CN105301138B - 一种藏茵陈的检测方法及其hplc指纹图谱 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种藏茵陈的检测方法及其HPLC指纹图谱。本发明通过增加齐墩果酸薄层鉴别、獐牙菜苦苷含量测定及HPLC指纹图谱检测和该方法所得的指纹图谱峰，能较全面地检测藏茵陈中所含化学成分的种类与数量，进而对药材质量进行整体描述和评价，保证了药材的安全，有效，质量可控。
Description
技术领域
本发明涉及一种藏茵陈的检测方法及其HPLC指纹图谱，属于医药技术领域。
背景技术
藏茵陈是藏药八珍之一，藏药名蒂达，原植物是龙胆科川西獐牙菜Swertiamussotii Franch.，始载于藏医药书《四部医典》，有清热、解毒，清肝利胆的功效，是藏药中最具特色的治疗肝胆系统疾病的良药，药效独特，临床上用于治疗消化不良、胆囊炎、各型肝炎等症的治疗。藏茵陈药材现阶段并没有统一标准，仅有川西獐牙菜及印度獐牙菜的部颁标准，且几乎无控制意义；以藏茵陈为原料的单方制剂有藏茵陈片、藏茵陈胶囊、藏茵陈颗粒、藏茵陈滴丸、藏茵陈软胶囊及复方制剂八味藏茵陈散、二十六味藏茵陈丸、十三味藏茵陈散、五味獐牙菜汤散、八味獐牙菜丸、九味獐牙菜丸、二十五味獐牙菜丸等，上述制剂标准水平较低，鉴别方法单一，含量测定项为薄层扫描法，无法全面控制藏茵陈药材的质量。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明提供了一种藏茵陈的检测方法及其HPLC指纹图谱。
发明概述
本发明通过增加齐墩果酸鉴别、獐牙菜苦苷含量测定及HPLC指纹图谱检测，能较全面地反映藏茵陈中所含化学成分的种类与数量，进而对药材质量进行整体描述和评价，保证了药材的安全，有效，质量可控。
本发明的技术方案如下：
一种藏茵陈的检测方法，包括如下鉴别法、獐牙菜苦苷含量测定法、HPLC指纹图谱检测法中的一种或几种：
A、鉴别法
取藏茵陈药材粉末0.5﹣2g，加乙酸乙酯10ml，超声处理30分钟，滤过，滤液作为供试品溶液；另取齐墩果酸对照品适量，加甲醇或乙醇制成每1ml含1mg的溶液，作为对照品溶液；照薄层色谱法试验，吸取上述两种溶液各5﹣10μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以体积比4﹣6:1﹣3的正己烷﹣乙酸乙酯为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10％硫酸乙醇溶液，加热至斑点显色清晰，在紫外光灯365nm下检视；供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。
B、獐牙菜苦苷含量测定法
色谱条件与系统适用性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；流动相组成为体积比8﹣12：91﹣87：1的乙腈﹣水﹣异丙醇，并用酸调节pH为4.5；检测波长为254nm，理论塔板数以獐牙菜苦苷计不低于2000；
对照品溶液的制备：取獐牙菜苦苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含0.15mg的溶液，即得；
供试品溶液的制备：取藏茵陈药材粉末0.5﹣2g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50mL，称定重量，超声提取30分钟，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得供试品溶液；
测定法：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各5﹣10μl，注入液相色谱仪，测定，即得。
C、HPLC指纹图谱检测法
色谱条件与系统适用性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈﹣水为流动相，梯度洗脱，乙腈体积比例变化为：0﹣15分钟由4％升至20％，15﹣40分钟由20％升至45％，40﹣50分钟由45％升至90％，50﹣60分钟保持90％；检测波长为220nm；流速：0.8﹣1.2ml/min；分析时间：60分钟；
对照品溶液的制备：取獐牙菜苦苷对照品适量，加甲醇制成每1ml含獐牙菜苦苷0.15mg的溶液，即得；
供试品溶液的制备：取藏茵陈粉末0.5﹣2g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50ml，密塞，称定重量，超声处理30分钟，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得；
测定：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各5﹣10μl，注入高效液相色谱仪，记录60分钟内的色谱图，即得藏茵陈的HPLC指纹图谱。
优选的，上述鉴别法为
取藏茵陈药材粉末1g，加乙酸乙酯10ml，超声处理30分钟，滤过，滤液作为供试品溶液；另取齐墩果酸对照品适量，加甲醇制成每1ml含1mg的溶液，作为对照品溶液；照薄层色谱法试验，吸取上述两种溶液各10μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以体积比5:2的正己烷﹣乙酸乙酯为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10％硫酸乙醇溶液，加热至斑点显色清晰，在紫外光灯365nm下检视；供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。
