CN114839283B - 一种降尿酸功能性食品中21种非法添加药物的检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种降尿酸功能性食品中21种非法添加药物的检测方法，本发明采用改进的QuEhERS法和固相萃取两种方法，建立了UPLC‑MS/MS对功能性食品中痛风类药物的检测方法。本方法简单方便、易于操作、灵敏度高、检出限低，能够满足功能性食品中痛风药物的快速检测和确证的要求。针对目前降尿酸功能性食品相关检测方法中，测定的药物品种单一，种类少，不能全部覆盖指南中的急慢性痛风药物。本发明以痛风指南中常用的痛风药物为研究对象，建立一种覆盖痛风指南中的急慢性痛风药物高通量检测技术，用于降尿酸功能性食品中化学药物的测定，该检测方法针对性强，灵敏度高，检测种类多，为降尿酸功能性食品的安全性保驾护航。

Description

一种降尿酸功能性食品中21种非法添加药物的检测方法

技术领域

本发明属于检测技术领域，具体为一种降尿酸功能性食品中21种非法添加药物的检测方法。

背景技术

高尿酸血症成为继糖尿病之后又一常见代谢性疾病。《中国高尿酸血症与痛风诊疗指南(2019)》提出，高尿酸血症急性发作期，推荐尽早使用小剂量秋水仙碱、非甾体类抗炎药，或者糖皮质激素药物抗炎镇痛。高尿酸血症慢性期，建议使用别嘌醇和非布司他药物来抑制尿酸生成来控制尿酸浓度，或者使用苯溴马隆和丙磺舒药物来促进尿酸排泄。但是这些化学药物副作用都比较大。秋水仙碱因其中毒量与治疗量相近，患者用药后极易引发恶心呕吐、腹泻、骨髓抑制、神经系统毒性等中毒性副反应；非甾体类抗炎药用药不当很容易导致患者出现肾脏系统和心血管系统损伤；糖皮质激素长时间给药常常会出现消化系统等不良反应。别嘌醇、丙磺舒、苯溴马隆和非布司他这4种化学药物均为处方药，长期服用，将对肝肾功能产生很大的毒副作用，并有加重心脑血管疾病等风险。

《中华人民共和国食品安全法》明确规定食品中严禁添加非食品成分的物质(包括化学药物)。目前，国内外研究者采用液相色谱法(HPLC)和液相色谱-串联质谱法(HPLC-MS/MS)来测定中成药和保健食品中的痛风类药物，但现有这些方法对痛风类化学药物的检测都不够全面，主要测定同一类型或者药物性质接近的品种，不能全部覆盖指南中的急慢性痛风药物，且未充分考虑不同药物性质差异以及降尿酸功能性食品基质类型差异等特点，存在前处理方法繁琐，检测时间长，成本高等问题。

发明内容

本发明针对目前相关检测方法存在的不足，以《中国高尿酸血症与痛风诊疗指南(2019)》中指定的所有一线用药为研究对象，建立一种全部覆盖痛风指南中急慢性痛风药物的高通量检测技术，可以用一种检测方法筛查降尿酸功能性食品中非法添加的所有痛风类药物。

为了解决上述问题，实现本发明的发明目的，本发明提供以下技术方案：

一种降尿酸功能性食品中21种非法添加药物的检测方法，其特征在于，包括如下步骤：

S1、样品处理：所有固体样品使用粉碎机粉碎后使用，胶囊样品取出内容物进行使用；

S2、样品的前处理：采用QuEhERS法或固相萃取法对样品进行处理；

S3、LC-MS/MS检测：液相条件，色谱柱：ACQUITY

BEH C₁₈；柱温：40℃；进样量：2μL，质谱条件采用正负离子同时检测模式，毛细管电压：5.5kV；离子源温度：150℃；脱溶剂气温度：500℃；脱溶剂气流量：800L/hr；MRM模式；碰撞气体：氦气。

进一步地，所述QuEhERS法为：称取1g粉碎试样于50mL塑料离心管中，加入5mL水，准确加入乙腈10.0mL，盖上盖子，摇匀后超声提取30分钟，加入QuEChERS分散SPE试剂盒，涡旋提取2min，5000转/分钟离心3分钟，吸取2mL上层清液乙腈层置于QuEChERS净化试剂管中，涡旋30s，3000转/分钟离心3分钟，取1.0mL于氮吹管中，45℃氮气吹干，准确加入1.0mL甲醇溶液溶解，过0.22μm有机相滤膜，待测。

