CN112946111B - 骨碎补生品及其炮制品uplc指纹图谱构建及鉴别方法 - Google Patents

骨碎补生品及其炮制品uplc指纹图谱构建及鉴别方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种骨碎补生品及其炮制品UPLC指纹图谱构建及鉴别方法。构建的步骤包括：分别制备对照品溶液及供试品溶液，采用高效液相色谱法对所述对照品溶液和供试品溶液进行检测；其中，制备对照品溶液的步骤包括：取对照品，加溶剂，溶解，所述对照品包括5‑羟甲基糠醛、原儿茶酸、新北美圣草苷以及柚皮苷；制备供试品溶液的步骤包括：取骨碎补炮制品，加溶剂，提取，过滤，收集滤液，所述骨碎补炮制品为骨碎补微波炮制品。本发明所得指纹图谱能够同时包含骨碎补生品及其不同炮制品的特征峰，能充分全面反映骨碎补生品及其不同炮制品的化学成分信息，基于此，该指纹图谱能够同时用于骨碎补生品及其多种骨碎补炮制品的鉴别，适用范围广。

Description

骨碎补生品及其炮制品UPLC指纹图谱构建及鉴别方法
技术领域
本发明涉及中药炮制品的检测及鉴别领域，具体涉及一种骨碎补生品及其炮制品UPLC指纹图谱构建及鉴别方法。
背景技术
骨碎补为水龙骨科植物槲蕨(Drynaria fortune(Kunze)J.Sm.)的干燥根茎，具有疗伤止痛、补肾强骨以及外用消风祛斑的功效。现代药理研究表明，骨碎补在骨质疏松、骨损伤修复、护牙健齿、肾保护、抗炎降血脂、软骨的保护、抗心肌缺血以及抗病毒等方面有显著疗效。
传统的骨碎补炮制方法以砂烫为主，近年来，随着中药炮制技术的发展，微波炮制已广泛应用于中药炮制领域，相较于传统炮制工艺，其具有节能、可控性及操作性强等优点。此外，微波炮制技术已应用于多种中药饮片的炮制研究，其微波炮制品外观性状、化学成分种类及含量与传统炮制品接近，符合中国药典的要求。
同时，关于骨碎补的炮制研究，《局方》中有记载，“凡使，用刀刮去上黄皮毛令尽，细锉，用酒拌蒸一日，取出晒干用。”《增广验方新编》中记载：“酒炒。”《校注妇人良方》中记载：“酒浸炒”。《雷公炮炙论》中记载“凡使，采得后，先用铜刀刮去黄赤毛尽，便细切，用蜜拌令润，架柳甑蒸一日后，出，曝干用”。这表明，古籍中已有酒炙骨碎补、蜜炙骨碎补的应用。
传统的对骨碎补及其炮制品检测技术例如：2020年版《中国药典》对骨碎补质量控制仅规定了柚皮苷这一指标成分，且对炮制品的研究仍集中在烫骨碎补上；周厚成在“一种烫骨碎补与骨碎补制剂的质量检测及鉴别方法”中仅运用HPLC指纹图谱对生品及砂烫炮制品的制剂进行对比研究；杨海玲在“UPLC法比较骨碎补不同炮制品中柚皮苷、5-羟甲基糠醛含量”中采用UPLC法对骨碎补不同炮制品中指标成分含量进行对比分析。
传统技术均未涉及有关骨碎补生品与传统骨碎补砂烫炮制品、微波炮制品、酒炙炮制品及蜜炙炮制品的指纹图谱的对比研究，主要集中于对骨碎补生品及其砂烫炮制品制剂的检测及对比研究，或者针对不同加工方法、炮制工艺优选的研究，亦或是对单一的柚皮苷含量或者生品特征图谱的研究上，具有一定的应用局限性。
发明内容
基于此，有必要针对传统技术存在局限性的问题，本发明的主要目的是提供一种骨碎补生品及其炮制品UPLC指纹图谱构建及鉴别方法。本发明构建的UPLC指纹图谱能够同时适用于骨碎补生品及其炮制品的鉴别，适用广。
本发明的技术方案包括：
一种鉴别骨碎补生品及骨碎补炮制品的UPLC指纹图谱的构建方法，所述的构建方法包括如下步骤：
分别制备对照品溶液及供试品溶液，采用高效液相色谱法对所述对照品溶液和供试品溶液进行检测；其中，
制备所述对照品溶液的步骤包括：取对照品，加溶剂溶解，所述对照品包括5-羟甲基糠醛、原儿茶酸、新北美圣草苷以及柚皮苷；
制备所述供试品溶液的步骤包括：取骨碎补炮制品，加溶剂提取，收集提取液，所述骨碎补炮制品为骨碎补微波炮制品。
在其中一个实施例中，所述骨碎补微波炮制品的制备步骤包括：将骨碎补置于400W～600W下炮制3min～5min。
在其中一个实施例中，检测所采用的条件包括：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以甲醇为流动相A，以磷酸的体积分数为0.03％～0.08％的磷酸水溶液为流动相B，进行梯度洗脱。
在其中一个实施例中，梯度洗脱的条件包括：
0min～15min，所述流动相A的体积分数由8％上升至12％；
15min～18min，所述流动相A的体积分数由12％上升至15％；
18min～23min，所述流动相A的体积分数由15％上升至20％；
23min～25min，所述流动相A的体积分数由20％上升至22％；
25min～28min，所述流动相A的体积分数由22％上升至28％；
28min～34min，所述流动相A的体积分数由28％上升至35％；
34min～49min，所述流动相A的体积分数由35％上升至38％；
