CN109115927A - 一种烫骨碎补与骨碎补制剂的质量检测及鉴别方法 - Google Patents
一种烫骨碎补与骨碎补制剂的质量检测及鉴别方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供了一种烫骨碎补与骨碎补制剂的质量检测及鉴别方法。本发明的一种烫骨碎补与骨碎补制剂的质量检测方法,运用HPLC指纹图谱,明确其化学成分在色谱图谱中的特征,利用烫骨碎补成分中具有5‑羟甲基糠醛,骨碎补成分中无此成分,有效区别骨碎补与烫骨碎补制剂,该方法准确度高,稳定性强,便于实际运用,具有良好的应用前景。
Description
技术领域
本发明具体涉及一种烫骨碎补与骨碎补制剂的质量检测及鉴别方法。
背景技术
骨碎补为常用中药,是水龙骨科(polypodiaceae)多年生蕨类植物。又名:破故纸,婆固脂,胡韭子。产于云南(西双版纳)、四川金沙江河谷。种子入药,有补肾壮阳、补脾健胃之功能。骨碎补主要含有黄酮类、三萜类、苯丙素类、酚酸、木脂素等,现代药理及临床研究表明,促增殖分化作用、抗骨质疏松作用、抗炎作用、促进骨折愈合、牙骨细胞保护作用、肾保护作用、防治药物中毒性耳聋、降血脂等作用。骨碎补化学类型多样,药理作用显著,具有广阔的研发前景。
烫骨碎补由骨碎补进一步加工制作而成,是取干燥后的净骨碎补,用砂石炒烫至鼓起,颜色呈深褐色,再撞去表面的鳞毛。其与普通骨碎补在功效上没有太大差异,只不过经过烫炙之后,去除了其寒气,更加适合寒凉体质者服用。
目前对骨碎补、烫骨碎补的研究多集中于其成分和炮制工艺,对两者的鉴定及区分还未有相关报道。而其中成分差异,使之适用人群不同,如果混淆两者会对用药者产生不利影响,因此对两者的鉴定及区分是有必要的。
发明内容
为解决上述问题,本发明提供了一种骨碎补与烫骨碎补制剂的质量检测方法,其特征在于:它是采用高效液相色谱法检测,其操作步骤如下:
1)参照物溶液的制备:取5-羟甲基糠醛、原儿茶酸、柚皮苷对照品加甲醇制成参照物溶液;
2)供试品溶液的制备:取待检样品,加50%甲醇提取,过滤,取滤液,即得供试品溶液;
3)吸取参照物溶液和供试品溶液,分别注入液相色谱仪,色谱条件如下:
色谱柱:以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂;流动相:以乙腈为流动相A,以0.08%甲酸溶液为流动相B梯度洗脱;梯度洗脱程序如下:
进一步地,步骤1)所述5-羟甲基糠醛、原儿茶酸、柚皮苷溶液浓度为每1ml含30μg、30μg、60μg的溶液。
进一步地,步骤2)所述待测样品为药材粉末、饮片粉末、提取物或颗粒剂中的一种或几种。
更进一步地,所述药材粉末、饮片粉末与50%甲醇的质量体积比为1g:100mL;所述提取物或颗粒剂与50%甲醇的质量体积比为1g:250mL。
进一步地,步骤2)所述提取为超声提取,提取功率600W,频率40kHz,时间30min。
进一步地,步骤3)所述参照物溶液和供试品溶液吸取量为10μl。
进一步地,步骤3)所述色谱条件为波长260nm,流速1.0ml/min,柱温40℃,理论板数按柚皮苷峰计算不低于3000;和/或,所述十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱为AgilentZORBAX SB-C18 250×4.6mm、phenomenex Luna 5μm C18(2)100A 4.6×250mm、AgilentZORAX Eclipse Plus C18 Analytical 4.6×250mm 5-Micron。
本发明还提供了一种骨碎补与烫骨碎补制剂的鉴别方法,其特征在于:它包括如下步骤:
