD)、S/N＝10为定量限(LOQ)，测定14个氨基酸的检测限和定量限，结果见表1。
表1神曲中氨基酸成分的线性回归方程、线性范围、相关系数、检测限和定量限
由表1可知，各成分在各自的浓度范围内线性关系良好(r2≥0.999)，检测限为0.04107～0.5200μg/mL，定量限为0.1232～1.560μg/mL，表明本发明提供的神曲中氨基酸成分的含量测定方法灵敏度较高。
(2)精密度试验
(a)日内精密度试验
按照实施例1中步骤a的方法制备神曲提取液，并按照实施例1中步骤c的方法进行衍生化处理得到供试品溶液。精密吸取同一份上述衍生化后的供试品溶液，重复进样6次，采用超高效液相色谱法测定各氨基酸的峰面积，色谱条件同实施例1中的步骤d。分别以14个氨基酸比内标峰面积的相对峰面积计算RSD值，结果见表2。
表2神曲氨基酸成分含量测定的日内精密度试验结果(n＝6)
由表2可知，本发明提供的神曲中14个氨基酸成分的含量测定方法的日内精密度RSD≤1.5％。
(b)日间精密度试验
按照实施例1中步骤a的方法制备神曲提取液，并按照实施例1中步骤c的方法进行衍生化处理得到供试品溶液，连续3天，精密吸取同一份上述衍生化后的供试品溶液，重复进样6次，采用超高效液相色谱法测定各氨基酸的峰面积，色谱条件同实施例1中的步骤d。分别以14个氨基酸比内标峰面积的相对峰面积计算RSD值，结果见表3。
表3神曲中氨基酸成分含量测定的日间精密度试验结果(n＝3)
由表3可知，本发明提供的神曲中氨基酸成分的含量测定方法的日间精密度RSD≤2.9％。
由表2和表3可知，本发明提供的神曲中14个氨基酸成分的含量测定方法精密度良好。
(3)重复性试验
按照实施例1中步骤a的方法平行制备6份神曲提取液，并按照实施例1中步骤c的方法进行衍生化处理得到供试品溶液，采用超高效液相色谱法测定各氨基酸的峰面积，色谱条件同实施例1中的步骤d。以标准曲线法计算14个氨基酸的含量及RSD值，结果见表4。
表4神曲中14个氨基酸成分含量测定的重复性试验结果(n＝6)
由表4可知，本发明提供的神曲中14个氨基酸成分的含量测定方法的重复性试验RSD≤1.6％，表明该方法重复性良好。
(4)稳定性试验
按照实施例1中步骤a的方法制备神曲提取液，并按照实施例1中步骤c的方法进行衍生化处理，得到供试品溶液，在室温下保存，分别于0、2、4、6、8、10、12h精密吸取同一份上述供试品溶液，通过超高效液相色谱法对上述供试品溶液进行测定，色谱条件同实施例1中的步骤d。分别以14个氨基酸比内标峰面积的相对峰面积计算RSD值，结果见表5。
表5神曲中氨基酸成分含量测定的稳定性试验结果(n＝7)
由表5可知，本发明提供的神曲中14个氨基酸成分测定方法的稳定性试验RSD≤1.6％，说明该供试品溶液在常温条件下12h内稳定性良好。
(5)加样回收率试验
取神曲样品粉末0.25g，精密称定，准确加入与样品中各氨基酸质量相当的混合对照品溶液5mL(含天冬氨酸39.91μg/mL、谷氨酸76.00μg/mL、丝氨酸47.47μg/mL、甘氨酸28.31μg/mL、谷氨酰胺164.2μg/mL、组氨酸20.00μg/mL、丙氨酸79.34μg/mL、脯氨酸200.3μg/mL、酪氨酸20.94μg/mL、缬氨酸37.10μg/mL、异亮氨酸31.45μg/mL、亮氨酸45.81μg/mL、苯丙氨酸30.88μg/mL、赖氨酸48.70μg/mL)，按照实施例1中步骤a的方法制备6份神曲提取液，并按照实施例1中步骤c的方法进行衍生化处理得到供试品溶液，采用超高效液相色谱法对上述供试品溶液进行测定，色谱条件同实施例1中的步骤d，每份样品平行测定2次。根据加样回收率公式计算14个氨基酸的加样回收率及RSD值，考察该方法的准确性。
加样回收率公式如下：
结果见表6。