49min～54min，所述流动相A的体积分数由38％上升至45％。
在其中一个实施例中，检测所采用的条件还包括：
流速：0.8mL/min～1.2mL/min；或/和
柱温：28℃～32℃；或/和
鉴别波长：0min～11min，283nm；11min～20min，260nm；20min～30min，283nm；30min～39min，260nm；39min～54min，283nm；或/和
进样量：8μL～12μL。
在其中一个实施例中，制备对照品溶液的步骤中，溶解所采用的溶剂为甲醇；或/和，
制备供试品溶液的步骤中，提取所采用的溶剂为甲醇水溶液，提取的方式为超声提取。
在其中一个实施例中，所述UPLC指纹图谱包含有15个特征峰，所述15个特征峰中包括5-羟甲基糠醛、原儿茶酸、新北美圣草苷以及柚皮苷的特征峰。
一种鉴别骨碎补生品及骨碎补炮制品的方法，所述的方法包括如下步骤：
取骨碎补待测样品，加溶剂提取，收集提取液，制备待测品溶液；
采用高效液相色谱法对所述待测品溶液进行检测，并将得到的所述待测品溶液的检测图谱与如上所述的构建方法构建的UPLC指纹图谱进行比对。
在其中一个实施例中，所述骨碎补炮制品为骨碎补微波炮制品、骨碎补砂烫炮制品、骨碎补酒炙炮制品或者骨碎补蜜炙炮制品。
在其中一个实施例中，检测所采用的条件包括：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以甲醇为流动相A，以磷酸的体积分数为0.03％～0.08％的磷酸水溶液为流动相B，进行梯度洗脱。
在其中一个实施例中，梯度洗脱的条件包括：
0min～15min，所述流动相A的体积分数由8％上升至12％；
15min～18min，所述流动相A的体积分数由12％上升至15％；
18min～23min，所述流动相A的体积分数由15％上升至20％；
23min～25min，所述流动相A的体积分数由20％上升至22％；
25min～28min，所述流动相A的体积分数由22％上升至28％；
28min～34min，所述流动相A的体积分数由28％上升至35％；
34min～49min，所述流动相A的体积分数由35％上升至38％；
49min～54min，所述流动相A的体积分数由38％上升至45％。
在其中一个实施例中，检测所采用的条件还包括：
流速：0.8mL/min～1.2mL/min；或/和
柱温：28℃～32℃；或/和
鉴别波长：0min～11min，283nm；11min～20min，260nm；20min～30min，283nm；30min～39min，260nm；39min～54min，283nm；或/和
进样量：8μL～12μL。
在其中一个实施例中，提取所采用的溶剂为甲醇水溶液，提取的方式为超声提取。
与现有技术相比，本发明具备如下有益效果：
本发明的发明人在系统分析骨碎补生品及其多种炮制品的化学成分差异的基础上，选择骨碎补微波炮制品为供试品，以5-羟甲基糠醛、原儿茶酸、新北美圣草苷以及柚皮苷为对照品，构建含有这些化学成分的UPLC指纹图谱，特别是在合适的色谱条件下构建包括这些化学成分的特征峰且分离度好的含15个特征峰的指纹图谱，所得指纹图谱能够同时包含骨碎补生品及其不同炮制品的特征峰，能充分全面反映骨碎补生品及其不同炮制品的化学成分信息，基于此，该指纹图谱能够同时用于骨碎补生品及其多种骨碎补炮制品的鉴别，适用范围广。并且，采用该指纹图谱鉴别骨碎补生品及骨碎补炮制品，方法稳定，精密度高，重现性好。整体上，本发明为骨碎补生药及炮制品的鉴别提供了一种快速、全面的检测手段。
附图说明
图1为实施例1提供的骨碎补生品的UPLC指纹图谱；
图2为实施例2提供的骨碎补砂烫炮制品的UPLC指纹图谱；
图3为实施例3提供的骨碎补微波炮制品UPLC指纹图谱；
图4为实施例4提供的骨碎补酒炙品UPLC指纹图谱；
图5为实施例5提供的骨碎补蜜炙品UPLC指纹图谱；
图6为实施例6提供的骨碎补生品与不同炮制品UPLC指纹图谱中的色谱峰OPLS-DA得分图；
图7为实施例6提供的对OPLS-DA模型中色谱峰的峰面积投影重要度进行分析结果图。
具体实施方式
为了便于理解本发明，下面将对本发明进行更全面的描述。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
仪器：Waters Arc型高效液相色谱仪(Waters公司)；ME203E千分之一天平(METTLER TOLEDO公司)；ME204E万分之一天平(METTLER TOLEDO公司)；XP26型百万分之一电子天平(METTLER TOLEDO公司)；实验室Milli-Q超纯水系统(默克股份有限公司)；111B型二两装高速中药粉碎机(浙江瑞安市永历制药机械有限公司)；KQ-500DE数控超声机清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；H22-X3型电磁炉(杭州九阳生活电器有限公司)；九阳炒锅(杭州九阳生活电器有限公司)；EG823MF3-NW微波炉(美的集团有限公司)。