进一步地，所述QuEhERS法为称取1g粉碎试样于50mL塑料离心管中，加入含0.1％氨水的甲醇10mL，盖上盖子，摇匀后超声提取30分钟，5000转/分钟离心3分钟，取1.0mL清液于离心管中，加入1mL水稀释后用Oasis MCX固相萃取柱净化，过柱速度控制在1滴/秒，待样液全部过柱后，用3mL水和3mL甲醇洗涤萃取柱，真空抽干，用10mL5％氨水-甲醇溶液洗脱，收集洗脱液，45℃氮气吹干，准确加入1.0mL甲醇溶解，过0.22μm有机相滤膜，待测。进一步地所述梯度洗脱条件为：

进一步地，其中质谱检测时21种非法添加药物监测离子对及相关参数设定如下：

*为推荐的定量离子。

进一步地，21种非法添加药物的校准曲线、线性范围、相关系数、检出限及定量限

与现有技术相比，本发明的有益效果为：采用改进的QuEhERS法和固相萃取两种方法，建立了UPLC-MS/MS对降尿酸功能性食品中21种非法添加药物的检测方法。本发明的检测方法简单方便、易于操作、灵敏度高、检出限低，能够满足降尿酸功能性食品中21种痛风类药物的快速检测和确证的要求。

附图说明：

图1 21种药物优化后总离子流色谱图

图2对乙酰氨基酚离子图

图3酮咯酸离子图

图4美洛昔康离子图

图5可的松离子图

图6氢化可的松离子图

图7泼尼松离子图

图8泼尼松龙离子图

图9甲基泼尼松龙离子图

图10曲安西龙离子图

图11地塞米松离子图

图12丙酸倍氯米松离子图

图13倍他米松离子图

图14秋水仙碱离子图

图15非布司他离子图

图16别嘌醇离子图

图17布洛芬离子图

图18吲哚美辛离子图

图19苯溴马隆离子图

图20丙磺舒离子图

图21双氯芬酸钠离子图

图22萘普生离子图

具体实施方式

结合实施例和附图对本发明作进一步说明，不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

材料与方法

仪器与试剂

AB Triple Quad 4500超高效液相色谱-串联质谱仪(美国Waters公司)；JP-C300超声波清洗机(广州吉普超声波电子设备有限公司)；3-3KS高速冷冻离心机(美国SCIEX公司)；DT-502A电子天平(常熟市金羊砝码仪器有限公司)；EYELA SB-1100旋转蒸发仪(日本东京理化公司)；IKA MS3漩涡混合器(德国IKA公司)；Milli-Q去离子水发生器(美国Millipore公司)。QuEChERS分散试剂盒(安捷伦)。

乙腈、甲醇(色谱纯，美国Fisher公司)；甲酸(优级纯，德国CNW公司)；乙腈、甲醇(分析纯，天津市永大化学试剂有限公司)；实验用水为二级超纯水(美国Millipore公司)；氮气(纯度大于99.99％，佛山顺德区东顺气体有限公司)。乙酸铵(色谱纯，德国TEDIA公司)。对乙酰氨基酚、酮咯酸、美洛昔康、可的松、氢化可的松、泼尼松、泼尼松龙、甲基泼尼松龙、曲安西龙、地塞米松、倍他米松、丙酸倍氯米松、秋水仙碱、非布司他、别嘌醇、布洛芬、双氯芬酸钠、吲哚美辛、萘普生、苯溴马隆、丙磺舒标准品(德国Dr.Ehrenstorfer公司，纯度不少于98％)

样品前处理

样品制备：所有固体样品使用粉碎机粉碎后使用，胶囊样品取出内容物进行使用。

前处理方法一(QuEhERS法)

称取1g粉碎试样(精确至0.01g)于50mL塑料离心管中，加入5mL水，准确加入乙腈10.0mL，盖上盖子，摇匀后超声提取30分钟，加入QuEhERS分散SPE试剂盒(Part No：5982-4950)，涡旋提取2min，5000转/分钟离心3分钟，吸取2mL上层清液(乙腈层)置于QuEhERS净化试剂管(Part No：5982-4956CH)中，涡旋30s，3000转/分钟离心3分钟，取1.0mL于氮吹管中，45℃氮气吹干，准确加入1.0mL甲醇溶液溶解，过0.22μm有机相滤膜，待测。

前处理方法二(固相萃取法)

称取1g粉碎试样(精确至0.01g)于50mL塑料离心管中，加入含0.1％氨水的甲醇10mL，盖上盖子，摇匀后超声提取30分钟，5000转/分钟离心3分钟，取1.0mL清液于离心管中，加入1mL水稀释后用Oasis MCX固相萃取柱净化，过柱速度控制在1滴/秒，待样液全部过柱后，用3mL水和3mL甲醇洗涤萃取柱，真空抽干，用10mL5％氨水-甲醇溶液洗脱，收集洗脱液，45℃氮气吹干，准确加入1.0mL甲醇溶解，过0.22μm有机相滤膜，待测。