优选的，上述獐牙菜苦苷含量测定法为
色谱条件与系统适用性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；流动相为体积比10：89：1的乙腈-水-异丙醇，并用冰醋酸调节pH值为4.5；检测波长为254nm；理论塔板数以獐牙菜苦苷计不低于2000；
对照品溶液的制备：取獐牙菜苦苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含0.15mg的溶液，即得；
供试品溶液的制备：取藏茵陈药材粉末1g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50mL，称定重量，超声提取30分钟，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得供试品溶液；
测定：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得。
优选的，上述HPLC指纹图谱法为
色谱条件与系统适用性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈﹣水为流动相，梯度洗脱，乙腈体积浓度变化为：0﹣15分钟由4％升至20％，15﹣40分钟由20％升至45％，40﹣50分钟由45％升至90％，50﹣60分钟保持90％；检测波长为220nm；流速：0.8﹣1.2ml/min；分析时间：60分钟；
对照品溶液的制备：取獐牙菜苦苷对照品适量，加甲醇制成每1ml含獐牙菜苦苷0.15mg的溶液，即得；
供试品溶液的制备：取藏茵陈粉末1g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50ml，密塞，称定重量，超声处理30分钟，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得；
测定：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入高效液相色谱仪，记录60分钟内的色谱图，即得藏茵陈的HPLC指纹图谱。
根据上述HPLC指纹图谱检测法所得的藏茵陈HPLC指纹图谱，特征峰为10个，其中2号峰獐牙菜苦苷为标准峰，10个峰与标准峰相比，相对保留时间分别为0.265﹣0.293、1.000、1.147﹣1.268、1.744﹣1.928、1.847﹣2.041、2.836﹣3.135、3.184﹣3.520、3.482﹣3.848、3.914﹣4.326、3.938﹣4.353。
优选的，上述HPLC指纹图谱检测法所得的藏茵陈HPLC指纹图谱，10个峰与标准峰相比，相对保留时间分别为0.279、1.000、1.207、1.836、1.944、2.986、3.352、3.665、4.120、4.145。
本说明书中所述的重量份与体积份的单位对应关系为g/ml或Kg/L。
附图说明
图1:藏茵陈TLC鉴别图谱的示意图；
图2:獐牙菜苦苷含量测定样品HPLC图谱；
图3:獐牙菜苦苷含量测定对照品HPLC图谱；
图4:实验例3中流动相③所得藏茵陈HPLC图谱；
图5:本发明藏茵陈HPLC标准指纹图谱；
图6:本发明藏茵陈HPLC标准指纹图谱参照物獐牙菜苦苷图谱；
图1的具体解释，1为齐墩果酸对照品，2-4分别为样品20150801、20150802和20150803；
图2-图6的具体解释，横坐标单位为时间：分钟，纵坐标单位为mAu。
基本实施方式
下述实验例和实施例用于进一步说明但不限于本发明。
实验例1：鉴别法
取藏茵陈药材粉末1g，加乙酸乙酯10ml，超声处理30分钟，滤过，滤液作为供试品溶液；另取齐墩果酸对照品适量，加乙醇制成每1ml含1mg的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法试验，吸取上述两种溶液各10μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，分别以环己烷-氯仿-醋酸乙酯-甲酸(20∶5∶8∶0.1)、甲苯-醋酸乙酯-冰醋酸(12:4:0.5)、三氯甲烷-醋酸乙酯-甲酸(6：4：1)、三氯甲烷-甲醇(40：1)、正己烷-乙酸乙酯(4:1)、正己烷-乙酸乙酯(5:2)、正己烷-乙酸乙酯(6:3)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10％硫酸乙醇溶液，加热至斑点显色清晰，在紫外光灯365nm下检视。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。
结果分析：以环己烷-氯仿-醋酸乙酯-甲酸(20∶5∶8∶0.1)、甲苯-醋酸乙酯-冰醋酸(12:4:0.5)、三氯甲烷-醋酸乙酯-甲酸(6：4：1)、三氯甲烷-甲醇(40：1)为展开剂展开，虽能够达到鉴别的目的，但斑点分离较差，且展开剂配制复杂，均含有易制毒试剂，因此本方法发明了以正己烷-乙酸乙酯(4﹣6:1﹣3)为展开剂，药材斑点Rf值在0.4﹣0.7之间，且分离良好，显色清晰，因此，在体积份数比为4﹣6:1﹣3的正己烷-乙酸乙酯展开剂条件下，有较好的展开效果。其中，体积份数比5：2的正己烷-乙酸乙酯的展开剂展开效果最好。结果见图1。
