CN110646528A - 一种基于hplc/uplc-qtof-ms检测骨碎补中多成分的方法 - Google Patents

一种基于hplc/uplc-qtof-ms检测骨碎补中多成分的方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种基于HPLC/UPLC‑QTOF‑MS检测骨碎补中多成分的方法，包括如下步骤：(1)取骨碎补样品制成骨碎补粉末，精密称定，然后与溶剂混合，称定重量，超声处理，摇匀，过滤，取续滤液，得到待测样品；(2)用HPLC/UPLC分离步骤(1)中的待测样品，然后用质谱检测，得成分物质峰，用分析软件对所述成分物质峰进行定性分析。本发明采用HPLC/UPLC‑QTOF‑MS技术对骨碎补中多成分进行检测，该方法操作简便、快速、准确、高效，实现了骨碎补中多成分的快速定性分析，对于提高骨碎补药材的质量标准有重要意义。

Description

一种基于HPLC/UPLC-QTOF-MS检测骨碎补中多成分的方法
技术领域
本发明涉及医药成分分析领域，具体涉及一种基于HPLC/UPLC-QTOF-MS检测骨碎补中多成分的方法。
背景技术
骨碎补为水龙骨科植物槲蕨Drynaria fortunei(Kunze)J.Sm.的干燥根茎，性温、味苦，归肝、肾经，具有强骨补肾、止痛续伤之功效。临床主要用于筋骨折伤、肾虚腰痛、筋骨痿软、耳鸣耳聋、牙齿松动等；外治斑秃、白癜风和外用消风祛斑等病症。研究报道，其主要含有黄酮类、苯丙素类、酚酸类、三萜类、挥发油等多种活性成分，其中以柚皮苷代表的二氢黄酮类为骨碎补中主要成分(王凤娇,王婷婷,徐铭胡等.骨碎补化学成分及其对PC12细胞的保护作用研究[J].中国药学杂志,2018,53(16):1359-1365)。现代药理学研究骨碎补具有促增殖分化作用、抗骨质疏松作用、抗炎作用、促进骨折愈合、牙骨细胞保护作用、肾保护作用、防治药物中毒性耳聋、降血脂等作用(李晋玉,赵学千,孙旗,等.骨碎补总黄酮的实验及临床研究概况[J].中国骨质疏松杂志,2018,24(10):1357-1364)。
由于骨碎补药效物质基础尚不明确，药材的质量控制手段主要有传统的生药学研究(张炎兵,田军明.骨碎补的生药研究[J].中医药导报,2013,19(12):104,107)、以柚皮苷为对照的TLC法(韦国麟.刘华珍,蔡杰,等.藿草壮骨合剂中淫羊藿、骨碎补等薄层色谱鉴别方法的研究[J].按摩与康复医学,2015,6(16):75-77)、HPLC指纹图谱(刘珂弟,乔雪,梁永红,等.骨碎补的HPLC指纹图谱研究[J].中草药,2011,42(3):510-514)、GC指纹图谱(李晓红,姜明燕,熊志立.骨碎补药材脂溶性成分的气相色谱指纹图谱[J].山西医药杂志,2013,42(11):1211-1212)，含量测定方面多集中在几种黄酮类的测定(王清华.HPLC-UV法测定烫骨碎补中柚皮苷的含量[J].宜春学院学报,2017,39(9):20-22；杨海玲,吴丽丹,谢鹏,等.HPLC法比较骨碎补不同炮制品中柚皮苷、5-羟甲基糠醛含量[J].中药材,2016,39(11):2509-2512)，在《中国药典》2015年版一部中，骨碎补项下采用柚皮苷进行TLC鉴别，以HPLC法测定柚皮苷的含量作为质控手段。这些技术手段和方法难以全面系统的表征化学成分轮廓特征和控制药材的内在质量。传统生药学研究，有时候带有一定的主观性，在复杂的中药材质量控制中有一定的局限性；而经典的TLC法中存在大量的假阳性和假阴性问题，易导致实验结论的偏差；以HPLC为主的中药指纹图谱技术基于从整体面貌上辨认样品的真实性，在中药质量控制中发挥重要角色，但中药材基原广泛、中药材受品种、产地、种植、采收、炮制等多种因素影响，难以控制，不同药材其指纹图谱有一定的差异，实验室条件、仪器设备的不同也会影响指纹图谱的重现性；GC-MS法更多的适用于含挥发性成分为主的中药材质量控制的应用。
