CN114858934B - 一种黄精不同炮制工艺中5-羟甲基糠醛和丙烯酰胺的测定方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种黄精不同炮制工艺中5‑羟甲基糠醛和丙烯酰胺的测定方法，属于中药检测技术领域。通过对黄精酒制、清蒸制、黑豆汁制3种不同炮制工艺，研究不同炮制工艺对产生5‑羟甲基糠醛和丙烯酰胺的影响，并采用高效液相色谱法进行测定，以5‑羟甲基糠醛和丙烯酰胺为指标评判3种炮制方法的安全性，为黄精炮制工艺规范化奠定基础。本发明工艺简单，准确度、精密度较高，且降低了检测时间和节约了成本。

Description

一种黄精不同炮制工艺中5-羟甲基糠醛和丙烯酰胺的测定 方法

技术领域

本发明属于中药检测技术领域，具体涉及一种黄精不同炮制工艺中5-羟甲基糠醛和丙烯酰胺的测定。

背景技术

黄精为百合科黄精属植物滇黄精Polygonatum kingianum Coll.et Hemsl.、黄精Polygonatum sibiricum Red.或多花黄精Polygonatum cyrtonema Hua.民间根据其形状，分别习称“大黄精”、“鸡头黄精”、“姜形黄精”。始载于《名医别录》，并列为上品，为我国传统名贵滋补中药。黄精为临床常用滋阴补益药，其味甘、性平，具有补气养阴、健脾润肺及益肾的功效，其所含化学成分丰富，有多糖、皂苷、蒽醌类化合物、生物碱、强心苷、木脂素等。其中，多糖是黄精的主要功能性成分，具有抗肿瘤、降血糖、免疫调节、抑菌消炎等活性。历代以来黄精炮制方法有：九蒸九曝法、蔓荆子水蒸法、酒熬法、黑豆煮法、酒蒸法、乳浸晒法等。

目前黄精炮制以酒蒸、清蒸和加入辅料为主，炮制前后颜色差异较大，炮制后药物表面呈棕褐色至黑色，有光泽，中心棕色至浅褐色，可见筋脉小点，质地柔软，味甜，黄精炮制经长时间高温加热后可能产生5-羟甲基糠醛和丙烯酰胺。

5-羟甲基糖醛(5-HMF)为淡黄色针状或块状晶体，易溶于水、甲醇、乙醇等，5-羟甲基糠醛的产生的途径主要为美拉德反应和焦糖化反应产生。黄精中的糖类成分和氨基酸、多肽蛋白类成分在高温下发生了美拉德反应，导致糖苷键的水解和糖的脱水反应而产生5-羟甲基糠醛(5-HMF)。美拉德反应在温度高于50℃时最易发生反应，广泛存在于油炸、烘焙、烧烤食品中。根据张璐佳等（张璐佳,杨柳青,王鹏璞,董丽,胡小松,陈芳.丙烯酰胺毒性研究进展[J].中国食品学报,2018,

18(08):274-283.）研究表明，5-HMF被人体摄入后不仅具有直接的致炎效应，而且能在体内被快速代谢，所生成的代谢物具有很强的致癌、诱导突变等效应，有引发肝癌、结肠癌等潜在风险。European Food Safety Authority. （Opinion of the scientificpanel on food additives, flavourings, processing aids and materialsin contactwith food (AFC) on a request from the commission related to flavouring groupevaluation 13: furfuryl and furan derivatives with and without additionalside-chain substituents and heteroatoms from chemical group 14[J]. EFSAJournal, 2005, 215: 1-73.）中提及欧盟食品安全委员会食品添加剂、香料、加工助剂及食品接触材料科学小组以修正理论加权最大日摄入量法为基础进行研究每人5-羟甲基糠醛食品摄入量上限为1.6mg。