实验例2：獐牙菜苦苷含量测定
1.仪器、试药和供试样品
仪器：高效液相色谱仪：Agilent 1260
电子天平：岛津AUW220D型
紫外分光光度计：岛津UV﹣2450
对照品：獐牙菜苦苷对照品(中国食品药品检定研究院)，批号：110785-201404
样品：藏茵陈(金诃藏药股份有限公司提供)，批号分别为：20150801、20150802、20150803
2.检测波长选择
取獐牙菜苦苷对照品溶液，于190-600nm波长范围内进行扫描，根据紫外吸收图谱，选定254nm为检测波长。
3.流动相选择
对于獐牙菜苦苷的HPLC测定，以甲醇-水或甲醇-0.02％磷酸为流动相最常用。本发明实验发现，上述流动相对于藏茵陈中獐牙菜苦苷的分离度较差，无法满足分离要求，调节比例虽能达到分离目的，但峰形及理论塔板数均不理想，不能满足测定需要。进一步研究发现，将甲醇改用乙腈替代，并在此基础上，加入1％异丙醇后，效果得到改善，藏茵陈杂质与主峰分离效果好，同时峰形较好，满足测定需要，结果见图2、图3。
4.系统适用性试验
在上述色谱条件下，分别精密吸取对照品溶液、供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，记录色谱图。结果表明，供试品色谱中獐牙菜苦苷与其相邻色谱峰的分离度均大于1.5。
5.对照品溶液制备
取獐牙菜苦苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含獐牙菜苦苷0.15mg的溶液，即得；
6.供试品溶液制备
取藏茵陈药材粉末1g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50mL，称定重量，超声提取30分钟，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得供试品溶液。
7.标准曲线的制备和线性关系的考察
精密量取獐牙菜苦苷对照品贮备液溶液(獐牙菜苦苷含量为0.2562mg/ml)1ml、3ml、5ml、8ml、10ml，分别置10ml容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，各精密进样10μl，以峰面积(A)对对照品浓度(C)进行线性回归，得獐牙菜苦苷回归方程：A＝8.1576C+0.1248，相关系数：R＝0.9999。结果表明：獐牙菜苦苷在25.62μg/ml～256.20μg/ml范围内，槲皮素色谱峰的峰面积(A)与对照品浓度(C)线性关系良好。结果见表1。
表1獐牙菜苦苷线性关系考察结果
8.精密度试验
精密吸取獐牙菜苦苷对照品溶液10μl，注入液相色谱仪，各连续测定6次，记录峰面积并计算相对标准偏差。结果表明，仪器精密度良好。结果见表2。
表2獐牙菜苦苷精密度试验考察结果
9.稳定性试验
供试品溶液制备完成后，精密吸取10μl，分别在0、2、4、6、8小时注入液相色谱仪，记录峰面积并计算峰面积的相对标准偏差。结果表明：供试品溶液中槲皮素在8小时内测定结果稳定。结果见表3。
表3獐牙菜苦苷稳定性试验考察结果
10.重复性试验
取同一批藏茵陈(批号：20150801)6份，按照供试品的制备方法制备供试品溶液，精密吸取10μl，注入液相色谱仪进行测定，计算样品中獐牙菜苦苷的含量及其相对标准偏差。结果表明：分析方法重复性良好。结果见表4。
表4獐牙菜苦苷重复性试验考察结果
11.回收率试验
精密称取已知含量的同一批藏茵陈6份(批号：20150801)，精密加入獐牙菜苦苷对照品，测定其含量，计算回收率及其相对标准偏差。结果表明：该测定方法测定结果准确。结果见表5。
表5獐牙菜苦苷回收率试验考察结果
12.样品测定
取藏茵陈三批，按上述含量测定方法对含量进行测定。结果见表6。
表6含量测定结果
实验例3：HPLC指纹图谱的获得
2.1实验仪器及试剂
试验仪器：高效液相色谱仪：Agilent 1260
电子天平：岛津AUW﹣220D
紫外分光光度计：岛津UV﹣2450
对照品：獐牙菜苦苷对照品(中国食品药品检定研究院)，批号：110785-201404
供试品：藏茵陈(金诃藏药股份有限公司提供)，批号：20150801、20150802、20150803、20150804、20150805、20150806、20150807、20150808、20150809、20150810
2.2色谱条件与系统适用性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈(A)﹣水(B)为流动相，梯度洗脱：0﹣15分钟乙腈由4％升至20％，15﹣40分钟乙腈由20％升至45％，40﹣50分钟乙腈由45％升至90％，50﹣60分钟乙腈保持90％；检测波长为220nm；流速：1.0ml/min；分析时间：60分钟。
对照品溶液的制备：取獐牙菜苦苷对照品适量，加甲醇制成每1ml含獐牙菜苦苷0.15mg的溶液，即得；
供试品溶液的制备：取藏茵陈粉末1g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50ml，密塞，称定重量，超声处理30分钟，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