仪器条件

(1)LC-MS/MS液相条件

色谱柱：ACQUITY

BEH C₁₈；柱温：40℃；进样量：2μL；流动相与梯度洗脱条件见表1

表1流动相与梯度洗脱条件

(2)LC-MS/MS质谱条件

采用正负离子同时检测模式，毛细管电压：5.5kV；离子源温度：150℃；脱溶剂气温度：500℃；脱溶剂气流量：800L/hr；MRM模式；碰撞气体：氦气。质谱参考条件见表2。

表2质谱参考条件

注：*为定量离子

结果与讨论

仪器条件的优化

质谱的电压、碰撞能对待测物的裂解有重要的影响，在ESI⁺和ESI^-模式下分别对21种药物的标准溶液进行全扫描，优化质谱参数，确定21种非法添加药物一级离子峰，改变碰撞能量，对分子离子进行二级质谱扫描，选择信号强度较大信号稳定的两个特征碎片离子，选择相对丰度最强的为定量离子，较弱的为定性离子，并优化得到每种非法添加物质的母离子和子离子所需的最佳去簇电压和碰撞能量，最后以多反应监测模式进行扫描，21种药物优化后总离子流色谱图见说明书附图图1。

色谱条件的选择

为确定最佳分离条件，本发明考察了Shim-pack ODS-Ⅱ(2.0mmi.d×75mm，1.6μm)、Agilent SB-C18(2.1mmi.d×100mm，1.8μm)以及ACQUITY

BEH C₁₈(2.1mmi.d×100mm，1.7μmm)3种型号的色谱柱对21种痛风类药物的分离效果，结果发现ODS-Ⅱ柱地塞米松与倍他米松不能实现完全分离，改变流动相及流动相比例均未实现分离；Agilent SB-C₁₈存在可的松色谱峰钝化的情况且地塞米松与倍他米松未实现完全分离；在相同色谱条件下ACQUITY/>

BEH C₁₈色谱柱分离得到的色谱峰峰型较好，且21种痛风类药物分离度良好。故本发明选择ACQUITY/>

BEH C₁₈柱进行分离。

据文献报道在甲醇和0.1％甲酸作流动相条件下能使痛风类药物在质谱中有很好的响应值。但在实验过程中发现此实验条件下需要负离子监测的物质普遍响应性不好，故考察了0.1％甲酸水-乙腈、0.1％甲酸水-甲醇、5mmol/L乙酸铵溶液-甲醇、5mmol/L乙酸铵溶液-乙腈分别作为流动相体系对色谱峰形、分离度以及信号强度的影响。

样品前处理条件的确定

21种痛风类药物涉及种类较多，结构不同、极性不同。为了能实现快速、准确、高效的筛查目的，试验考察了乙腈、乙醇、乙酸乙酯、甲醇等溶液对菊苣栀子茶及芹菜籽亚麻籽油的提取效率。采用以上溶剂提取21种痛风类药物时，甲醇和乙腈在菊苣栀子茶及芹菜籽亚麻籽油中提取效率均大于72.0％，乙醇、乙酸乙酯在菊苣栀子茶及芹菜籽亚麻籽油中提取效率较低，可能由于降尿酸类膳食补充剂中基质复杂干扰物较多，含有大量维生素、天然产物、蛋白质等；故初步选择甲醇与乙腈作为主要提取试剂。在进行样品提取时发现单纯甲醇或乙腈提取后样品经过QuEhERS净化后还较浑浊，故在样品提取时加入水来溶解部分杂质，效果较好。

市场上降尿酸功能性食品主要以菊苣栀子茶及芹菜籽亚麻籽油为主，此类制品成分多样，基体复杂，含有大量维生素、黄酮、有机酸、色素等化合物，基质干扰严重。QuEhERS方法简便且快速，固相萃取技术有机溶剂消耗小，富集倍数高，本发明选取别嘌醇、双氯芬酸钠、倍他米松、地塞米松采用了固相萃取技术和QuEhERS两种方法对竹木制品食品相关产品进行处理时提取，并在选择性、干扰性以及回收率三个方面进行比较。在选择性方面两种提取方法均能提取目标产物，在干扰性方面固相萃取技术略优于QuEhERS技术，全扫描杂峰相对较少，质谱目标明确专一性强，但固相萃取在样品过固相萃取柱时耗费时间较长，甚至存在个别样品过固相色谱柱时存在堵塞现象，QuEhERS技术单一型号分散剂时样品存在全扫描时杂峰较多现象，在经过两次净化后，QuEhERS技术处理的样品实现净化，在回收率方面QuEhERS技术高于固相萃取，具体数据见表3