丙烯酰胺为白色结晶固体，易溶于水、甲醇、乙醇、丙醇，稍溶于乙酸乙酯、氯仿等。在特定条件下，羰基化合物（还原糖）和氨基化合物（蛋白质、氨基酸）发生非褐变的美拉德反应，使得反应后的食物色、香、味儿俱全，容易产生有害物质丙烯酰胺。目前确认的丙烯酰胺形成机理是由天门冬酰胺和还原性糖在高温加热过程中产生。2011年FAO/WHO食品添加剂联合专家委员会对世界范围内的八个代表国家人群中丙烯酰胺膳食摄入量进行评估，普通人群的日摄入量平均约为1㎍/(Kg bw•d)，最高摄入量约为4㎍/(Kg bw•d)。通过RobertG. Tardiff等（Robert G. Tardiff，Michael L. Gargas,Christopher R. Kirman，et al.Estimation of safe dietary intake levels of acrylamide for humans[J]. Foodand Chemical Toxicology,2010,48(2):658-667.）基于生理学的毒素代谢动力学模式和非线性剂量反应法确定了丙烯酰胺的神经毒性日摄入边际剂量为40㎍/ (Kg bw•d)，致癌边际剂量为2.6㎍/ (Kg bw•d)。

5-羟甲基糠醛的检测方法主要有紫外分光光度法、衍生化分光光度法、液相

色谱法、气相色谱质谱法、薄层扫描法等。钱文等（钱文,黄朝瑜,张伟娜.GC法对含葡萄糖注射液中5-羟甲基糠醛的测定[J].药物分析志,2007(10):1601-1603.）方法如下：气相色谱HP-5弹性石英毛细血管柱，FID检测器，柱温从100℃升到250℃，以10℃每分钟递增，保留三分钟，进样口温度180℃，检测器温度260℃，分流进样分流比为1 : 20。金山等（金山,孙小凡.食品中丙烯酰胺的形成、检测及其抑制和管理研究进展[J].食品安全质量检测学报，2021，12(15):5915-5922.）发现有多种方法可量化丙烯酰胺及衍生的代谢物，例如气相色谱、高效液相色谱、毛细管电泳和酶联免疫吸附法等。陆文蔚等（陆文蔚,黄玥,艾清,白晨.高效液相色谱法检测月饼中丙烯酰胺的含量[J].食品研究与开发,2013,34(13):92-95.）提及到高效液相色谱法通过相同色谱条件下不同波长的检测方法来克服了5-羟甲基糠醛和其他成分在同一波长处吸收峰的问题，从而能更准确地测定其含量，高效液相色谱法选择性高、检测灵敏度好、分析速度快等优点。因此，采用高效液相色谱法来检测食品中5-羟甲基糠醛和丙烯酰胺的含量，此法适用于日常食品检测。

根据以上文献报道5-羟甲基糠醛的日摄入上限为1.6mg。丙烯酰胺的日摄入边际量每千克体重为2.6㎍，按照70kg计算，日摄入量为182㎍，根据两者日摄入量5-羟甲基糠醛1.6mg、丙烯酰胺182㎍，可初步判断丙烯酰胺的毒副作用比5-羟甲基糠醛大一些。《中国药典》2020版规定黄精的日服用量为9-15g，炮制工艺过程中可能产生的5-羟甲基糠醛和丙烯酰胺不容忽视，所以探索炮制工艺中2种成分的测定方法和限量是十分迫切的。对于目前的检测分析方法可言，存在一定得缺陷与不足，比如检测时间长、杂质峰较多、分别进行两次测定等。本发明对黄精不同炮制工艺所产生的5-羟甲基糠醛和丙烯酰胺进行高效液相色谱法检测，采用相同的流动相不同的波长同时进行检测，方法更方便、快速、准确、稳定、低成本。

发明内容

针对目前技术现状不能够在相同条件下同时测定样品中含有的两种有害物质，需分别进样测定，本发明能在相同的流动相条件下同时检测5-羟甲基糠醛和丙烯酰胺，本专利不仅可以同时检测两种物质，还可以对比出三种炮制工艺中的5-羟甲基糠醛和丙烯酰胺的含量，为黄精炮制质量的研究提供新的评价指标及检测方法。本发明的技术方案如下：