高效或超高效液相色谱法(HPLC或UPLC)分离效果好，分析速度快，非常适合多组分快速检测，而四级杆串联飞行时间质谱(Q-TOF)分辨率高、灵敏度高，结合同位素分析和高分辨的分子量，能够实现分子量的精确测定，适合复杂基质中组分的检测定性，因此HPLC/UPLC-QTOF-MS已成为复杂基质中多成分的有效快速准确的检测手段，一种简便、快速、准确、高效的对骨碎补进行全成分分析的方法亟待开发出来。
发明内容
发明要解决的问题
为了解决现有技术中的上述问题，本发明的目的在于提供一种基于HPLC/UPLC-QTOF-MS检测骨碎补中多成分的方法，所述方法具有快速、准确、批量检测的特点，操作简便，简化了完全分离和纯化、再一一鉴别的步骤，降低了成本，为骨碎补药材的全面质量控制提供依据。
用于解决问题的方案
在本发明的一个技术方案中，本发明提供了一种基于HPLC/UPLC-QTOF-MS检测骨碎补中多成分的方法，包括如下步骤：
(1)取骨碎补样品制成骨碎补粉末，精密称定，然后与溶剂混合，称定重量，超声处理，摇匀，过滤，取续滤液后得到待测样品；
(2)用HPLC/UPLC分离步骤(1)中的待测样品，然后用质谱检测，得成分物质峰，用分析软件对所述成分物质峰进行定性分析。
在一个实施方式中，步骤(1)中的溶剂为甲醇、乙醇、水、甲醇水溶液或乙醇水溶液，优选地所述溶剂选自25％～75％甲醇水溶液，更优选为50％甲醇水溶液。
在另一个实施方式中，步骤(1)中骨碎补粉末与溶剂的质量体积比为1g：80～150ml，优选地质量体积比为1g：110～130ml。
在另一个实施方式中，所述超声处理的时间为15～60min，进一步优选30～50min；所述超声的功率为200～300W；所述超声的频率为30～50kHz。
在另一个实施方式中，所述方法还包括以下步骤，将骨碎补超声处理后，放冷，再称定重量，用步骤(1)中的溶剂补足减失的重量。
在另一个实施方式中，所述过滤采用膜过滤，优选采用孔径为0.10～0.50μm的微孔滤膜。
在另一个实施方式中，步骤(2)中的HPLC/UPLC的分离条件为：色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，优选色谱柱为Hanbon Megres C18，柱温为20～40℃，洗脱系统流动相为：流动相A为甲醇，流动相B为甲酸-水，流速为0.5～5ml/min，优选0.5～2.0ml/min。
在另一个实施方式中，洗脱程序为下表所述：
时间(分钟) 流动相A(％) 流动相B(％)
0～5 10 90
5～15 10→20 90→80
15～27 20→25 80→75
27～35 25→35 75→65
35～50 35→45 65→55
50～55 45 55
。流动相A和流动相B的体积百分数之和为100％。
在另一个实施方式中，步骤(2)中质谱检测的条件为：离子源为电喷雾离子源ESI，干燥气温度为200-400℃，流量为1-20L/min，雾化器压力为20-50psi。
在另一个实施方式中，所述的分析软件为Agilent MassHunter QualitativeAnalysis software。
在另一个技术方案中，本发明还提供采用本发明前述的一种基于HPLC/UPLC-QTOF-MS检测骨碎补中多成分的方法用来分析骨碎补药材中16种化学成分的用途。
发明的效果
本发明提供了基于HPLC/UPLC-QTOF-MS检测骨碎补中多种化学成分的方法，针对骨碎补中多种化学成分的化学性质，筛选样品提取以及液相色谱、质谱的条件，实现了对骨碎补中多种化学成分进行快速分离与鉴定，有助于保证骨碎补配方颗粒的质量稳定。该方法操作简便、快速、准确、高效，样品前处理简便，简化实验步骤，降低了成本。本发明共分离鉴定出16种化学成分，对于提高骨碎补药材的质量标准有重要意义。
附图说明
图1本发明实施例1待测样品的正、负离子模式下TIC图：A.待测样品的正离子模式下TIC图；B.待测样品的负离子模式下TIC图
图2本发明实施例1骨碎补药材中峰2(奎宁酸)的：A.正离子提取离子流图(EIC)；B.负离子提取离子流图(EIC)；C.一级正离子质谱图；D.一级负离子质谱图