(1)取待检骨碎补或烫骨碎补制剂;
(2)按前述高效液相色谱法检测;
(3)分析指纹图谱。
进一步地,所述指纹图谱为烫骨碎补应呈现8个特征峰,其中3个峰应分别与相应的参照物峰保留时间相同,与原儿茶酸参照物相应的峰为S1峰,与5-羟甲基糠醛参照物相应的峰为峰1,计算峰1-4与S1峰的相对保留时间,其相对保留时间应在规定值的±5%之内,相对保留时间分别为:0.793(峰1)、1.000(峰2,S1)、1.463(峰3)、1.514(峰4);与柚皮苷参照物相应的峰为S2峰,计算峰5-8与S2峰的相对保留时间,其相对保留之间规定值在±5%之内,相对保留时间分别为:0.577(峰5)、0.699(峰6)、0.876(峰7)、1.000(峰8,S2)。
更进一步地,所述指纹图谱缺5-羟甲基糠醛参照物相应峰,其余峰与烫骨碎补相同则为骨碎补。
本发明的一种烫骨碎补与骨碎补制剂的质量检测及鉴别方法,利用烫骨碎补成分中具有5-羟甲基糠醛,骨碎补成分中无此成分,有效区别骨碎补与烫骨碎补饮制剂。本发明适用于骨碎补与烫骨碎补不同制剂的鉴别,方法简单,便于实际运用,具有良好的应用前景。
显然,根据本发明的上述内容,按照本领域的普通技术知识和惯用手段,在不脱离本发明上述基本技术思想前提下,还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
以下通过实施例形式的具体实施方式,对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
附图说明
图1烫骨碎补配方颗粒特征图谱
图2骨碎补饮片、烫骨碎补饮片、骨碎补提取物、烫骨碎补提取物特征图谱对比图(S1(7):骨碎补饮片对照特征图谱,S2(7):骨碎补提取物对照特征图谱,S3(8):烫骨碎补饮片对照特征图谱,S4(8):烫骨碎补提取物对照特征图谱,S1(7)、S2(7):峰1,S1:原儿茶酸;峰7,S2:柚皮苷,S3(8)、S4(8):峰1:5-羟甲基糠醛;峰2,S1:原儿茶酸;峰8,S2:柚皮苷)
图3原儿茶酸紫外吸收光谱图
图4 5-羟甲基糠醛紫外吸收光谱图
图5柚皮苷紫外吸收光谱图
图6烫骨碎补配方颗粒3D色谱图
图7烫骨碎补配方颗粒不同波长色谱图
图8柱温考察色谱图
图9流速考察
图10提取溶剂考察
图11溶剂加入量考察
图12提取方法考察
图13提取时间考察
图14骨碎补对照药材、烫骨碎补饮片、烫骨碎补配方颗粒特征图谱对比图
图15不同仪器考察
图16不同色谱柱考察
图17烫骨碎补配方颗粒对照特征图谱
具体实施方式
实验仪器及材料
高效液相色谱仪:安捷伦1200型高效液相色谱仪、安捷伦1260型高效液相色谱仪、岛津LC-20AD型高效液相色谱仪;
电子天平:ME204E/02、MS205DU、XP26(梅特勒-托利多仪器有限公司);
超纯水机:细胞型1810A(上海摩勒科学仪器有限公司);
超声波清洗器:KQ5200DB型(600W,40KHz;昆山市超声仪器有限公司);
色谱柱:Agilent ZORBAX SB-C18 250×4.6mm、phenomenex Luna 5um C18(2)100A 4.6×250mm、Agilent ZORAX Eclipse Plus C18 Analytical 4.6*250mm 5-Micron。
柚皮苷(中国食品药品检定研究院,批号:110722-201714,含量以93.4%计),5-羟甲基糠醛(中国食品药品检定研究院,批号:111626-201509,含量以97.8%计),原儿茶酸(中国食品药品检定研究院,批号:110809-201205,含量以99.9%计)。