表6神曲氨基酸成分含量测定的加样回收率试验结果(n＝6)
由表6可知，本发明提供的神曲中氨基酸成分的含量测定方法的平均加样回收率在93.8％～108.4％，说明各化合物加样回收率基本符合要求，该方法准确可行。
由表1～6可知通过本发明提供的神曲中氨基酸成分的含量测定方法符合含量测定方法学研究要求，可以用于神曲样品中氨基酸的定量分析。
实施例2
本发明实施例提供了一种神曲中氨基酸成分的含量测定方法，步骤和参数同实施例1，不同之处在于异硫氰酸苯酯乙腈溶液中异硫氰酸苯酯的浓度为0.1mol/L。
实施例3
本发明实施例提供了一种神曲中氨基酸成分的含量测定方法，步骤和参数同实施例1，不同之处在于异硫氰酸苯酯乙腈溶液中异硫氰酸苯酯的浓度为0.2mol/L。
实施例4
本发明实施例提供了一种神曲中氨基酸成分的含量测定方法，步骤和参数同实施例1，不同之处在于异硫氰酸苯酯乙腈溶液中异硫氰酸苯酯的浓度为0.3mol/L。
实施例5
本发明实施例提供了一种神曲中氨基酸成分的含量测定方法，步骤和参数同实施例1，不同之处在于异硫氰酸苯酯乙腈溶液中异硫氰酸苯酯的浓度为0.5mol/L。
检验例2
本发明检验例提供了实施例1～5中不同条件下得到的神曲供试品中氨基酸的测定结果。各实施例所用的神曲为同一批次。
各实施例中测定的各氨基酸的相对峰面积见表7。
表7实施例1～5中各氨基酸的相对峰面积(n＝2)
由表7可见，异硫氰酸苯酯乙腈溶液的浓度为0.1～0.5mol/L时，各氨基酸的相对峰面积值均较高，当异硫氰酸苯酯乙腈溶液的浓度为0.4mol/L时，神曲中大多数氨基酸的测定值更高；当衍生化试剂浓度继续增加时，天冬氨酸、丝氨酸等氨基酸的测定值开始减少，推测原因是衍生化试剂浓度过高时会导致副产物的产生。
实施例6
本发明实施例提供了一种神曲中氨基酸成分的含量测定方法，步骤和参数同实施例1，不同之处在于衍生化时间为20min。
实施例7
本发明实施例提供了一种神曲中氨基酸成分的含量测定方法，步骤和参数同实施例1，不同之处在于衍生化时间为40min。
实施例8
本发明实施例提供了一种神曲中氨基酸成分的含量测定方法，步骤和参数同实施例1，不同之处在于衍生化时间为60min。
实施例9
本发明实施例提供了一种神曲中氨基酸成分的含量测定方法，步骤和参数同实施例1，不同之处在于衍生化时间为100min。
检验例3
本发明检验例提供了实施例1、6～9中不同衍生化条件下得到的神曲供试品中氨基酸的测定结果。各实施例所用的神曲为同一批次。
各实施例中测定的各氨基酸的相对峰面积见表8。
表8实施例1、6～9中氨基酸的相对峰面积(n＝2)
由表8可见，衍生化时间为20～100min时，各氨基酸的相对峰面积均较高，当衍生化时间为80min时，神曲中大多数氨基酸的测定值更高；当衍生化试剂浓度继续增加时，部分氨基酸的测定值开始减少，推测原因是衍生化时间过长时会导致副产物的产生。
实施例10
本发明实施例提供了一种神曲中氨基酸成分的含量测定方法，步骤和参数同实施例1，不同之处在于衍生化温度为20℃。
实施例11
本发明实施例提供了一种神曲中氨基酸成分的含量测定方法，步骤和参数同实施例1，不同之处在于衍生化温度为40℃。
实施例12
本发明实施例提供了一种神曲中氨基酸成分的含量测定方法，步骤和参数同实施例1，不同之处在于衍生化温度为50℃。
检验例4
本发明检验例提供了实施例1、10～12中不同衍生化条件下得到的神曲供试品中氨基酸的测定结果。各实施例所用的神曲为同一批次。
各实施例中氨基酸的相对峰面积见表9。
表9实施例1、10～12中氨基酸的相对峰面积(n＝2)
由表9可见，衍生化温度为20～50℃时，各氨基酸的相对峰面积均较高，当衍生化温度为30℃时，神曲中大多数氨基酸的测定值更高。
实施例13
本发明实施例提供了一种神曲中氨基酸成分的含量测定方法，步骤和参数同实施例1，不同之处在于以0.02mol/L盐酸溶液为提取溶剂对神曲粉末进行提取。