图3本发明实施例1骨碎补药材中峰13(新北美圣草苷)的：A.正离子提取离子流图(EIC)；B.负离子提取离子流图(EIC)；C.一级正离子质谱图；D.一级负离子质谱图
图4本发明实施例1骨碎补药材中峰15(柚皮苷)的：A.正离子提取离子流图(EIC)；B.负离子提取离子流图(EIC)；C.一级正离子质谱图；D.一级负离子质谱图
具体实施方式
为了更好地说明本发明，在下文的具体实施方式中给出了众多的具体细节。本领域技术人员应当理解，没有某些具体细节，本发明同样可以实施。在另外一些实例中，对于本领域技术人员熟知的方法、手段、器材和步骤未作详细描述，以便于凸显本发明的主旨。
除非另有定义，本发明所用的技术和科学术语具有与本发明所属技术领域中的普通技术人员所通常理解的相同含义。
本说明书中，使用“数值A～数值B”表示的数值范围是指包含端点数值A、B的范围。
本说明书中，使用“可以”表示的含义包括了进行某种处理以及不进行某种处理两方面的含义。
本说明书中，所提及的“一个或一些具体/优选的实施方式/方案”、“另一个或另一些具体/优选的实施方式/方案”、“一个或另一个实施方式/方案”、“一个或另一个技术方案”等是指所描述的与该实施方式有关的特定要素(例如，特征、结构、性质和/或特性)包括在此处所述的至少一种实施方式中，并且可存在于其它实施方式中或者可不存在于其它实施方式中。另外，应理解，所述要素可以任何合适的方式组合在各种实施方式中。
本发明的说明书和权利要求书及上述附图中的术语“包括”以及它们任何变形，意图在于覆盖不排他的包含。例如包含一系列步骤或单元的过程、方法或系统、产品或设备没有限定于已列出的步骤或单元，而是可选地还包括没有列出的步骤或单元，或可选地还包括对于这些过程、方法、产品或设备固有的其它步骤或单元。
应当理解，在本申请说明书和附加的权利要求书中用到的单数形式的冠词“一”(对应于英文“a”、“an”和“the”)包括复数的对象，除非文中另外明确地规定。
本发明提供了一种基于HPLC/UPLC-QTOF-MS检测骨碎补中多成分的方法，包括如下步骤：
(1)取骨碎补样品制成骨碎补粉末，精密称定，然后与溶剂混合，称定重量，超声处理，摇匀，过滤，取续滤液后得到待测样品；
(2)用HPLC/UPLC分离步骤(1)中的待测样品，然后用质谱检测，得成分物质峰，用分析软件对所述成分物质峰进行定性分析。
本发明的“HPLC/UPLC-QTOF-MS”代表HPLC-QTOF-MS或UPLC-QTOF-MS。对于本发明而言，采用高效液相色谱(HPLC)和超高效液相色谱仪(UPLC)基本不影响色谱分离结果，两者均可以适用，分离得到的化合物数目不会改变，在本发明一个具体实施方式中，采用UPLC。
在一个实施方式中，骨碎补样品可以为骨碎补药材、骨碎补饮片或骨碎补配方颗粒。优选地，将步骤(1)中的骨碎补样品制成粉末之前，先将其烘干，比如可以采用烘箱烘干，烘干的温度优选为50～70℃，更优选为50～60℃，最优选60℃；对烘干的时间没有特殊限制，优选烘干至恒重。
在一项或多项优选的实施方案中，烘干后的骨碎补样品用打粉机打成粗粉，过二号筛。
在一项或多项优选的实施方案中，骨碎补粉末精密称定，置具塞锥形瓶中，然后与溶剂混合，所述溶剂为甲醇、乙醇、水、甲醇水溶液或乙醇水溶液，优选地所述溶剂选自25％～75％甲醇水溶液，前述百分比为体积百分比，根据骨碎补的化学成分的溶解性，最优选地，所述溶剂为50％甲醇水溶液。
在一项或多项优选的实施方案中，骨碎补粉末与溶剂的质量体积比为1g：80～150ml，优选地质量体积比为1g：110～130ml，更优选为1g：125ml以实现提取充分且满足检测的浓度要求。
在本发明中对超声的方法没有特别限制，采用本领域公知的超声手段即可。超声处理的时间为15～60min，进一步优选30～50min，综合考虑检验周期和提取充分等因素，优选40min；所述超声的功率为200～300W；所述超声的频率为30～50kHz，更优选为40KHz。
在一项或多项优选的实施方案中，所述方法还包括以下步骤，将骨碎补超声处理后，放冷，再称定重量，用步骤(1)中的溶剂补足减失的重量。比如用50％甲醇水溶液进行补足。