乙腈(SIGMA公司,色谱纯);甲酸(优级纯);水为超纯水,其它试剂均为分析纯。
烫骨碎补配方颗粒SY1806001、SY1806002、SY1806003。
骨碎补配方颗粒GSB180601、GSB180602、GSB180603
骨碎补饮片(XLS201805420、XLS201805421、XLS201805422、XLS201805423、XLS201805424、XLS201805425、XLS201805426、XLS201805427、XLS201805428、XLS201805429、XLS201806499、XLS201806500、XLS201806501、XLS201806551、XLS201806552、XLS201806553、XLS201806554、010172-1612001)
烫骨碎补饮片(TGSB180601、TGSB180602、TGSB180603、TGSB180604、TGSB180605、TGSB180606、TGSB180607、TGSB180608、TGSB180609、TGSB180610、TGSB180611、TGSB180612、TGSB180613、TGSB180616、TGSB180617、TGSB180618、TGSB180619、TGSB180620)
实施例1烫骨碎补配方颗粒鉴定
1)、参照物溶液的制备:取5-羟甲基糠醛、原儿茶酸、柚皮苷对照品,精密称定,加甲醇制成每1ml各含30μg、30μg、60μg的参照物溶液。
2)、供试品溶液的制备:取烫骨碎补配方颗粒,研细,各精密称定0.2g,置于具塞锥形瓶中,精密加入50%甲醇50ml,称定重量,超声处理(功率600W,频率40kHz)30分钟,放冷,再称定重量,用50%甲醇补足减失的重量,摇匀,滤过,取续滤液,即得供试品溶液。
3)、特征图谱的测定:分别精密吸取参照物溶液和供试品溶液各10μl,注入液相色谱仪,记录色谱图;
色谱条件如下:
检测波长:260nm;
色谱柱:C18色谱柱(柱长为250mm,内径为4.6mm,粒度为5μm);
流动相:乙腈(A)和0.08%甲酸溶液(B),梯度洗脱(0~7min,6%~6%A;7~12min,6%~11%A;12~14min,11%~11%A;14~45min,11%~27%A);
流速1.0ml/min;
柱温40℃;
4)分析指纹图谱:
烫骨碎补配方颗粒特征图谱见图1。图中呈现8个特征峰,其中3个峰分别与相应的参照物峰保留时间相同,与原儿茶酸参照物相应的峰为S1峰,与5-羟甲基糠醛参照物相应的峰为峰1,计算峰1-4与S1峰的相对保留时间(见表1),其相对保留时间在规定值的±5%之内,规定值为0.793(峰1)、1.000(峰2,S1)、1.463(峰3)、1.514(峰4);与柚皮苷参照物相应的峰为S2峰,计算峰5-8与S2峰的相对保留时间(见表1),其相对保留时间规定值在±5%之内,规定值为0.577(峰5)、0.699(峰6)、0.876(峰7)、1.000(峰8,S2)。
表1烫骨碎补配方颗粒相对保留时间
实施例2骨碎补与烫骨碎补鉴别
1)参照物溶液的制备:取5-羟甲基糠醛、原儿茶酸、柚皮苷对照品适量,精密称定,加甲醇制成每1ml各含30μg、30μg、60μg的溶液,即得。
2)供试品溶液的制备:取骨碎补饮片粗粉、烫骨碎补饮片粗粉各0.5g,骨碎补提取物、烫骨碎补提取物各0.2g,精密称定,置不同具塞锥形瓶中,分别精密加入50%甲醇50ml,密塞,称定重量,超声处理(功率600W,频率40kHz)30分钟,放冷,再称定重量,用50%甲醇补足减失的重量,摇匀,滤过,取续滤液,即得。
3)特征图谱的测定:分别精密吸取参照物溶液和供试品溶液各10μl,注入液相色谱仪,记录色谱图;