2.3检测波长选择：按供试品溶液的制备方法得到供试品溶液，190﹣600nm波长范围内进行扫描，根据紫外吸收图谱，选定220nm为检测波长。
2.4流动相选择：按供试品溶液的制备方法得到供试品溶液，分别采用下列流动相进行实验。
流动相①：以乙腈-0.1％磷酸溶液为流动相进行梯度洗脱，梯度为0-5min，乙腈5％；5-10min，乙腈5％-13％；10-40min，乙腈13％-30％；40-45min，乙腈30％-55％；45-70min，乙腈55％-40％；
流动相②：以甲醇-0.02％磷酸溶液为流动相进行梯度洗脱，梯度为0-15min，甲醇保持32％；15-40min，甲醇32％-70％；40-42min，甲醇70％-95％；42-50min，甲醇保持95％；50-52min，甲醇95％-32％；52-60min，甲醇保持32％；
流动相③：以乙腈(A)﹣水(B)为流动相，梯度洗脱：0﹣15分钟乙腈由4％升至20％，15﹣40分钟乙腈由20％升至45％，40﹣50分钟乙腈由45％升至90％，50﹣60分钟乙腈保持90％；
结果分析：藏茵陈药材中含齐墩果酸及熊果酸成分，对其进行定位，流动相1及流动相2在梯度洗脱时间内齐墩果酸及熊果酸均未出峰，不能全面的反映药材的质量；本发明方法保证了样品中包含所有色谱峰，其中9号峰为齐墩果酸峰，10号峰为熊果酸峰，能够全面的反映药材的质量，且色谱峰分离良好，故本发明方法较现有技术有较大的有益效果。结果见图3-图6。
2.5高效液相色谱法测定标准指纹图谱：取10批藏茵陈按供试品溶液的制备方法得到供试品溶液，按上述色谱条件获得10批藏茵陈制剂的高效液相色谱图，以这10批藏茵陈制剂指纹图谱为基础，采用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004A》进行评价，在220nm检测波长下的相似度大于0.85的图谱。
实验例4：指纹图谱检测方法的方法学考察
3.1精密度试验
取批号为20150801批藏茵陈样品，按上述供试品溶液的制备方法得到的供试品溶液一份，在上述色谱条件下连续进样5次测定，结果表明：本发明提供的指纹图谱检测方法精密度良好。测定结果见表1。
表1藏茵陈HPLC指纹图谱精密度考察结果(相对保留时间)
3.2重复性试验
取批号为20150801批藏茵陈样品，按上述供试品溶液的制备方法得到的供试品溶液六份，在上述色谱条件下进样测定，结果表明：本发明提供的指纹图谱检测方法重复性良好。测定结果见表2。
表2藏茵陈HPLC指纹图谱重复性考察结果(相对保留时间)
3.3稳定性试验
取批号为20150801批藏茵陈样品，按上述供试品溶液的制备方法得到的供试品溶液一份，在上述色谱条件下分别在0小时、2小时、4小时、6小时、8小时进样测定，结果表明：本发明提供的指纹图谱检测方法稳定性良好。测定结果见表3。
表3藏茵陈HPLC指纹图谱稳定性考察结果(相对保留时间)
下面结合实施例对本发明作详细的阐述,但不限于这些具体记载的实施例。
实施例1：
鉴别
取藏茵陈药材粉末1g，加乙酸乙酯10ml，超声处理30分钟，滤过，滤液作为供试品溶液；另取齐墩果酸对照品适量，加乙醇制成每1ml含1mg的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法试验，吸取上述两种溶液各10μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以正己烷﹣乙酸乙酯(5:2)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10％硫酸乙醇溶液，加热至斑点显色清晰，在紫外光灯365nm下检视。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。
含量测定
獐牙菜苦苷
色谱条件与系统适用性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈-水-异丙醇(冰醋酸调节pH值4.5)(体积比10：89：1)为流动相；检测波长为254nm。理论塔板数以獐牙菜苦苷计不低于2000。
对照品溶液的制备：取獐牙菜苦苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含0.15mg的溶液，即得。
供试品溶液的制备：取藏茵陈药材粉末1g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50mL，称定重量，超声提取30分钟，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得供试品溶液。
测定法分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得。
实施例2：
指纹图谱
色谱条件与系统适用性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈(A)﹣水(B)为流动相，梯度洗脱：0﹣15分钟乙腈由4％升至20％，15﹣40分钟乙腈由20％升至45％，40﹣50分钟乙腈由45％升至90％，50﹣60分钟乙腈保持90％；检测波长为220nm；流速：0.8﹣1.2ml/min；分析时间：60分钟。