一种黄精不同炮制工艺中5-羟甲基糠醛和丙烯酰胺的测定方法，包括如下步骤：

1.取黄精鲜药材，除去杂质、根须、洗净；武火蒸制40min、切0.4-0.6cm厚片、60℃干燥12h得到黄精饮片。

2.取步骤1中黄精饮片，每100kg分别加20kg黄酒、20kg超纯水、20kg黑豆汁，酒蒸样品按酒水比为1：1.875加入适量水使黄精搅拌均匀，分次加入，使其闷润80min。

3.取步骤2中闷润好的饮片，隔水蒸制6 h, 蒸制好的饮片在60 ℃的烘箱内干燥12-13 h，酒蒸、清蒸、加入辅料黑豆汁蒸制1次，得到酒蒸样品、清蒸样品、黑豆汁样品。

4.蒸制得到的样品进行样品前处理，黄精炮制样品用万能粉碎机粉碎，过160目筛，精密称取0.100g，置于100ml圆底烧瓶中，加入99.9%的甲醇（色谱纯）25ml，超声波提取30min，置于10-15℃静止30-60s，抽滤，5000r/min离心10min，用甲醇定容至25ml容量瓶中，混匀；精密吸取1ml加入4ml甲醇定容至5ml容量瓶；稀释后样品溶液用0.45 μm的微孔滤膜过滤，得到供试品溶液，用于液相色谱仪测定。

5.对不同炮制工艺的黄精样品，采用高效液相法测定其5-羟甲基糠醛和丙烯酰胺，检测步骤如下：

（1）开机：进入HPLC软件系统主界面，设置流动相为A:0.1%甲酸水-B:甲醇(75-80：20-25)，流速为0.9-1.1 ml/min，柱温为29-31 ℃；进入紫外检测器的面板，UV1波长设置为283-285 nm，UV2波长设置为209-211 nm；

（2）基线的采集：开灯3分钟后，采集基线，基线平稳后进样分析；

（3）5-羟甲基糠醛的检测：在工具栏“选择监视通道”设置283-285 nm，选择紫外UV1，大约在6-9分钟出峰，出峰结束，点击停止；

（4）基线的采集：用高浓度流动相10 % A（0.1%甲酸水）和90%B（甲醇）跑平基线，用步骤（1）中流动相冲洗跑平基线；

（5）丙烯酰胺的检测：工具栏的“选择监视通道”设置209-211 nm，选择紫外UV2通道，大约在4-7分钟出峰，出峰结束，点击停止；

利用相同的的流动相和色谱条件同时炮制所产生的5-羟甲基糠醛和丙烯酰酰胺，在该色谱条件下, 5-羟甲基糠醛在0.625~10 ug/mL 内具有良好的线性关系；丙烯酰胺在0.1~1.0 ug/mL 内具有良好的线性关系。该检测方法操作简便、稳定、可靠, 有助于高温加工产生的的5-羟甲基糠醛和丙烯酰胺的检测和监控。

本发明具有如下有益效果：

1. 通过相同的液相色谱条件同时检测5-羟甲基糠醛和丙烯酰胺两种有毒物质，可以有效减少实验中的干扰因素，方便在同一批样品中对其有害物质进行分析，该检测方法操作简便、稳定、可靠。

2. 通过三种不同炮制工艺的检测结果来比较每一种炮制工艺所产生的有害物质5-羟甲基糠醛和丙烯酰胺的量，验证3种黄精炮制方法所产生的5-羟甲基糠醛的含量均高于丙烯酰胺的含量，加入辅料黑豆汁所产生的5-羟甲基糠醛和丙烯酰胺的含量最多，酒蒸时所产生的含量居中，清蒸时所产生的含量最少。

3. 通过实验测得以清蒸一蒸为例，测得其5-羟甲基糠醛含量为211.7 mg/kg，丙烯酰胺的含量为0.462 mg/kg，欧盟食品安全委员会认为每人每天摄入的5-HMF的上限为1.6mg，丙烯酰胺的日摄入量为182㎍，《中国药典》2020版规定黄精的日服用量为9-15 g，本专利炮制后黄精中所含5-羟甲基糠醛和丙烯酰胺的日用量为1.91-3.18 mg和4.16-6.93㎍，5-羟甲基糠醛超出安全限定范围，丙烯酰胺虽然在安全范围内，但也是有害物质的存在，同样应注意炮制工艺的限量检测。因不同产地不同采收期的黄精多糖含量不一致，相同炮制工艺仍然会有差别，所以本专利具有一定的实用性和紧迫性。