试药：药材具体信息见表1。5-羟甲基糠醛、原儿茶酸、柚皮苷对照品均购自中国食品药品检定研究院；新北美圣草苷对照品购自Chem Faces；甲醇、磷酸为色谱纯，水为超纯水；其他试剂均为分析纯。
表1、药材、饮片信息表
Figure BDA0002923340010000061
Figure BDA0002923340010000071
本发明实施例提供一种鉴别骨碎补生品及骨碎补炮制品的UPLC指纹图谱的构建方法，所述的构建方法包括如下步骤：
分别制备对照品溶液及供试品溶液，采用高效液相色谱法对所述对照品溶液和供试品溶液进行检测；其中，
制备所述对照品溶液的步骤包括：取对照品，加溶剂溶解，所述对照品包括5-羟甲基糠醛、原儿茶酸、新北美圣草苷以及柚皮苷；
制备所述供试品溶液的步骤包括：取骨碎补炮制品，加溶剂提取，收集提取液，所述骨碎补炮制品为骨碎补微波炮制品。
本发明实施例所述的“骨碎补微波炮制品”指骨碎补生品经微波处理获得的炮制品。在其中一个示例中，所述骨碎补微波炮制品的制备步骤包括但不限于：将骨碎补置于400W～600W下炮制3min～5min。例如：取大小均匀的骨碎补生品，于500W(中高火)功率的微波炉内进行微波炮制，炮制4min，至表面膨大鼓起，取出，放凉，得不同批次骨碎补微波炮制品，以下具体实施例就以此为例对本发明的方案进行解释说明。
本发明实施例所述的“骨碎补生品”指没有经过炮制的骨碎补药材，其获取步骤包括：收集不同批次骨碎补药材，筛选符合2020年版《中国药典》标准要求的骨碎补样品，切成大小均匀的厚片，得不同批次骨碎补生品，以下具体实施例就以此为例对本发明的方案进行解释说明。在其中一个示例中，检测所采用的条件包括：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以甲醇为流动相A，以磷酸的体积分数为0.03％～0.08％的磷酸水溶液为流动相B，进行梯度洗脱。
在其中一个示例中，梯度洗脱的条件包括：
0min～15min，所述流动相A的体积分数由8％上升至12％；
15min～18min，所述流动相A的体积分数由12％上升至15％；
18min～23min，所述流动相A的体积分数由15％上升至20％；
23min～25min，所述流动相A的体积分数由20％上升至22％；
25min～28min，所述流动相A的体积分数由22％上升至28％；
28min～34min，所述流动相A的体积分数由28％上升至35％；
34min～49min，所述流动相A的体积分数由35％上升至38％；
49min～54min，所述流动相A的体积分数由38％上升至45％。
在其中一个示例中，检测所采用的条件还包括：
流速：0.8mL/min～1.2mL/min；或/和
柱温：28℃～32℃；或/和
鉴别波长：0min～11min，283nm；11min～20min，260nm；20min～30min，283nm；30min～39min，260nm；39min～54min，283nm；或/和
进样量：8μL～12μL。
在其中一个示例中，制备对照品溶液的步骤中，溶解所采用的溶剂为甲醇。
在其中一个示例中，制备供试品溶液的步骤中，提取所采用的溶剂为甲醇水溶液(含甲醇的体积分数可以为40％～60％，例如为50％)，提取的方式为超声提取。超声提取所采用的条件可以控制在如下范围：超声功率为250W～350W，超声频率为35kHz～45kHz。
在其中一个示例中，所述UPLC指纹图谱包含有15个特征峰，所述15个特征峰中包括5-羟甲基糠醛、原儿茶酸、新北美圣草苷以及柚皮苷的特征峰。具体地，本发明实施例UPLC指纹图谱所含的15个特征峰中，2号峰为5-羟甲基糠醛，4号峰为原儿茶酸，13号峰为新北美圣草苷，15号峰为柚皮苷。
同时，本发明实施例还提供一种鉴别骨碎补生品及骨碎补炮制品的方法，所述的方法包括如下步骤：
取骨碎补待测样品，加溶剂提取，收集提取液，制备待测品溶液；
采用高效液相色谱法对所述待测品溶液进行检测，并将得到的所述待测品溶液的检测图谱与如上所述的构建方法构建的UPLC指纹图谱进行比对。
在其中一个示例中，所述骨碎补炮制品为骨碎补微波炮制品、骨碎补砂烫炮制品、骨碎补酒炙炮制品或者骨碎补蜜炙炮制品。
本发明实施例所涉“骨碎补砂烫炮制品”可以通过如下步骤制备：取洁净河砂置炒锅内，用武火加热至滑利状态时，投入大小均匀的骨碎补饮片，不断翻炒4min，至体膨大鼓起，筛去河砂，放凉，得不同批次骨碎补砂烫炮制品。以下具体实施例就以此为例对本发明的方案进行解释说明。
本发明实施例所涉“骨碎补酒炙炮制品”可以通过如下步骤制备：取大小均匀的骨碎补生品，加定量稀释后的黄酒拌匀闷润至黄酒吸尽，置炒锅内文火炒4min，取出，放凉，得不同批次骨碎补酒炙炮制品。以下具体实施例就以此为例对本发明的方案进行解释说明。