本发明所述的过滤没有特定的限定，可以是本领域任何常规的过滤手段，优选为膜过滤，更优选采用孔径为0.10～0.50μm的微孔滤膜，进一步优选为0.22μm的微孔滤膜。过滤之后取续滤液即为待测样品。
对于过滤得到的待测样品，本发明采用HPLC/UPLC分离所述待测样品，将分离后的成分用质谱检测，得到成分物质峰。随后用软件对所述成分物质峰进行定性分析。本发明中所述物质峰或所述成分物质峰是质谱能够检测到的峰。
在一项或多项优选的实施方案中，本发明的色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，具有优异的稳定性，适合分离酸性、中性、碱性化合物。色谱柱是C18系列的HPLC或UPLC都可以满足分析要求，不影响检测结果。针对Diamonsil C18(Dikma,250×4.6mm,5μm)、Megres C18(Hanbon,250mm×4.6mm,5μm)；Plasitil C18(Dikma，250×4.6mm,5μm)三种HPLC色谱柱，分离效果优选Megres C18，其对骨碎补化学成分的分离效果较好，保留时间适中。在一项或多项优选的实施方案中，从色谱峰分离效果考虑，洗脱系统流动相为：流动相A为甲醇，流动相B为甲酸-水，优选为0.1％甲酸-水。
在一项或多项优选的实施方案中，洗脱程序为下表所述(流动相的百分数表示体积百分数，流动相A和流动相B的体积百分数之和为100％)：
表1色谱洗脱梯度
时间(分钟) 流动相A(％) 流动相B(％)
0～5 10 90
5～15 10→20 90→80
15～27 20→25 80→75
27～35 25→35 75→65
35～50 35→45 65→55
50～55 45 55
。本发明的流速为0.5～5ml/min，从色谱峰分离效果考虑，本发明优选的流速为0.5～2.0ml/min，更优选流速为0.5～1.5ml/min。柱温为20～40℃，更进一步地，考虑到色谱柱的耐用性和分析所需时间，流速优选为1.0ml/min，柱温优选为30℃。
在一项或多项优选的实施方案中，本发明的进样体积为0.5～2μL，优选为1μL。检测波长为283nm，采用的检测器为二极管阵列检测器(又称DAD检测器)。
在一项或多项更优选的实施方案中，本发明步骤(2)中质谱检测的条件为：离子源为电喷雾离子源ESI，干燥气温度为200-400℃，优选为300℃，流量为1-20L/min，优选为8L/min，雾化器压力为10-100psi，优选为35psi；正离子模式下毛细管电压4000V，负离子模式下毛细管电压3500V，毛细管出口电压175V，锥孔电压65V；采用高分辨模式进行数据采集，质荷比采集范围m/z 100～2000，采样速度1spectra/s，采样时间1000ms/spectra；负离子采用TFANH4(112.985587)和HP-0921(1033.988109)进行质量数实时校准，正离子采用嘌呤(121.050873)和HP-0921(922.009798)进行质量数实时校准，雾化压力5psi。
在一项或多项更优选的实施方案中，所述的分析软件为Agilent MassHunterQualitative Analysis software，如Agilent MassHunter Qualitative Analysissoftware B.07.00或Agilent MassHunter Qualitative Analysis software B.08.00。
在一项或多项更优选的实施方案中，本发明的数据处理与分析包括：前期根据文献报道的有关骨碎补中的化学成分，数据检索主要通过中国知网、化学专业数据库、PubMed、STN on the web等数据库完成，建立各成分的信息数据库包括名称、分子式、精确质量数等，导入到数据分析软件Agilent MassHunter Qualitative Analysis softwareB.07.00或Agilent MassHunter Qualitative Analysis software B.08.00中，质量偏差均设定在10ppm以内，鉴定过程中一方面与自建的数据库匹配，另一方面结合同位素和高分辨质量数与相关的文献、在线Chemspider数据库查询，推测未在已有骨碎补数据库中的化学成分。