具体实施方式

实施例1

本实施例提供三种黄精炮制方法

取鲜黄精，洗净、去根须，武火蒸制40 min、切0.4-0.6 cm厚片、60 ℃干燥12 h，制得黄精饮片；取黄精饮片，分别加黄酒制、清蒸、黑豆汁搅拌均匀、闷润，得到样品，酒蒸炮制方法为：每100 kg黄精加20 kg黄酒，在黄酒中加入适量水使黄精能完全搅拌均匀，酒水比1：1.875（分批次拌入），闷润80 min。清蒸炮制方法为：每100 kg黄精加20 kg超纯水，适量水使黄精能完全搅拌均匀，闷润80 min。加入辅料黑豆汁的炮制方法为：每100 kg黄精加20kg辅料熬好得黑豆汁，使黄精能完全搅拌均匀，闷润80 min。闷润好的样品采用常压隔水蒸制,蒸6 h,蒸制好的样品放入温度为60 ℃烘箱12-13 h。

实施例2

本实施例提供一种炮制后样品前处理的方法

精密称取实施例1所得炮制品0.100g，用万能粉碎机粉碎，过160目筛，置100ml圆底烧瓶中，加入99.9%的甲醇（色谱纯）25ml，超声波提取30min，置于10-15℃静止30-60s，抽滤，5000r/min离心10min，用甲醇定容至25ml容量瓶中，混匀；精密吸取1ml加入4ml甲醇定容至5ml容量瓶；稀释后样品溶液用0.45 μm的微孔滤膜过滤，得到液相色谱供试品溶液。

实施例3

本实施例提供一种5-羟甲基糠醛和丙烯酰胺HPLC法测定含量的方法。

检测步骤如下：

（1）打开电源、仪器接线板电源开关、电脑显示器电源和主机电源，启动电脑；依次打开泵、自动进样器、柱温箱、检测器的电源。

（2）双击桌面上的Chromeleon图标打开 HPLC软件系统主界面，进入系统设置，进入泵的面板、温箱控制点击“连接”设置实际所需要的稳定值，流动相为A：0.1%甲酸水-B:甲醇(75-80：20-25)，流速为0.9-1.1ml/min，柱温为29-31℃，进入紫外检测器的面板，UV（DAD-3000 RS）紫外二极管阵列检测器通道设定：二极管阵列检测器可以同时选择4个紫外通道采集数据，可以分别设定需要的检测波长，点击“连接”，点击“紫外灯”将氘灯打开(若需要可见光，请点“可见灯”) 在“波长”栏设置实际所需要的波长，UV1波长设置为283-285nm，UV2 波长设置为209-211nm。

（3）在灯打开3分钟后，点击快捷方式键蓝色的圆点，在弹出的窗口选择紫外“UV”，点击确定，即开始采集基线。当基线走平稳后就可以进行进样分析。

（4）基线的采集和停止：测试样品前必须先平衡仪器，走稳仪器。点击ChromeleonConsole 工具栏的“监视基线”，在弹出的“选择监视通道”窗口勾选所需的监视波长和通道，检测5-羟甲基糠醛选择紫外UV1通道为283-285nm，观察出峰情况，大约在6-9分钟左右出峰，出峰结束，点击停止。

（5）检测结束后用高浓度流动相10% A（0.1%甲酸水）和90%B（甲醇）进行冲洗跑平基线，再用步骤（2)中流动相再次冲洗跑平基线。步骤（2）流动相最佳条件为：80% A（0.1%甲酸水）和20% B（甲醇）。

（6）基线跑平后再次点击Chromeleon Console工具栏的“监视基线”，在弹出的“选择监视通道”窗口勾选所需的监视波长和通道，检测丙烯酰胺选择紫外UV2通道为209-211nm，观察出峰情况，大约在4-7分钟左右出峰，出峰结束，点击停止，即完成样品中丙烯酰胺的检测。