实施例14
本发明实施例提供了一种神曲中氨基酸成分的含量测定方法，步骤和参数同实施例1，不同之处在于以0.04mol/L盐酸溶液为提取溶剂对神曲粉末进行提取。
实施例15
本发明实施例提供了一种神曲中氨基酸成分的含量测定方法，步骤和参数同实施例1，不同之处在于以0.06mol/L盐酸溶液为提取溶剂对神曲粉末进行提取。
实施例16
本发明实施例提供了一种神曲中氨基酸成分的含量测定方法，步骤和参数同实施例1，不同之处在于以0.08mol/L盐酸溶液为提取溶剂对神曲粉末进行提取。
实施例17
本发明实施例提供了一种神曲中氨基酸成分的含量测定方法，步骤和参数同实施例1，不同之处在于以0.1mol/L盐酸溶液为提取溶剂对神曲粉末进行提取。
检验例5
本发明检验例提供了实施例1、13～17中不同提取条件下得到的神曲供试品中氨基酸的测定结果。各实施例所用的神曲为同一批次。
各实施例中氨基酸的相对峰面积见表10。
表10实施例1、13～17中氨基酸的相对峰面积(n＝2)
由表10可见，提取溶剂为水或0.02～0.1mol/L盐酸溶液时，各氨基酸的相对峰面积均有变化，且变化趋势与盐酸浓度无明显相关性。但综合不同提取溶剂得到的相对峰面积，当提取溶剂为水时神曲中半数以上氨基酸的测定值相对较高。
实施例18
本发明实施例提供了一种神曲中氨基酸成分的含量测定方法，步骤和参数同实施例1，不同之处在料液比为1:20。
实施例19
本发明实施例提供了一种神曲中氨基酸成分的含量测定方法，步骤和参数同实施例1，不同之处在料液比为1:100。
检验例6
本发明检验例提供了实施例1、18、19中不同提取条件下得到的神曲供试品中氨基酸的测定结果。各实施例所用的神曲为同一批次。
各实施例中氨基酸的相对峰面积见表11。
表11实施例1、18、19中氨基酸的相对峰面积(n＝2)
由表11可见，料液比为1:20～100时，各氨基酸的相对峰面积均较高，当料液比为1:50时，神曲中大多数氨基酸的测定值更高。
实施例20
本发明实施例提供了一种神曲中氨基酸成分的含量测定方法，步骤和参数同实施例1，不同之处在于超声处理的时间为20min。
实施例21
本发明实施例提供了一种神曲中氨基酸成分的含量测定方法，步骤和参数同实施例1，不同之处在于超声处理的时间为40min。
检验例7
本发明检验例提供了实施例1、20、21中不同提取条件下得到的神曲供试品中氨基酸的测定结果。各实施例所用的神曲为同一批次。
各实施例中氨基酸的相对峰面积见表12。
表12实施例1、20、21中氨基酸的相对峰面积(n＝2)
由表12可见，超声处理的时间为20～40min时，各氨基酸的相对峰面积均较高，当超声处理的时间为30min时，神曲中大多数氨基酸的测定值更高。
实施例22
本发明实施例提供了不同批次神曲中氨基酸成分含量测定结果。各批次神曲包括生神曲15批，炒神曲3批，焦神曲3批。15批生神曲均由河北春开制药股份有限公司提供，编号分别为HB-1(河北)、HB-2(河北)、HB-3(河北)、HB-4(河北)、HB-5(河北)、HB-6(河北)、SC-1(四川)、SC-2(四川)、SC-3(四川)、SC-4(四川)、AH(安徽)、JX(江西)、CQ-1(重庆)、CQ-2(重庆)、HU(湖北)。3批炒神曲购于河北安国药材市场，编号分别为JXC(江西)、AHC(安徽)、HBC(河北)。3批焦神曲均购于河北安国药材市场，编号分别为JXJ(江西)、HBJ-1(河北)、HBJ-2(河北)。
按照实施例1中步骤a的方法制备不同批次神曲的提取液，按照实施例1中步骤b的方法制备氨基酸混合对照品溶液，逐级稀释成系列不同浓度，再按照实施例1中步骤c的方法分别进行衍生化处理，制成供试品溶液和不同浓度的衍生化对照品溶液，采用超高效液相色谱法测定各氨基酸的相对峰面积，色谱条件同实施例1中的步骤d，采用标准曲线法计算样品中14个成分的含量，公式同实施例1。