色谱条件如下:
检测波长:260nm;
色谱柱:C18色谱柱(柱长为250mm,内径为4.6mm,粒度为5μm);
流动相:乙腈(A)和0.08%甲酸溶液(B),梯度洗脱(0~7min,6%~6%A;7~12min,6%~11%A;12~14min,11%~11%A;14~45min,11%~27%A);
流速1.0ml/min;
柱温40℃;
4)分析指纹图谱:
骨碎补饮片、烫骨碎补饮片、骨碎补提取物、烫骨碎补提取物特征图谱对比图见图2。从图中可见:骨碎补饮片及骨碎补提取物特征图谱具有一致性,烫骨碎补饮片及烫骨碎补提取物特征图谱具有一致性。烫骨碎补特征图谱中具有5-羟甲基糠醛相应峰,骨碎补特征图谱中无此成分相应峰,因此从中能有效区别骨碎补与烫骨碎补饮片及提取物。
以下通过试验例具体说明本发明的有益效果:
试验例1液相特征图谱方法学
1、色谱条件
色谱条件与系统适用性试验:以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(柱长为250mm,内径为4.6mm,粒度为5μm),以乙腈为流动相A,以0.08%甲酸溶液为流动相B,按表2中的规定进行梯度洗脱;柱温为40℃;流速为每分钟1.0ml;检测波长:260nm。理论板数按柚皮苷峰计算应不低于3000。
表2流动相梯度洗脱比例
1.1波长选择
在以上拟定的实验条件基础上,利用二极管阵列检测器分别对5-羟甲基糠醛、原儿茶酸、柚皮苷、供试品溶液进行全波段扫描,并分别提取供试品溶液在230nm、240nm、250nm、260nm、270nm、280nm、300nm、310nm、320nm、330nm、340nm波长下的色谱图。见图3-7。
结果表明,在检测波长为260nm时色谱峰信息量较大,色谱图基线更平稳,故检测波长确定为260nm。
1.2柱温考察
在以上拟定的实验条件基础上,分别对柱温为20℃、30℃、40℃时进行考察。见图8。
柱温考察结果表明,当柱温为20℃和30℃时,峰3和峰4不能分离,当柱温为40℃时,色谱图峰形均较为对称,分离度均好,故最终确定40℃作为烫骨碎补配方颗粒特征图谱方法的柱温。
1.3流速考察
在以上拟定的实验条件基础上,分别对流速为0.8ml/min、1ml/min、1.2ml/min时进行了考察。见图9,表3。
表3流速考察—特征峰相对保留时间
结果表明,流速分别为0.8ml/min、1.0ml/min、1.2ml/min时,各特征峰的相对保留时间RSD为0.57%~21.99%,在流速为1.0ml/min时,色谱图峰形较好,分离度适中。故流速确定为1.0ml/min。
2参照物溶液的制备
取5-羟甲基糠醛、原儿茶酸、柚皮苷对照品适量,精密称定,加甲醇制成每1ml各含30μg、30μg、60μg的溶液,即得。
3供试品溶液的制备
3.1提取溶剂考察
取烫骨碎补配方颗粒(批号1710008)研细,精密称定0.2g,置具塞锥形瓶中,分别以甲醇、50%甲醇、80%甲醇、水、50%乙醇、乙醇50ml作为供试品溶剂进行考察,密塞,称定重量,超声处理(功率600W,频率40kHz)20分钟,放冷,再称定重量,用提取溶剂补足减失的重量,摇匀,滤过,取续滤液,即得。见图10。
结果表明,提取溶剂中50%甲醇作为提取溶剂时色谱峰信息量大,故供试品提取溶剂确定为50%甲醇。
3.2溶剂加入量考察
取烫骨碎补配方颗粒(批号1710008)研细,精密称定0.2g,置具塞锥形瓶中,分别精密加入50%甲醇25ml、50ml、100ml,密塞,称定重量,超声处理(功率600W,频率40kHz)20min,放冷,再称定重量,用50%甲醇补足减失的重量,摇匀,滤过,取续滤液,即得。见图11。