本发明实施例所涉“骨碎补蜜炙炮制品”可以通过如下步骤制备：取大小均匀的骨碎补生品，加定量稀释后的炼蜜拌匀闷润至蜜吸尽，置炒锅内文火炒4min，取出，放凉，得不同批次骨碎补蜜炙炮制品。以下具体实施例就以此为例对本发明的方案进行解释说明。
如果待测样品为骨碎补生品，那么所得检测图谱含有11个共有峰，其中4号峰为原儿茶酸、13号峰为新北美圣草苷、15号峰为柚皮苷，相对于通过上述方法构建的UPLC指纹图谱而言，检测图谱没有检出峰1、峰2(5-HMF)、峰3、峰9。
如果待测样品为骨碎补砂烫炮制品，那么所得检测图谱含有14个共有峰，其中2号峰为5-羟甲基糠醛、4号峰为原儿茶酸、13号峰为新北美圣草苷、15号峰为柚皮苷，相对于通过上述方法构建的UPLC指纹图谱而言，检测图谱没有检出峰5。
如果待测样品为骨碎补微波炮制品，那么所得检测图谱含有15个共有峰，其中2号峰为5-羟甲基糠醛(5-HMF)、4号峰为原儿茶酸、13号峰为新北美圣草苷、15号峰为柚皮苷，即所得检测图谱与通过上述方法构建的UPLC指纹图谱相同。
如果待测样品为骨碎补酒炙炮制品，那么所得检测图谱含有14个共有峰，其中2号峰为5-羟甲基糠醛(5-HMF)、4号峰为原儿茶酸、13号峰为新北美圣草苷、15号峰为柚皮苷，相对于通过上述方法构建的UPLC指纹图谱而言，检测图谱没有检出峰9。
如果待测样品为骨碎补蜜炙炮制品，那么所得检测图谱含有13个共有峰，其中2号峰为5-羟甲基糠醛(5-HMF)、4号峰为原儿茶酸、13号峰为新北美圣草苷、15号峰为柚皮苷，相对于通过上述方法构建的UPLC指纹图谱而言，检测图谱没有检出峰3、峰9。
在其中一个示例中，检测所采用的条件包括：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以甲醇为流动相A，以磷酸的体积分数为0.03％～0.08％的磷酸水溶液为流动相B，进行梯度洗脱。
在其中一个示例中，梯度洗脱的条件包括：
0min～15min，所述流动相A的体积分数由8％上升至12％；
15min～18min，所述流动相A的体积分数由12％上升至15％；
18min～23min，所述流动相A的体积分数由15％上升至20％；
23min～25min，所述流动相A的体积分数由20％上升至22％；
25min～28min，所述流动相A的体积分数由22％上升至28％；
28min～34min，所述流动相A的体积分数由28％上升至35％；
34min～49min，所述流动相A的体积分数由35％上升至38％；
49min～54min，所述流动相A的体积分数由38％上升至45％。
在其中一个示例中，检测所采用的条件还包括：
流速：0.8mL/min～1.2mL/min；或/和
柱温：28℃～32℃；或/和
鉴别波长：0min～11min，283nm；11min～20min，260nm；20min～30min，283nm；30min～39min，260nm；39min～54min，283nm；或/和
进样量：8μL～12μL。
在其中一个示例中，所述待测品溶液的制备步骤中，提取所采用的溶剂可以为甲醇水溶液(含甲醇的体积分数可以为40％～60％，例如为50％)，提取的方式可以为超声提取。超声提取所采用的条件可以控制在如下范围：超声功率为250W～350W，超声频率为35kHz～45kHz。
在其中一个示例中，所述待测品溶液的制备步骤中，可以采用合适孔径的滤膜进行过滤，例如可以采用0.22μm微孔滤膜过滤。
实施例1、骨碎补生品UPLC指纹图谱的构建
1.试验方法
1.1对照品溶液的制备
精密称取5-羟甲基糠醛对照品、原儿茶酸对照品、新北美圣草苷对照品、柚皮苷对照品适量，加甲醇制成每1mL含5-羟甲基糠醛615.34μg、原儿茶酸280.12μg、新北美圣草苷257.54μg、柚皮苷297.67μg的溶液，摇匀，即得混合对照品溶液。
1.2色谱条件
以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以甲醇为流动相A，0.05％磷酸水溶液为流动相B，进行梯度洗脱，流速为1.0mL/min，柱温为30℃，鉴别波长为：0min～11min，283nm；11min～20min，260nm；20min～30min，283nm；30min～39min，260nm；39min～54min，283nm；进样量为10μL。梯度洗脱程序见表2。
表2、梯度洗脱表
时间/min 流动相A/％ 流动相B/％
0～15 8→12 92→88
15～18 12→15 88→85
18～23 15→20 85→80
23～25 20→22 80→78
25～28 22→28 78→72
28～34 28→35 72→65