不同批次神曲中氨基酸成分含量测定结果如表13～15所示。
表13不同批次神曲样品中14个氨基酸含量测定结果-1(n＝2，mg/g)
“–”，低于检测限
表14不同批次神曲样品中14个氨基酸含量测定结果-2(n＝2，mg/g)
“–”，低于检测限
表15不同批次神曲样品中14个氨基酸含量测定结果-3(n＝2，mg/g)
“–”，低于检测限
由表13～15可见，本发明提供的神曲氨基酸成分的含量测定方法可用于研究不同批次神曲样品中14个氨基酸的含量，其中15批次生神曲样品中，14个氨基酸含量差异大，其中，甘氨酸含量为0.05407～0.6877mg/g，组氨酸含量为0～0.3453mg/g，酪氨酸含量为0～0.2076mg/g，亮氨酸含量为0.04148～0.5141mg/g，苯丙氨酸含量为0.04253～0.6960mg/g，赖氨酸含量为0.04796～0.9725mg/g；3批次炒神曲中缬氨酸含量为0.1283～0.3692mg/g，异亮氨酸含量为0.1000～0.1881mg/g，亮氨酸含量为0.09132～0.3055mg/g，苯丙氨酸含量为0～0.2167mg/g，赖氨酸含量为0～0.2701mg/g，其余氨基酸未检测到；3批次焦神曲中缬氨酸含量为0～0.2428mg/g，异亮氨酸含量为0～0.1619mg/g，亮氨酸含量为0～0.1653mg/g，苯丙氨酸含量为0～0.2728mg/g，其余氨基酸未检测到。
实施例23
本发明实施例提供了不同发酵天数得到的神曲中氨基酸成分含量测定结果。所用的神曲由天津中医药大学实验室自制。
按照实施例1中步骤a的方法制备不同发酵天数得到的神曲样品的提取液，按照实施例1中步骤b的方法制备氨基酸混合对照品溶液，逐级稀释成系列不同浓度，再按照实施例1中步骤c的方法分别进行衍生化处理，制成供试品溶液和不同浓度的衍生化对照品溶液，采用超高效液相色谱法测定各氨基酸的峰面积，色谱条件同实施例1中的步骤d，采用标准曲线法计算样品中14个成分的含量，公式同实施例1。
不同发酵天数得到的神曲中氨基酸成分含量测定结果如表16和图3所示。
表16神曲发酵过程中14个氨基酸成分的测定结果(n＝2，mg/g)
“–”，低于检测限
由表16可知，在发酵过程中天冬氨酸的含量为0.1705～1.799mg/g，谷氨酸含量为0.3013～2.669mg/g，丝氨酸含量为0.2463～2.175mg/g，甘氨酸含量为0.07594～1.711mg/g，谷氨酰胺含量为0.06785～2.842mg/g，组氨酸含量为0.06245～1.298mg/g，丙氨酸含量为0.2279～3.531mg/g，脯氨酸含量为0.1731～15.03mg/g，酪氨酸含量为0～0.7291mg/g，缬氨酸含量为0.1496～2.578mg/g，异亮氨酸含量为0.1126～1.994mg/g，亮氨酸含量为0.06868～2.446mg/g，苯丙氨酸含量为0.07168～1.499mg/g，赖氨酸含量为0.1834～2.408mg/g。
对比例1
本对比例提供了用Waters ACQUITY UPLC H-Class PLUS超高效液相色谱仪对实施例1步骤c得到的供试品溶液进行测定的结果。色谱条件中柱温为45℃，本对比例的梯度洗脱程序为：
所得超高效液相色谱图如图4所示。由结果可见，此方法应用于神曲中氨基酸检测时，分离度较差，难以对14种氨基酸成分进行有效的分离。
对比例2
本对比例提供了用Waters ACQUITY UPLC H-Class PLUS超高效液相色谱仪对实施例1步骤c得到的供试品溶液进行测定的结果。色谱条件中除梯度洗脱条件外，其余均与对比例1相同，本对比例的梯度洗脱程序为：