采用本发明的方法可以高效、快速、准确分离并鉴定出骨碎补药材中16种化学成分，包括黄酮类、有机酸类、原花青素类、苯丙素类等，为进一步研究骨碎补药效物质基础及全面质量控制提供了依据。
下面结合实施例对本发明提供的基于HPLC/UPLC-QTOF-MS检测骨碎补中多成分的方法进行详细的说明，但是不能把它们理解为本发明保护范围的限定。
实施例
实施例所用的仪器、材料和试药
仪器：Agilent1290超高压液相色谱仪(Agilent,USA)和Agilent Q/TOF-MS 6530质谱仪(Agilent,USA)。试药：甲醇(色谱纯，ThermoFisher公司)；水为屈臣氏蒸馏水；甲酸(分析纯，SIGMA公司)，骨碎补样品由天江研究院提供。
实施例1
1、制备待测样品
取骨碎补药材于60℃烘箱中烘干至恒重。利用打粉机打成粗粉，取骨碎补粗粉约0.2g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入50％甲醇水溶液25ml，密塞，称定重量。超声处理(功率250W，频率40kHz)40min，放冷。再称定重量，用50％甲醇水溶液补足减失的重量，摇匀，过0.22μm滤膜，取续滤液即得待测样品。
2、色谱条件
色谱柱：Hanbon Megres C18(柱长为250mm，内径为4.6mm，粒径为5μm)；以甲醇为流动相A，以0.1％甲酸-水为流动相B，柱温为30℃，流速为每分钟1.0ml。进样体积为1μL。检测波长为283nm，采用的检测器为DAD检测器。
梯度洗脱程序如表1所示。
3、质谱检测条件
离子源为双喷ESI离子源，干燥气温度300℃，流量8L/min，雾化器压力35psi；负离子模式下毛细管电压3500V，正离子模式下毛细管电压4000V，毛细管出口电压175V，锥孔电压65V；采用高分辨模式进行数据采集，质荷比采集范围m/z 100～2000，采样速度1spectra/s，采样时间1000ms/spectra；负离子采用TFANH4(112.985587)和HP-0921(1033.988109)进行质量数实时校准，正离子采用嘌呤(121.050873)和HP-0921(922.009798)进行质量数实时校准，雾化压力5psi。
4、数据处理与分析
前期根据文献报道的有关骨碎补中的化学成分，数据检索主要通过中国知网、化学专业数据库、PubMed、STN on the web等数据库完成，建立各成分的信息数据库包括名称、分子式、精确质量数等，导入到数据分析软件Agilent MassHunter QualitativeAnalysis software B.08.00中，质量偏差均设定在10ppm以内，鉴定过程中一方面与自建的数据库匹配，另一方面结合同位素和高分辨质量数与相关的文献、在线Chemspider数据库查询，推测未在已有骨碎补数据库中的化学成分。
5、实验结果
利用上述方法分析了骨碎补药材中16种化学成分组成，包括黄酮类、有机酸类、原花青素类、苯丙素类等，具体结果见表2。图1为实施例1待测样品的正、负离子模式下TIC(Total Ions Chromatograph)图，即总离子流色谱图，其中A为实施例1待测样品的正离子模式下TIC图，B为实施例1待测样品的负离子模式下TIC图。
结果显示，以奎宁酸为代表的有机酸类成分在负离子模式下响应大，易形成明显的[M-H]-的准分子离子峰，具体见图2。奎宁酸的结构式如下:
以新北美圣草苷、柚皮苷为代表的二氢黄酮苷类，正、负离子模式下均形成[M+H]+、[M-H]-峰，因结构中由黄酮苷元和一个糖部分组成，氧苷键易断裂，分别形成m/z 289[M+H-C6H10O4-C6H10O5]+、m/z273[M+H-C6H10O4-C6H10O5]+的苷元特征碎片峰，具体见图3、图4。新北美圣草苷的结构式如下：