对照品溶液的制备：取獐牙菜苦苷对照品适量，加甲醇制成每1ml含獐牙菜苦苷0.15mg的溶液，即得；
供试品溶液的制备：取藏茵陈粉末1g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50ml，密塞，称定重量，超声处理30分钟，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
测定：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入高效液相色谱仪，记录60分钟内的色谱图，即得藏茵陈的指纹图谱。
其中HPLC指纹图谱检测法中藏茵陈特征峰为10个，其中2号峰獐牙菜苦苷为标准峰，10个峰的相对保留时间分别为0.279、1.000、1.207、1.836、1.944、2.986、3.352、3.665、4.120、4.145。
实施例3：
鉴别
取藏茵陈药材粉末1g，加乙酸乙酯10ml，超声处理30分钟，滤过，滤液作为供试品溶液；另取齐墩果酸对照品适量，加乙醇制成每1ml含1mg的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法试验，吸取上述两种溶液各10μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以正己烷﹣乙酸乙酯(5:2)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10％硫酸乙醇溶液，加热至斑点显色清晰，在紫外光灯365nm下检视。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。
含量测定
獐牙菜苦苷
色谱条件与系统适用性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈-水(冰醋酸调节pH值4.5)(10：89：1)为流动相；检测波长为254nm。理论塔板数以獐牙菜苦苷计不低于2000。
对照品溶液的制备：取獐牙菜苦苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含0.15mg的溶液，即得。
供试品溶液的制备：取藏茵陈药材粉末1g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50mL，称定重量，超声提取30分钟，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得供试品溶液。
测定法分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得。
指纹图谱
色谱条件与系统适用性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈(A)﹣水(B)为流动相，梯度洗脱：0﹣15分钟乙腈由4％升至20％，15﹣40分钟乙腈由20％升至45％，40﹣50分钟乙腈由45％升至90％，50﹣60分钟乙腈保持90％；检测波长为220nm；流速：0.8﹣1.2ml/min；分析时间：60分钟。
对照品溶液的制备：取獐牙菜苦苷对照品适量，加甲醇制成每1ml含獐牙菜苦苷0.15mg的溶液，即得；
供试品溶液的制备：取藏茵陈粉末1g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50ml，密塞，称定重量，超声处理30分钟，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
测定：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入高效液相色谱仪，记录60分钟内的色谱图，即得藏茵陈的指纹图谱。
其中HPLC指纹图谱检测法中藏茵陈特征峰为10个，其中2号峰獐牙菜苦苷为标准峰，10个峰的相对保留时间分别为0.279、1.000、1.207、1.836、1.944、2.986、3.352、3.665、4.120、4.145。
实施例4、一种藏茵陈的检测方法，包括如下鉴别法、含量测定法及HPLC指纹图谱法：
A、鉴别法
取藏茵陈药材粉末1g，加乙酸乙酯10ml，超声处理30分钟，滤过，滤液作为供试品溶液；另取齐墩果酸对照品适量，加乙醇制成每1ml含1mg的溶液，作为对照品溶液；照薄层色谱法试验，吸取上述两种溶液各10μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以体积比5:2的正己烷﹣乙酸乙酯为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10％硫酸乙醇溶液，加热至斑点显色清晰，在紫外光灯365nm下检视；供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点；
B、獐牙菜苦苷含量测定法
色谱条件与系统适用性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；流动相为体积比10：89：1的乙腈-水-异丙醇，并用冰醋酸调节pH值为4.5；检测波长为254nm；理论塔板数以獐牙菜苦苷计不低于2000；
对照品溶液的制备：取獐牙菜苦苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含0.15mg的溶液，即得；