结果表明,在溶剂加入量为50ml时,特征图谱色谱峰面积适中。故供试品溶剂加入量确定为50ml。
3.3提取方式考察
取烫骨碎补配方颗粒(批号:1710008)研细,精密称定0.2g,置具塞锥形瓶中,精密加入50%甲醇50ml,密塞,称定重量,分别对供试品采用回流、超声的提取方式进行考察,提取时间20min,放冷,再称定重量,用50%甲醇补足减失的重量,摇匀,滤过,取续滤液,即得。见图12。
结果表明,对供试品分别进行超声提取与回流提取时效果一致。因超声提取操作更为简便,故供试品提取方法确定为超声提取。
3.4提取时间考察
取烫骨碎补配方颗粒(批号1710008)研细,精密称定0.2g,置具塞锥形瓶中,精密加入50%甲醇50ml,密塞,称定重量,超声处理(功率600W,频率40kHz),分别对供试品提取时间为10分钟、20分钟、30分钟时进行考察,放冷,再称定重量,用50%甲醇补足减失的重量,摇匀,滤过,取续滤液,即得。见图13。
结果表明,在提取时间为20分钟时,即可充分提取。故供试品提取时间确定为20分钟。
3.5最终确定供试品制备方法:取本品颗粒约0.2g,精密称定,置具塞锥形瓶中,精密加入50%甲醇50ml,称定重量,超声20分钟,放冷,再称定重量,用50%甲醇补足减失的重量,摇匀,滤过,取续滤液,即得。
试验例2液相特征图谱方法学考察
1色谱峰指认
参照物溶液的制备:取5-羟甲基糠醛、原儿茶酸、柚皮苷对照品,精密称定,加甲醇制成每1ml各含30μg、30μg、60μg的溶液,即得。
骨碎补对照药材溶液的制备:取骨碎补对照药材粗粉约0.5g,精密称定,置具塞锥形瓶中,精密加入50%甲醇50ml,密塞,称定重量,超声处理(功率600W,频率40kHz)30分钟,放冷,再称定重量,用50%甲醇补足减失的重量,摇匀,滤过,取续滤液,即得。
烫骨碎补饮片溶液的制备:取烫骨碎补饮片粗粉约0.5g,精密称定,置具塞锥形瓶中,精密加入50%甲醇50ml,密塞,称定重量,超声处理(功率600W,频率40kHz)30分钟,放冷,再称定重量,用50%甲醇补足减失的重量,摇匀,滤过,取续滤液,即得。
烫骨碎补配方颗粒溶液的制备:取烫骨碎补配方颗粒精密称定0.2g,置于具塞锥形瓶中,精密加入50%甲醇50ml,称定重量,超声处理(功率600W,频率40kHz)30分钟,放冷,再称定重量,用50%甲醇补足减失的重量,摇匀,滤过,取续滤液,即得。
阴性对照溶液的制备:精密量取50%甲醇50ml,置于具塞锥形瓶中,密塞,称定重量,超声处理(功率600W,频率40kHz)30分钟,放冷,再称定重量,用50%甲醇补足减失的重量,摇匀,滤过,取续滤液,即得。
按拟定实验方法进行测定,对烫骨碎补配方颗粒特征图谱峰进行定位。见图14。由专属性结果可知,骨碎补对照药材与烫骨碎补配方颗粒特征图谱之间存在差异。骨碎补对照药材色谱图显示缺少5-羟甲基糠醛参照物相应峰,故选择烫骨碎补饮片作为烫骨碎补配方颗粒的对照饮片。
2、精密度试验
取烫骨碎补配方颗粒(批号:1710008)供试品溶液,按拟定实验方法连续进样6次,每次10μl,计算各特征峰的相对保留时间及相对峰面积。见表4-5。
表4精密度考察-保留时间
表5精密度考察-峰面积
结果表明,该仪器精密度良好。
3、重复性考察
精密称取烫骨碎补配方颗粒(批号:1710008)6份,按拟定实验方法进行制备及测定。见表6-7。
表6重复性考察-相对保留时间比值
表7重复性考察-相对峰面积比值
结果表明,该方法重复性好。
4、中间精密度考察
4.1不同仪器考察
在以上拟定的实验条件基础上,分别精密称取烫骨碎补配方颗粒(批号:1710008)两份,制备供试品溶液,分别在安捷伦1200、岛津LC-20AD、安捷伦1260型高效液相色谱仪上进行测定。见图15、表8-9。