柚皮苷的结构式如下：
Figure BDA0002202879310000113
表2基于UPLC-QTOF-MS技术分析骨碎补药材中化学成分
Figure BDA0002202879310000114
Figure BDA0002202879310000121
以上所述仅是本发明的优选实施方法，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应该视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种基于HPLC/UPLC-QTOF-MS检测骨碎补中多成分的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
(1)取骨碎补样品制成骨碎补粉末，精密称定，然后与溶剂混合，称定重量，超声处理，摇匀，过滤，取续滤液后得到待测样品；
(2)用HPLC/UPLC分离步骤(1)中的待测样品，然后用质谱检测，得成分物质峰，用分析软件对所述成分物质峰进行定性分析。
2.根据权利要求1所述的一种基于HPLC/UPLC-QTOF-MS检测骨碎补中多成分的方法，其特征在于，步骤(1)中的溶剂为甲醇、乙醇、水、甲醇水溶液或乙醇水溶液，优选地所述溶剂选自25％～75％甲醇水溶液，更优选为50％甲醇水溶液。
3.根据权利要求1或2所述的一种基于HPLC/UPLC-QTOF-MS检测骨碎补中多成分的方法，其特征在于，步骤(1)中骨碎补粉末与溶剂的质量体积比为1g：80～150ml，优选地质量体积比为1g：110～130ml。
4.根据权利要求1-3任一项所述的一种基于HPLC/UPLC-QTOF-MS检测骨碎补中多成分的方法，其特征在于，所述超声处理的时间为15～60min，进一步优选30～50min；所述超声的功率为200～300W；所述超声的频率为30～50kHz。
5.根据权利要求1-4任一项所述的一种基于HPLC/UPLC-QTOF-MS检测骨碎补中多成分的方法，其特征在于，所述方法还包括以下步骤，将骨碎补超声处理后，放冷，再称定重量，用步骤(1)中的溶剂补足减失的重量。
6.根据权利要求1-5任一项所述的一种基于HPLC/UPLC-QTOF-MS检测骨碎补中多成分的方法，其特征在于，所述过滤采用膜过滤，优选采用孔径为0.10～0.50μm的微孔滤膜。
7.根据权利要求1-6任一项所述的一种基于HPLC/UPLC-QTOF-MS检测骨碎补中多成分的方法，其特征在于，步骤(2)中的HPLC/UPLC的分离条件为：色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，优选色谱柱为Hanbon Megres C18，柱温为20～40℃，洗脱系统流动相为：流动相A为甲醇，流动相B为甲酸-水，流速为0.5～5ml/min，优选0.5～2.0ml/min。
8.根据权利要求7所述的一种基于HPLC/UPLC-QTOF-MS检测骨碎补中多成分的方法，其特征在于，洗脱程序为下表所述：
时间(分钟) 流动相A(％) 流动相B(％) 0～5 10 90 5～15 10→20 90→80 15～27 20→25 80→75 27～35 25→35 75→65 35～50 35→45 65→55 50～55 45 55
。
9.根据权利要求1-7任一项所述的一种基于HPLC/UPLC-QTOF-MS检测骨碎补中多成分的方法，其特征在于，步骤(2)中质谱检测的条件为：离子源为电喷雾离子源ESI，干燥气温度为200-400℃，流量为1-20L/min，雾化器压力为20-50psi。
10.采用权利要求1-9任一项所述的一种基于HPLC/UPLC-QTOF-MS检测骨碎补中多成分的方法用来分析骨碎补药材中16种化学成分的用途。
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