34～49 35→38 65→62
49～54 38→45 62→55
1.3供试品溶液的制备
取骨碎补生品粉末适量，取约0.5g，精密称定，精密加50％甲醇25mL，称定重量，超声处理(功率300W，频率40kHz)30min，放冷，再称定重量，用50％甲醇补足减失重量，摇匀，经0.22μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得骨碎补生品供试品溶液。
2.测定法：分别精密吸取对照品溶液、骨碎补生品供试品溶液各10μL，注入液相色谱仪，测定，即得。
3.指纹图谱共有峰的确定
3.1UPLC指纹图谱的获得：
取10批骨碎补生品粉末，参照本实施例1.3项下方法制备骨碎补生品供试品溶液，参照本实施例1.2项下的色谱条件获得10批骨碎补生品UPLC指纹图谱(见图1)。
3.2实验结果：
10批骨碎补生品UPLC指纹图谱均显示相同的11个共有峰，因此选择上述11个共有峰作为骨碎补生品UPLC指纹图谱的特征峰，并以峰15(柚皮苷)为参照峰进行标准研究。
4.指纹图谱的建立
对10批骨碎补生品的共有峰信息进行分析，最终规定骨碎补生品指纹图谱标准为：供试品指纹图谱中应有11个共有峰。其中4号峰为原儿茶酸、13号峰为新北美圣草苷、15号峰为柚皮苷。以上3个峰应分别与相应的对照品参照物峰保留时间相同；以柚皮苷为参照物峰S，计算各特征峰与S峰的相相对峰面积，见表3、表4。图谱中不应检出峰1、峰2(5-HMF)、峰3、峰9。
表3、10批骨碎补生品指纹图谱相对保留时间
Figure BDA0002923340010000131
表4、10批骨碎补生品指纹图谱相对峰面积
Figure BDA0002923340010000141
实施例2、骨碎补砂烫炮制品UPLC指纹图谱的构建
1.试验方法
1.1对照品溶液的制备
精密称取5-羟甲基糠醛对照品、原儿茶酸对照品、新北美圣草苷对照品、柚皮苷对照品适量，加甲醇制成每1mL含5-羟甲基糠醛615.34μg、原儿茶酸280.12μg、新北美圣草苷257.54μg、柚皮苷297.67μg的溶液，摇匀，即得混合对照品溶液。
1.2色谱条件
以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以甲醇为流动相A，0.05％磷酸水溶液为流动相B，进行梯度洗脱，流速为1.0mL/min，柱温为30℃，鉴别波长为：0min～11min，283nm；11min～20min，260nm；20min～30min，283nm；30min～39min，260nm；39 min～54min，283nm；进样量为10μL。梯度洗脱程序见表5。
表5、梯度洗脱表
时间/min 流动相A/％ 流动相B/％
0～15 8→12 92→88
15～18 12→15 88→85
18～23 15→20 85→80
23～25 20→22 80→78
25～28 22→28 78→72
28～34 28→35 72→65
34～49 35→38 65→62
49～54 38→45 62→55
1.3供试品溶液的制备
取骨碎补砂烫炮制品粉末适量，取约0.5g，精密称定，精密加50％甲醇25mL，称定重量，超声处理(功率300W，频率40kHz)30min，放冷，再称定重量，用50％甲醇补足减失重量，摇匀，经0.22μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得骨碎补砂烫炮制品供试品溶液。
2.测定法：分别精密吸取对照品溶液、骨碎补砂烫炮制品供试品溶液各10μL，注入液相色谱仪，测定，即得。
3.指纹图谱共有峰的确定
3.1UPLC指纹图谱的获得：
取10批骨碎补砂烫炮制品粉末，参照本实施例1.3项下方法制备骨碎补砂烫炮制品供试品溶液，参照本实施例1.2项下的色谱条件获得10批骨碎补砂烫炮制品UPLC指纹图谱(见图2)。
3.2实验结果：
10批骨碎补砂烫炮制品UPLC指纹图谱均显示相同的14个共有峰，因此选择上述14个共有峰作为骨碎补砂烫炮制品UPLC指纹图谱的特征峰，并以峰15(柚皮苷)为参照峰进行标准研究。
4.指纹图谱的建立
对10批骨碎补砂烫炮制品的共有峰信息进行分析，最终规定骨碎补砂烫炮制品指纹图谱标准为：供试品指纹图谱中应有14个共有峰。其中2号峰为5-羟甲基糠醛、4号峰为原儿茶酸、13号峰为新北美圣草苷、15号峰为柚皮苷。以上4个峰应分别与相应的对照品参照物峰保留时间相同；以柚皮苷为参照物峰S，计算各特征峰与S峰的相对保留时间及相对峰面积，见表6、表7。图谱中不应检出峰5。
表6、10批骨碎补砂烫炮制品指纹图谱相对保留时间
Figure BDA0002923340010000161
表7、10批骨碎补砂烫炮制品指纹图谱相对峰面积
Figure BDA0002923340010000162
Figure BDA0002923340010000171