所得超高效液相色谱图如图5所示。由结果可见，与图4相比，5～6min色谱峰的分离效果有所变化，但分离效果不及实施例1。该结果进一步表明，仅靠梯度的改变并不能达到分离上述14种氨基酸的效果。
对比例3
本对比例提供了用Waters ACQUITY UPLC H-Class PLUS超高效液相色谱仪对实施例1步骤c得到的供试品溶液进行测定的结果。色谱条件中除梯度洗脱条件外，其余均与实施例1相同，本对比例的梯度洗脱程序为：
所得超高效液相色谱图如图6所示。由结果可见，5～6min色谱峰的分离度达不到图1的分离效果。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换或改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (12)
1.一种神曲中氨基酸成分的含量测定方法，其特征在于：
对神曲粉末进行提取，得到神曲提取液；用三乙胺乙腈溶液和异硫氰酸苯酯乙腈溶液对所述神曲提取液进行衍生化，得到待测溶液；
用超高效液相色谱法对所述待测溶液中的氨基酸成分进行含量测定，所述氨基酸成分包括天冬氨酸、谷氨酸、丝氨酸、甘氨酸、谷氨酰胺、组氨酸、丙氨酸、脯氨酸、酪氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸和赖氨酸，所述超高效液相色谱法的色谱条件为：
色谱柱：C18键合硅胶色谱柱；
流动相：流动相A为0.1mol/L醋酸钠缓冲溶液，pH=6.5；流动相B为乙腈；进行梯度洗脱，所述梯度洗脱的程序如下：
流速：0.28~0.32mL/min；
柱温：38~42℃；
检测波长为252~256nm。
2.根据权利要求1所述的神曲中氨基酸成分的含量测定方法，其特征在于，所述色谱柱为ACQUITY UPLC®BEH C18柱，规格为2.1×100mm，1.7μm。
3.根据权利要求1所述的神曲中氨基酸成分的含量测定方法，其特征在于，所述流速为0.3mL/min；和/或
柱温为40℃；和/或
检测波长为254nm。
4.根据权利要求3所述的神曲中氨基酸成分的含量测定方法，其特征在于，所述异硫氰酸苯酯乙腈溶液中异硫氰酸苯酯的浓度为0.1mol/L～0.5mol/L。
5.根据权利要求4所述的神曲中氨基酸成分的含量测定方法，其特征在于，所述异硫氰酸苯酯乙腈溶液中异硫氰酸苯酯的浓度为0.4mol/L。
6.根据权利要求4或5所述的神曲中氨基酸成分的含量测定方法，其特征在于，所述衍生化的时间为20~100min，所述衍生化的温度为20℃～50℃。
7.根据权利要求6所述的神曲中氨基酸成分的含量测定方法，其特征在于，所述衍生化的时间为80min，所述衍生化的温度为30℃。
8.根据权利要求1所述的神曲中氨基酸成分的含量测定方法，其特征在于，用0~0.1mol/L盐酸溶液对神曲粉末进行超声提取。
9.根据权利要求8所述的神曲中氨基酸成分的含量测定方法，其特征在于，所述神曲粉末与所述盐酸溶液的质量体积比为1:20~100，g:mL。
10.根据权利要求9所述的神曲中氨基酸成分的含量测定方法，其特征在于，超声提取时间为20～40min。
11.根据权利要求1所述的神曲中氨基酸成分的含量测定方法，其特征在于，所述含量测定方法还包括向所述待测溶液中加入正亮氨酸内标溶液。
12.权利要求1~11任一项所述神曲的含量测定方法在神曲质量控制中的应用，其特征在于，所述质量控制包括用所述含量测定方法检测神曲中的天冬氨酸、谷氨酸、丝氨酸、甘氨酸、谷氨酰胺、组氨酸、丙氨酸、脯氨酸、酪氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸和赖氨酸。
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