表8仪器耐用性考察-相对保留时间比值
表9仪器耐用性考察-相对峰面积比值
结果表明,用上述3种仪器对供试品进行检测时,各特征峰相对保留时间的RSD范围为0.37%-6.98%。
4.2不同人员和时间考察
在以上拟定的实验条件基础上,由不同人员(A、B)在不同时间(T1、T2)分别精密称取烫骨碎补配方颗粒(批号:1801032)各两份,制备供试品,进行测定。见表10-11。
表10人员和时间考察-相对保留时间比值
表11人员和时间考察-相对峰面积比值
结果表明,由不同的人员在不同的时间对同一个样品进行测定,方法稳定性较好。
5耐用性考察
5.1色谱柱耐用性考察
在以上拟定的实验条件基础上,分别对色谱柱为Agilent ZORBAX SB-C18、phenomenex Luna 5um C18(2)100A、Agilent ZORAX Eclipse Plus C18 Analytical。进行考察。见图16,表12、13。
表12色谱柱耐用性考察-相对保留时间比值
表13色谱柱耐用性考察-相对峰面积比值
结果表明,用上述3种色谱柱对样品进行检测,特征峰相对保留时间的RSD在0.13%~11.35%,特征峰相对峰面积的RSD在0.51%~6.53%。
5.2稳定性
在以上拟定的实验条件基础上,取同一供试品溶液,分别于0h,3h,6h,9h,12h,24h时测定。见表14-15。
表14稳定性考察-保留时间
表15稳定性考察-峰面积
结果表明,其相对应的特征峰保留时间的RSD在0.09%~1.28%,样品溶液在24小时内较稳定。
6方法学小结
选择峰8为S峰时,各阶段的RSD见表16。选择峰2为S峰时,各阶段的RSD见表17。
表16峰8为S峰时,RSD值
表17峰2为S峰时,RSD值
综上所述,峰1-4选择峰2作为S峰时,耐用性均满足±5%的要求;峰5-8选择峰8作为S峰时,耐用性均满足±5%的要求,因此选择峰2作为S1,峰8作为S2峰。
试验例3特征峰的确定及对照图谱的建立
1、烫骨碎补配方颗粒特征图谱验证
采用拟定的方法对3批烫骨碎补配方颗粒进行特征图谱的测定,计算相对保留时间、相对峰面积。特征图谱及相对保留时间结果同实验例1中图1及表1,相对峰面积见表18。
表18 3批烫骨碎补配方颗粒相对峰面积
根据相对保留时间稳定及各批次样品均能检出且峰相对较高的原则,共选择了8个重复性较好的峰作为特征峰。结果表明,当峰4作为S峰时,3批次烫骨碎补配方颗粒特征峰相对保留时间RSD在0.01%~0.08%,3批次烫骨碎补配方颗粒8个特征峰相对保留时间RSD均小于3%。
2相对保留时间规定值限度的制定
汇总方法学各考察项目及验证结果,见表19。
表19方法学各项目结果RSD%汇总标准—相对保留时间
根据汇总结果,将各峰的相对保留时间规定值暂定为5%。
最终规定:烫骨碎补供试品特征图谱中应呈现8个特征峰,其中3个峰应分别与相应的参照物峰保留时间相同,与原儿茶酸参照物相应的峰为S1峰,计算峰1-4与S1峰的相对保留时间,其相对保留时间应在规定值的±5%之内,规定值为0.793(峰1)、1.000(峰2,S1)、1.463(峰3)、1.514(峰4);与柚皮苷参照物相应的峰为S2峰,计算峰5-8与S2峰的相对保留时间,其相对保留之间规定值在±5%之内,规定值为0.577(峰5)、0.699(峰6)、0.876(峰7)、1.000(峰8,S2)。
采用中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012版)对3批烫骨碎补配方颗粒进行合成,建立了烫骨碎补配方颗粒特征图谱的对照图谱。见图17。