实施例3、骨碎补微波炮制品UPLC指纹图谱的构建
1.试验方法
1.1对照品溶液的制备
精密称取5-羟甲基糠醛对照品、原儿茶酸对照品、新北美圣草苷对照品、柚皮苷对照品适量，加甲醇制成每1mL含5-羟甲基糠醛615.34μg、原儿茶酸280.12μg、新北美圣草苷257.54μg、柚皮苷297.67μg的溶液，摇匀，即得混合对照品溶液。
1.2色谱条件
以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以甲醇为流动相A，0.05％磷酸水溶液为流动相B，进行梯度洗脱，流速为1.0mL/min，柱温为30℃，鉴别波长为：0min～11min，283nm；11min～20min，260nm；20min～30min，283nm；30min～39min，260nm；39min～54min，283nm；进样量为10μL。梯度洗脱程序见表8。
表8、梯度洗脱表
时间/min 流动相A/％ 流动相B/％
0～15 8→12 92→88
15～18 12→15 88→85
18～23 15→20 85→80
23～25 20→22 80→78
25～28 22→28 78→72
28～34 28→35 72→65
34～49 35→38 65→62
49～54 38→45 62→55
1.3供试品溶液的制备
取骨碎补微波炮制品粉末适量，取约0.5g，精密称定，精密加50％甲醇25mL，称定重量，超声处理(功率300W，频率40kHz)30min，放冷，再称定重量，用50％甲醇补足减失重量，摇匀，经0.22μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得骨碎补微波炮制品供试品溶液。
2.测定法：分别精密吸取对照品溶液、骨碎补微波炮制品供试品溶液各10μL，注入液相色谱仪，测定，即得。
3.指纹图谱共有峰的确定
3.1UPLC指纹图谱的获得：
取10批骨碎补微波炮制品粉末，参照本实施例1.3项下方法制备骨碎补微波炮制品供试品溶液，参照本实施例1.2项下的色谱条件获得10批骨碎补微波炮制品UPLC指纹图谱(见图3)。
3.2实验结果：
10批骨碎补微波炮制品UPLC指纹图谱均显示相同的15个共有峰，因此选择上述15个共有峰作为骨碎补微波炮制品UPLC指纹图谱的特征峰，并以峰15(柚皮苷)为参照峰进行标准研究。
4.指纹图谱的建立
对10批骨碎补微波炮制品的共有峰信息进行分析，最终规定骨碎补微波炮制品指纹图谱标准为：供试品指纹图谱中应有15个共有峰。其中2号峰为5-羟甲基糠醛、4号峰为原儿茶酸、13号峰为新北美圣草苷、15号峰为柚皮苷。以上4个峰应分别与相应的对照品参照物峰保留时间相同；以柚皮苷为参照物峰S，计算各特征峰与S峰的相对保留时间及相对峰面积，见表9、表10。
表9、10批骨碎补微波炮制品指纹图谱相对保留时间
Figure BDA0002923340010000181
Figure BDA0002923340010000191
表10、10批骨碎补微波炮制品指纹图谱相对峰面积
Figure BDA0002923340010000192
实施例4、骨碎补酒炙炮制品UPLC指纹图谱的构建
1.试验方法
1.1对照品溶液的制备
精密称取5-羟甲基糠醛对照品、原儿茶酸对照品、新北美圣草苷对照品、柚皮苷对照品适量，加甲醇制成每1mL含5-羟甲基糠醛615.34μg、原儿茶酸280.12μg、新北美圣草苷257.54μg、柚皮苷297.67μg的溶液，摇匀，即得混合对照品溶液。
1.2色谱条件
以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以甲醇为流动相A，0.05％磷酸水溶液为流动相B，进行梯度洗脱，流速为1.0mL/min，柱温为30℃，鉴别波长为：0min～11min，283nm；11min～20min，260nm；20min～30min，283nm；30min～39min，260nm；39min～54min，283nm；进样量为10μL。梯度洗脱程序见表11。
表11、梯度洗脱表
时间/min 流动相A/％ 流动相B/％
0～15 8→12 92→88
15～18 12→15 88→85
18～23 15→20 85→80
23～25 20→22 80→78
25～28 22→28 78→72
28～34 28→35 72→65
34～49 35→38 65→62
49～54 38→45 62→55
1.3供试品溶液的制备
取骨碎补酒炙炮制品粉末适量，取约0.5g，精密称定，精密加50％甲醇25mL，称定重量，超声处理(功率300W，频率40kHz)30min，放冷，再称定重量，用50％甲醇补足减失重量，摇匀，经0.22μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得骨碎补酒炙炮制品供试品溶液。