供试品溶液的制备：取藏茵陈药材粉末1g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50mL，称定重量，超声提取30分钟，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得供试品溶液；
测定：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得；
C、HPLC指纹图谱检测法
色谱条件与系统适用性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈﹣水为流动相，梯度洗脱，乙腈体积浓度变化为：0﹣15分钟由4％升至20％，15﹣40分钟由20％升至45％，40﹣50分钟由45％升至90％，50﹣60分钟保持90％；检测波长为220nm；流速：0.8﹣1.2ml/min；分析时间：60分钟；
对照品溶液的制备：取獐牙菜苦苷对照品适量，加甲醇制成每1ml含獐牙菜苦苷0.15mg的溶液，即得；
供试品溶液的制备：取藏茵陈粉末1g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50ml，密塞，称定重量，超声处理30分钟，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得；
测定：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入高效液相色谱仪，记录60分钟内的色谱图，即得藏茵陈的HPLC指纹图谱。
上述HPLC指纹图谱检测法所得的藏茵陈HPLC指纹图谱，10个峰与标准峰相比，相对保留时间分别为0.279、1.000、1.207、1.836、1.944、2.986、3.352、3.665、4.120、4.145。
实施例5、一种藏茵陈的检测方法，包括如下鉴别法、獐牙菜苦苷含量测定法：
A、鉴别法
取藏茵陈药材粉末1g，加乙酸乙酯10ml，超声处理30分钟，滤过，滤液作为供试品溶液；另取齐墩果酸对照品适量，加乙醇制成每1ml含1mg的溶液，作为对照品溶液；照薄层色谱法试验，吸取上述两种溶液各5﹣10μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以体积比4:1的正己烷﹣乙酸乙酯为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10％硫酸乙醇溶液，加热至斑点显色清晰，在紫外光灯365nm下检视；供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。
B、獐牙菜苦苷含量测定法
色谱条件与系统适用性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；流动相组成为体积比8：91：1的乙腈﹣水﹣异丙醇，并用酸调节pH为4.5；检测波长为254nm，理论塔板数以獐牙菜苦苷计不低于2000；
对照品溶液的制备：取獐牙菜苦苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含0.15mg的溶液，即得；
供试品溶液的制备：取藏茵陈药材粉末0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50mL，称定重量，超声提取30分钟，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得供试品溶液；
测定法：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得。
实施例6、一种藏茵陈的检测方法，包括如下獐牙菜苦苷含量测定法和HPLC指纹图谱检测法：
獐牙菜苦苷含量测定法
色谱条件与系统适用性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；流动相组成为体积比12：87：1的乙腈﹣水﹣异丙醇，并用酸调节pH为4.5；检测波长为254nm，理论塔板数以獐牙菜苦苷计不低于2000；
对照品溶液的制备：取獐牙菜苦苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含0.15mg的溶液，即得；
供试品溶液的制备：取藏茵陈药材粉末2g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50mL，称定重量，超声提取30分钟，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得供试品溶液；
测定法：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各5﹣10μl，注入液相色谱仪，测定，即得；
HPLC指纹图谱检测法
色谱条件与系统适用性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈﹣水为流动相，梯度洗脱，乙腈体积比例变化为：0﹣15分钟由4％升至20％，15﹣40分钟由20％升至45％，40﹣50分钟由45％升至90％，50﹣60分钟保持90％；检测波长为220nm；流速：0.8﹣1.2ml/min；分析时间：60分钟；