实施例4

本实施例提供一种5-羟甲基糠醛标准曲线的绘制方法

精密称取0.500 mg 5-羟甲基糠醛对照品，用色谱纯甲醇配制0.01 mg/ml的贮备液，之后用超纯水梯度稀释至5㎍/mL、2.5㎍/mL、1.25㎍/mL、0.625㎍/mL的标准液。按实例3中HPLC测定方法进行系统进样，进样量为20 ul。以5-羟甲基糠醛浓度为横坐标，色谱峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，得线性回归方程Y=8397.8X-1.3636（R2=0.9997），5-羟甲基糠醛进样量在0.625㎍/mL ~10㎍/mL范围内与峰面积线性关系良好。

实施例5

本实施例提供一种丙烯酰胺标准曲线的绘制方法

精密称取0.050 mg丙烯酰胺对照品，用色谱纯甲醇配制0.001 mg/ml的丙烯酰胺的贮备液，之后用超纯水梯度稀释至0.8㎍/mL、0.6㎍/mL、0.4㎍/mL、0.1㎍/mL的标准液，按实例3中HPLC测定方法进行系统进样，以丙烯酰胺浓度为横坐标，色谱峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，得线性回归方程Y=26194X-0.6424（R2=1），丙烯酰胺进样量在0.1㎍/mL-1㎍/mL范围内与峰面积线性关系良好。

实施例6

本实施例提供一种考察方法学验证试验

（1）精密度考察

吸取浓度为0.01mg/ml的贮备液1ml与2ml的超纯水混匀，配制0.0025 mg/ml 5-羟甲基糠醛对照品溶液，吸取浓度为0.001mg/ml的贮备液1ml与3ml的超纯水混匀，配制0.0006 mg/ml丙烯酰胺对照品溶液，按实例3中HPLC测定方法重复进样6次，测定峰面积，计算相对标准偏差（RSD），结果显示，5-羟甲基糠醛和丙烯酰胺的 RSD 值分别为0.25%和0.19%，表明仪器的精密度良好。

表1 精密度考察结果

结果表明：RSD值分别为0.25%和0.19%，仪器精密度良好。

（2）重复性考察

精密称定实施例1中同一批次黄精供试品6份，按实施例2中拟定的“样品前处理”方法制备供试品溶液，按实施例4和实施例5“标准曲线制备”项下的相同测试条件进行测定，实验结果见表2。

表2 重复性考察结果

结果表明：RSD值为0.58%和0.61%，此方法的重现性良好。

（3）稳定性考察

按实施例1得到的炮制品样品和实施例2对样品进行前处理，通过以上方法制备供试品溶液，按实施例4和实施例5的标准曲线的绘制方法，在“标准曲线制备”项下的相同测试条件进行测定，分别在0，2，4，8，16，24h测定，实验结果见表3。

表3 稳定性考察结果

结果表明：RSD值分别为0.58%和0.61%，样品在24h内的稳定性良好。

（4）加样回收率实验

精密称取实施例1中已知含量的炮制黄精供试品，精密加入对照品适量，按实施例2的制备方法制备供试溶液，按实施例3项下的相同测试条件进行测定，实施例4和实施例5计算加样回收率，实验结果见表4和表5。

表4 5-羟甲基糠醛加样回收率实验结果

表5 丙烯酰胺加样回收率实验结果

结果表明，回收率在 99.46%～100.02%和 99.02%～100.00%之间，RSD=0.84％，表明回收率良好

通过以上方法测定样品5-羟甲基糠醛和丙烯酰胺结果显示，黄精经酒蒸、清蒸、加黑豆汁炮制后1蒸 5-羟甲基糠醛的含量分别为212.3 mg/kg、211.7mg/kg、217.2mg/kg，丙烯酰胺的含量分别为0.562mg/kg、0.462mg/kg、0.661mg/kg。