2.测定法：分别精密吸取对照品溶液、骨碎补酒炙炮制品供试品溶液各10μL，注入液相色谱仪，测定，即得。
3.指纹图谱共有峰的确定
3.1UPLC指纹图谱的获得：
取10批骨碎补酒炙炮制品粉末，参照本实施例1.3项下方法制备骨碎补酒炙炮制品供试品溶液，参照本实施例1.2项下的色谱条件获得10批骨碎补酒炙炮制品UPLC指纹图谱(见图4)。
3.2实验结果：
10批骨碎补酒炙炮制品UPLC指纹图谱均显示相同的14个共有峰，因此选择上述14个共有峰作为骨碎补酒炙炮制品UPLC指纹图谱的特征峰，并以峰15(柚皮苷)为参照峰进行标准研究。
4.指纹图谱的建立
对10批骨碎补酒炙炮制品的共有峰信息进行分析，最终规定骨碎补酒炙炮制品指纹图谱标准为：供试品指纹图谱中应有14个共有峰。其中2号峰为5-羟甲基糠醛、4号峰为原儿茶酸、13号峰为新北美圣草苷、15号峰为柚皮苷。以上4个峰应分别与相应的对照品参照物峰保留时间相同；以柚皮苷为参照物峰S，计算各特征峰与S峰的相对保留时间及相对峰面积，见表12、表13。图谱中不应检出峰9。
表12、10批骨碎补酒炙炮制品指纹图谱相对保留时间
Figure BDA0002923340010000211
表13、10批骨碎补酒炙炮制品指纹图谱相对峰面积
Figure BDA0002923340010000212
Figure BDA0002923340010000221
实施例5、骨碎补蜜炙炮制品UPLC指纹图谱的构建
1.试验方法
1.1对照品溶液的制备
精密称取5-羟甲基糠醛对照品、原儿茶酸对照品、新北美圣草苷对照品、柚皮苷对照品适量，加甲醇制成每1mL含5-羟甲基糠醛615.34μg、原儿茶酸280.12μg、新北美圣草苷257.54μg、柚皮苷297.67μg的溶液，摇匀，即得混合对照品溶液。
1.2色谱条件
以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以甲醇为流动相A，0.05％磷酸水溶液为流动相B，进行梯度洗脱，流速为1.0mL/min，柱温为30℃，鉴别波长为：0min～11min，283nm；11min～20min，260nm；20min～30min，283nm；30min～39min，260nm；39min～54min，283nm；进样量为10μL。梯度洗脱程序见表14。
表14、梯度洗脱表
Figure BDA0002923340010000222
Figure BDA0002923340010000231
1.3供试品溶液的制备
取骨碎补蜜炙炮制品粉末适量，取约0.5g，精密称定，精密加50％甲醇25mL，称定重量，超声处理(功率300W，频率40kHz)30min，放冷，再称定重量，用50％甲醇补足减失重量，摇匀，经0.22μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得骨碎补蜜炙炮制品供试品溶液。
2.测定法：分别精密吸取对照品溶液、骨碎补蜜炙炮制品供试品溶液各10μL，注入液相色谱仪，测定，即得。
3.指纹图谱共有峰的确定
3.1UPLC指纹图谱的获得
取10批骨碎补蜜炙炮制品粉末，参照本实施例1.3项下方法制备骨碎补蜜炙炮制品供试品溶液，参照本实施例1.2项下的色谱条件获得10批骨碎补蜜炙炮制品UPLC指纹图谱(图5)。
3.2实验结果
10批骨碎补蜜炙炮制品UPLC指纹图谱均显示相同的13个共有峰，因此选择上述13个共有峰作为骨碎补蜜炙炮制品UPLC指纹图谱的特征峰，并以峰15(柚皮苷)为参照峰进行标准研究。
4.指纹图谱的建立
对10批骨碎补蜜炙炮制品的共有峰信息进行分析，最终规定骨碎补蜜炙炮制品指纹图谱标准为：供试品指纹图谱中应有13个共有峰。其中2号峰为5-羟甲基糠醛、4号峰为原儿茶酸、13号峰为新北美圣草苷、15号峰为柚皮苷。以上4个峰应分别与相应的对照品参照物峰保留时间相同；以柚皮苷为参照物峰S，计算各特征峰与S峰的相对保留时间及相对峰面积，见表15、表16。图谱中不应检出峰3、峰9。
表15、10批骨碎补蜜炙炮制品指纹图谱相对保留时间
Figure BDA0002923340010000241
表16、10批骨碎补蜜炙炮制品指纹图谱相对峰面积
Figure BDA0002923340010000242
实施例6、骨碎补生品与不同炮制品UPLC指纹图谱的鉴别
1.供试品溶液的制备：
分别取骨碎补生品与不同炮制品粉末，10批，每批次取约0.5g，精密称定，精密加50％甲醇25mL，称定重量，超声处理(功率300W，频率40kHz)30min，放冷，再称定重量，用50％甲醇补足减失重量，摇匀，经0.22μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得不同样品供试品溶液。