对照品溶液的制备：取獐牙菜苦苷对照品适量，加甲醇制成每1ml含獐牙菜苦苷0.15mg的溶液，即得；
供试品溶液的制备：取藏茵陈粉末2g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50ml，密塞，称定重量，超声处理30分钟，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得；
测定：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入高效液相色谱仪，记录60分钟内的色谱图，即得藏茵陈的HPLC指纹图谱。
上述HPLC指纹图谱检测法所得的藏茵陈HPLC指纹图谱，特征峰为10个，其中2号峰獐牙菜苦苷为标准峰，10个峰与标准峰相比，相对保留时间分别为0.283、1.000、1.218、1.828、2.041、3.135、3.520、3.848、4.226、4.253。
实施例7、一种藏茵陈的检测方法，包括如下鉴别法、獐牙菜苦苷含量测定法：
A、鉴别法
取藏茵陈药材粉末0.5g，加乙酸乙酯10ml，超声处理30分钟，滤过，滤液作为供试品溶液；另取齐墩果酸对照品适量，加甲醇制成每1ml含1mg的溶液，作为对照品溶液；照薄层色谱法试验，吸取上述两种溶液各5﹣10μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以体积比6：3的正己烷﹣乙酸乙酯为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10％硫酸乙醇溶液，加热至斑点显色清晰，在紫外光灯365nm下检视；供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。
B、獐牙菜苦苷含量测定法
色谱条件与系统适用性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；流动相组成为体积比8：91：1的乙腈﹣水﹣异丙醇，并用酸调节pH为4.5；检测波长为254nm，理论塔板数以獐牙菜苦苷计不低于2000；
对照品溶液的制备：取獐牙菜苦苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含0.15mg的溶液，即得；
供试品溶液的制备：取藏茵陈药材粉末1g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50mL，称定重量，超声提取30分钟，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得供试品溶液；
测定法：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得。
实施例8、一种藏茵陈的检测方法，包括如下HPLC指纹图谱检测法
色谱条件与系统适用性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈﹣水为流动相，梯度洗脱，乙腈体积比例变化为：0﹣15分钟由4％升至20％，15﹣40分钟由20％升至45％，40﹣50分钟由45％升至90％，50﹣60分钟保持90％；检测波长为220nm；流速：0.8﹣1.2ml/min；分析时间：60分钟；
对照品溶液的制备：取獐牙菜苦苷对照品适量，加甲醇制成每1ml含獐牙菜苦苷0.15mg的溶液，即得；
供试品溶液的制备：取藏茵陈粉末0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50ml，密塞，称定重量，超声处理30分钟，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得；
测定：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入高效液相色谱仪，记录60分钟内的色谱图，即得藏茵陈的HPLC指纹图谱。
上述HPLC指纹图谱检测法所得的藏茵陈HPLC指纹图谱，特征峰为10个，其中2号峰獐牙菜苦苷为标准峰，10个峰与标准峰相比，相对保留时间分别为0.265、1.000、1.268、1.744、1.847、3.135、3.520、3.848、4.326、4.253。
实施例9、一种藏茵陈制剂的检测方法，
藏菌陈630g，金钱草630g，大黄315g，唐古特青兰190g，淀粉30g，制成1000粒胶囊，
取胶囊内容物2g，加乙酸乙酯10ml，超声处理30分钟，滤过，滤液作为供试品溶液；另取齐墩果酸对照品适量，加乙醇制成每1ml含1mg的溶液，作为对照品溶液；照薄层色谱法试验，吸取上述两种溶液各5﹣10μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以体积比4:1的正己烷﹣乙酸乙酯为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10％硫酸乙醇溶液，加热至斑点显色清晰，在紫外光灯365nm下检视；供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。
B、獐牙菜苦苷含量测定法