通过高效液相色谱条件的筛选及方法学的验证,确定了骨碎补饮片及骨碎补提取物具有相同物质基础;烫骨碎补饮片及烫骨碎补提取物具有相同物质基础。骨碎补饮片、提取物与烫骨碎补饮片及提取物具有差异,烫骨碎补成分中具有5-羟甲基糠醛,骨碎补成分中无此成分,该检测方法能有效区别骨碎补饮片与烫骨碎补饮片,骨碎补提取物及烫骨碎补提取物。
Claims (10)
1.一种骨碎补与烫骨碎补制剂的质量检测方法,其特征在于:它是采用高效液相色谱法检测,其操作步骤如下:
1)参照物溶液的制备:取5-羟甲基糠醛、原儿茶酸、柚皮苷对照品加甲醇制成参照物溶液;
2)供试品溶液的制备:取待检样品,加50%甲醇提取,过滤,取滤液,即得供试品溶液;
3)吸取参照物溶液和供试品溶液,分别注入液相色谱仪,色谱条件如下:
色谱柱:以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂;流动相:以乙腈为流动相A,以0.08%甲酸溶液为流动相B梯度洗脱;梯度洗脱程序如下:
2.根据权利要求1所述的检测方法,其特征在于:步骤1)所述5-羟甲基糠醛、原儿茶酸、柚皮苷溶液浓度为每1ml含30μg、30μg、60μg的溶液。
3.根据权利要求1所述的检测方法,其特征在于:步骤2)所述待测样品为药材粉末、饮片粉末、提取物或颗粒剂中的一种或几种。
4.根据权利要求3所述的检测方法,其特征在于:所述药材粉末、饮片粉末与50%甲醇的质量体积比为1g:100mL;所述提取物或颗粒剂与50%甲醇的质量体积比为1g:250mL。
5.根据权利要求1所述的检测方法,其特征在于:步骤2)所述提取为超声提取,提取功率600W,频率40kHz,时间30min。
6.根据权利要求1所述的检测方法,其特征在于:步骤3)所述参照物溶液和供试品溶液吸取量为10μl。
7.根据权利要求1所述的检测方法,其特征在于:步骤3)所述色谱条件为波长260nm,流速1.0ml/min,柱温40℃,理论板数按柚皮苷峰计算不低于3000;和/或,所述十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱为Agilent ZORBAX SB-C18 250×4.6mm、phenomenex Luna 5μm C18(2)100A 4.6×250mm、Agilent ZORAX Eclipse Plus C18 Analytical 4.6×250mm 5-Micron。
8.一种骨碎补与烫骨碎补制剂的鉴别方法,其特征在于:它包括如下步骤:
(1)取待检骨碎补或烫骨碎补制剂;
(2)按权利要求1-7项所述的高效液相色谱法检测;
(3)分析指纹图谱。
9.根据权利要求8所述的鉴别方法,其特征在于:所述指纹图谱为烫骨碎补应呈现8个特征峰,其中3个峰应分别与相应的参照物峰保留时间相同,与原儿茶酸参照物相应的峰为S1峰,与5-羟甲基糠醛参照物相应的峰为峰1,计算峰1-4与S1峰的相对保留时间,其相对保留时间应在规定值的±5%之内,相对保留时间分别为:0.793(峰1)、1.000(峰2,S1)、1.463(峰3)、1.514(峰4);与柚皮苷参照物相应的峰为S2峰,计算峰5-8与S2峰的相对保留时间,其相对保留之间规定值在±5%之内,相对保留时间分别为:0.577(峰5)、0.699(峰6)、0.876(峰7)、1.000(峰8,S2)。
10.根据权利要求9所述的鉴别方法,其特征在于,所述指纹图谱缺5-羟甲基糠醛参照物相应峰,其余峰与烫骨碎补相同则为骨碎补。
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