2.测定法：分别精密吸取对照品溶液、骨碎补不同供试品溶液各10μL，注入液相色谱仪，测定，即得。
3.鉴别分析：
将骨碎补生品与不同炮制品UPLC指纹图谱中的15个色谱峰进行偏正交最小二乘判别分析(OPLS-DA)模型构建，缺失色谱峰峰面积以0标记，OPLS-DA得分图见图6。对OPLS-DA模型中15个色谱峰的峰面积投影重要度(VIP)进行分析(见图7)，VIP值越大，即变量离X轴越远，表明该色谱峰对于骨碎补生品与炮制品的分类贡献越大，即可能是区分骨碎补生品与炮制品的差异性成分，其VIP值大于1.0的色谱峰对样品分类的影响大小排序为5-羟甲基糠醛>柚皮苷>新北美圣草苷>峰1>峰7，说明以上指标对骨碎补生品与不同炮制品的区分影响显著。同时进行单因素方差分析，峰1、峰2(5-羟甲基糠醛)是骨碎补生品经炮制后新产生的化合物，其可作为区分骨碎补生品与炮制品最主要的指标。
综合以上评价，优选峰1、5-羟甲基糠醛、峰3、峰5、峰9、柚皮苷、新北美圣草苷作为骨碎补生品与不同炮制品鉴别的重要特征峰，且骨碎补生品中不应检出峰1、5-羟甲基糠醛、峰3、峰9；骨碎补砂烫炮制品中不应检出峰5；骨碎补酒炙炮制品中不应检出峰9；骨碎补蜜炙炮制品中不应检出峰3、峰9。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (8)

1.一种鉴别骨碎补生品及骨碎补炮制品的UPLC指纹图谱的构建方法，其特征在于，所述的构建方法包括如下步骤：
分别制备对照品溶液及供试品溶液，并采用高效液相色谱法对所述对照品溶液和供试品溶液进行检测；其中，
制备所述对照品溶液的步骤包括：取对照品，加溶剂溶解，所述对照品包括5-羟甲基糠醛、原儿茶酸、新北美圣草苷以及柚皮苷；
制备所述供试品溶液的步骤包括：取骨碎补炮制品，加溶剂提取，收集提取液，所述骨碎补炮制品为骨碎补微波炮制品；
检测所采用的条件包括：
以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以甲醇为流动相A，以磷酸的体积分数为0.03%～0.08%的磷酸水溶液为流动相B，进行梯度洗脱；
梯度洗脱的条件包括：
0min～15min，所述流动相A的体积分数由8%上升至12%；
15min～18min，所述流动相A的体积分数由12%上升至15%；
18min～23min，所述流动相A的体积分数由15%上升至20%；
23min～25min，所述流动相A的体积分数由20%上升至22%；
25min～28min，所述流动相A的体积分数由22%上升至28%；
28min～34min，所述流动相A的体积分数由28%上升至35%；
34min～49min，所述流动相A的体积分数由35%上升至38%；
49min～54min，所述流动相A的体积分数由38%上升至45%；
鉴别波长：0min～11min，283nm；11min～20min，260nm；20min～30min，283nm；30min～39min，260nm；39min～54min，283nm。
2.根据权利要求1所述的鉴别骨碎补生品及骨碎补炮制品的UPLC指纹图谱的构建方法，其特征在于，所述骨碎补微波炮制品的制备步骤包括：将骨碎补置于400W～600W下炮制3min～5min。
3.根据权利要求1或者2所述的鉴别骨碎补生品及骨碎补炮制品的UPLC指纹图谱的构建方法，其特征在于，检测所采用的条件还包括：
流速：0.8 mL/min～1.2mL/min；或/和
柱温：28℃～32℃。
4.根据权利要求1或者2所述的鉴别骨碎补生品及骨碎补炮制品的UPLC指纹图谱的构建方法，其特征在于，制备所述对照品溶液的步骤中，溶解所采用的溶剂为甲醇；或/和，
制备所述供试品溶液的步骤中，提取所采用的溶剂为甲醇水溶液，提取的方式为超声提取。
5.根据权利要求1或者2所述的鉴别骨碎补生品及骨碎补炮制品的UPLC指纹图谱的构建方法，其特征在于，所述UPLC指纹图谱包含有15个特征峰，所述15个特征峰中包括5-羟甲基糠醛、原儿茶酸、新北美圣草苷以及柚皮苷的特征峰。
6.一种鉴别骨碎补生品及骨碎补炮制品的方法，其特征在于，所述的方法包括如下步骤：
取骨碎补待测样品，加溶剂提取，收集提取液，制备待测品溶液；
采用权利要求1至5任一项中定义的高效液相色谱法对所述待测品溶液进行检测，并将得到的所述待测品溶液的检测图谱与权利要求1至5任一项所述的构建方法构建的UPLC指纹图谱进行比对。
7.根据权利要求6所述的鉴别骨碎补生品及骨碎补炮制品的方法，其特征在于，所述骨碎补炮制品为骨碎补微波炮制品、骨碎补砂烫炮制品、骨碎补酒炙炮制品或者骨碎补蜜炙炮制品。
8.根据权利要求6或者7所述的鉴别骨碎补生品及骨碎补炮制品的方法，其特征在于，提取所采用的溶剂为甲醇水溶液，提取的方式为超声提取。
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