表3两种提取方法平均回收率及相对标准偏差(n＝6)

基质效应

采用菊苣栀子茶、芹菜籽亚麻籽油及片剂3种不同基质来考察21种非法添加药物的基质效应,考察了3个不同浓度的21种药物在纯溶剂中分析物的响应值和样品基质中添加相同含量分析物的响应值。实验表明3种基质3个低、中、高浓度下21种非法添加药物在样品基质中的实测值介于在纯溶剂中真实值的85％～105％内,基质效应不明显,但均存在明显基质效应。因此,本发明采用溶剂配制标准曲线进行定量测定

线性方程

配置标准工作溶液，21种非法添加药物色谱峰面积为纵坐标Y,21种非法添加药物浓度为横坐标X,得到各化合物的线性方程、线性相关系数和线性范围。21种非法添加药物在10～500μg/L浓度范围内具有良好的线性(r²均大于0.995)。在空白样品中添加低浓度21种非法添加药物标准溶液,进行样品前处理,上机检测,根据3倍信噪比(S/N＝3)和10倍信噪比(S/N＝10)分别计算检出限和定量限。在最优条件下得到21种非法添加药物的线性方程及检出限。

表4 21种非法添加药物的校准曲线、线性范围、相关系数、检出限及定量限

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加标回收率及精密度

选择不含痛风类药物的功能性食品添加标准物质，见图4，添加水平为150、250、500μg/kg时，QuEhERS法的回收率为74.2％～89.1％，相对标准偏差(RSD)均小于12％(n＝6)。固相萃取法的回收率为72.8％～90.0％，相对标准偏差(RSD)均小于12％(n＝6)。

以上所述，仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，本发明的专利保护范围以权利要求书为准，凡是运用本发明的说明书内容所作的等同结构变化，同理均应包含在本发明的保护范围内。

Claims (3)

1.一种降尿酸功能性食品中21种非法添加药物的检测方法，其特征在于，包括如下步骤：

S1、样品处理：所有固体样品使用粉碎机粉碎后使用，胶囊样品取出内容物进行使用；

S2、样品的前处理：采用QuEhERS法或固相萃取法对样品进行处理；

S3、LC-MS/MS检测：液相条件，色谱柱：ACQUITY UPLC® BEH C₁₈； 柱温：40℃；进样量：2μL，质谱条件采用正负离子同时检测模式，毛细管电压：5.5kV；离子源温度：150 ℃；脱溶剂气温度：500 ℃；脱溶剂气流量：800 L/hr; MRM 模式；碰撞气体：氦气；

其中，所述QuEhERS法为：称取1 g粉碎试样于50 mL塑料离心管中，加入5 mL水，准确加入乙腈10.0 mL，盖上盖子，摇匀后超声提取30分钟，加入QuEChERS分散SPE 试剂盒，所述QuEChERS分散SPE试剂盒Part No为5982-4950，涡旋提取2 min，5000转/分钟离心3分钟，吸取2 mL上层清液乙腈层置于QuEChERS净化试剂管中，所述QuEChERS净化试剂管Part No为5982-4956CH，涡旋30s，3000转/分钟离心3分钟，取1.0 mL于氮吹管中，45 ℃氮气吹干，准确加入1.0 mL甲醇溶液溶解，过0.22 μm有机相滤膜，待测；

所述固相萃取法为：称取1 g粉碎试样于50 mL塑料离心管中，加入含0.1 %氨水的甲醇10 mL，盖上盖子，摇匀后超声提取30分钟，5000转/分钟离心3分钟，取1.0 mL清液于离心管中，加入1 mL水稀释后用Oasis MCX固相萃取柱净化，过柱速度控制在1滴/秒，待样液全部过柱后，用3 mL水和3 mL甲醇洗涤萃取柱，真空抽干，用10 mL5 %氨水-甲醇溶液洗脱，收集洗脱液，45 ℃氮气吹干，准确加入1.0 mL甲醇溶解，过0.22 μm有机相滤膜，待测；

梯度洗脱条件为：

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所述21种非法添加药物为对乙酰氨基酚、酮咯酸、美洛昔康、可的松、氢化可的松、泼尼松、泼尼松龙、甲基泼尼松龙、曲安西龙、地塞米松、倍他米松、丙酸倍氯米松、秋水仙碱、非布司他、别嘌醇、布洛芬、双氯芬酸钠、吲哚美辛、萘普生、苯溴马隆、丙磺舒。

2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，其中质谱检测时21种非法添加药物监测离子对及相关参数设定如下：

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3.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，21种非法添加药物的校准曲线、线性范围、相关系数、检出限及定量限

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