检测结果：炮制后的黄精所产生的5-羟甲基糠醛的含量均高于丙烯酰胺的含量，加入辅料黑豆汁所产生的5-羟甲基糠醛和丙烯酰胺的含量最多，酒蒸时所产生的含量居中，清蒸时所产生的含量最少，实验结果已证明两种有害成分在炮制过程中均有产生。通过以上测定不同炮制工艺所产生的两种有害物质，丙烯酰胺的人体限量小于5-羟甲基糠醛的限量，但两种物质都是一种潜在的影响健康的化合物，所以考察它们的限量问题可以对黄精炮制工艺的优化和质量标准的建立提供有效的参考依据。

本专利对不同炮制工艺的黄精样品，采用高效液相法测定其5-羟甲基糠醛和丙烯酰胺，用相同的HPLC条件：色谱柱Phenomenex Luna C18，流动相为0. 1%甲酸水-甲醇(75-80：20-25)，流速为0.8-1.2 ml/min，在此条件下5-羟甲基糠醛波长为283-285nm,丙烯酰胺为209-211nm。通过此方法可以有效减少实验中的干扰因素，方便在同一批样品中对其有害物质进行分析，而且可以减少黄精实验品的用量，相比与其他分开检测的方法，更快速、准确、稳定、低成本。

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明的公开的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明的构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (4)

1.一种黄精不同炮制工艺中5-羟甲基糠醛和丙烯酰胺的测定方法，其特征在于：对不同炮制工艺的黄精饮品进行前处理，得到高效液相色谱法的供试品溶液，测定其5-羟甲基糠醛和丙烯酰胺，检测步骤如下：

(1)开机：进入HPLC软件系统主界面，设置流动相为A:0.1％甲酸水-B:甲醇体积比为75-80：20-25，流速为0.9-1.1ml/min，柱温为29-31℃；进入紫外检测器的面板，UV1波长设置为283-285nm，UV2波长设置为209-211nm；

(2)基线的采集：开灯3分钟后，采集基线，基线平稳后预备进样分析；

(3)5-羟甲基糠醛的检测：在工具栏“选择监视通道”设置283-285nm，选择紫外UV1，在6-9分钟出峰，出峰结束，点击停止；

(4)基线的采集：用高浓度流动相10％A和90％B跑平基线，用步骤(1)中流动相冲洗跑平基线；

(5)丙烯酰胺的检测：工具栏的“选择监视通道”设置209-211nm，选择紫外UV2通道，在4-7分钟出峰，出峰结束，点击停止；

(6)线性范围：在该色谱条件下,5-羟甲基糠醛在0.625～10ug/mL，丙烯酰胺在0.1～1.0ug/mL内具有良好的线性关系。

2.根据权利要求1所述的测定方法，其特征是：对炮制后供试样品的前处理，制黄精用万能粉碎机粉碎，过160目筛，精密称取0.100g，置100ml圆底烧瓶中，加入99.9％的色谱纯甲醇25ml，超声波提取30min，置于10-15℃静止30-60s，抽滤，5000r/min离心10min，用甲醇定容至25ml容量瓶中，混匀；精密吸取1ml加入4ml甲醇定容至5ml容量瓶；稀释后样品溶液用0.45μm的微孔滤膜过滤，得到液相色谱供试品溶液。

3.根据权利要求2所述的测定方法，其特征是：供试样品的制黄精饮片制备方法为，取鲜药材黄精，洗净、去根须，武火蒸制40min、切0.4-0.6cm厚片、60℃干燥12h，制得黄精饮片；取黄精饮片100kg，分别加20kg黄酒+37.5kg水为黄酒制、20kg水为清蒸制、20kg为黑豆汁制，分别搅拌均匀、闷润80min，隔水蒸制6h，之后在60℃的烘箱内干燥12-13个小时，得酒制、清蒸制和黑豆汁制样品。

4.根据权利要求1所述的测定方法，其特征是：3种黄精炮制方法所产生的5-羟甲基糠醛的含量均高于丙烯酰胺的含量，加入辅料黑豆汁所产生的5-羟甲基糠醛和丙烯酰胺的含量最多，酒蒸时所产生的含量居中，清蒸时所产生的含量最少。