色谱条件与系统适用性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；流动相组成为体积比8：91：1的乙腈﹣水﹣异丙醇，并用酸调节pH为4.5；检测波长为254nm，理论塔板数以獐牙菜苦苷计不低于2000；
对照品溶液的制备：取獐牙菜苦苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含0.15mg的溶液，即得；
供试品溶液的制备：取胶囊内容物1g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50mL，称定重量，超声提取30分钟，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得供试品溶液；
测定法：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得。
色谱条件与系统适用性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈﹣水为流动相，梯度洗脱，乙腈体积比例变化为：0﹣15分钟由4％升至20％，15﹣40分钟由20％升至45％，40﹣50分钟由45％升至90％，50﹣60分钟保持90％；检测波长为220nm；流速：0.8﹣1.2ml/min；分析时间：60分钟；
对照品溶液的制备：取獐牙菜苦苷对照品适量，加甲醇制成每1ml含獐牙菜苦苷0.15mg的溶液，即得；
供试品溶液的制备：取胶囊内容物2g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50ml，密塞，称定重量，超声处理30分钟，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得；
测定：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入高效液相色谱仪，记录60分钟内的色谱图，即得藏茵陈的HPLC指纹图谱。
上述HPLC指纹图谱检测法所得的藏茵陈HPLC指纹图谱，特征峰为10个，其中2号峰獐牙菜苦苷为标准峰。
Claims (2)
1.一种藏茵陈药材的检测方法，其特征在于：由如下鉴别法、獐牙菜苦苷含量测定法、HPLC指纹图谱检测法组成：
A、鉴别法
取藏茵陈药材粉末0.5﹣2g，加乙酸乙酯10ml，超声处理30分钟，滤过，滤液作为供试品溶液；另取齐墩果酸对照品适量，加甲醇或乙醇制成每1ml含1mg的溶液，作为对照品溶液；照薄层色谱法试验，吸取上述两种溶液各5﹣10μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以体积比4﹣6:1﹣3的正己烷﹣乙酸乙酯为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10％硫酸乙醇溶液，加热至斑点显色清晰，在紫外光灯365nm下检视；供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点；
B、獐牙菜苦苷含量测定法
色谱条件与系统适用性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；流动相组成为体积比8﹣12：91﹣87：1的乙腈﹣水﹣异丙醇，并用酸调节pH为4.5；检测波长为254nm，理论塔板数以獐牙菜苦苷计不低于2000；
对照品溶液的制备：取獐牙菜苦苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含0.15mg的溶液，即得；
供试品溶液的制备：取藏茵陈药材粉末0.5﹣2g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50mL，称定重量，超声提取30分钟，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得供试品溶液；
测定法：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各5﹣10μl，注入液相色谱仪，测定，即得；
C、HPLC指纹图谱检测法
色谱条件与系统适用性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈﹣水为流动相，梯度洗脱，乙腈体积比例变化为：0﹣15分钟由4%升至20%，15﹣40分钟由20%升至45%，40﹣50分钟由45%升至90%，50﹣60分钟保持90%；检测波长为220nm；流速：0.8﹣1.2ml/min；分析时间：60分钟；
对照品溶液的制备：取獐牙菜苦苷对照品适量，加甲醇制成每1ml含獐牙菜苦苷0.15mg的溶液，即得；
供试品溶液的制备：取藏茵陈粉末0.5﹣2g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50ml，密塞，称定重量，超声处理30分钟，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得；
测定：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各5﹣10μl，注入高效液相色谱仪，记录60分钟内的色谱图，即得藏茵陈的HPLC指纹图谱；
藏茵陈HPLC指纹图谱，所得特征峰为10个，其中2号峰獐牙菜苦苷为标准峰，10个峰与标准峰相比，相对保留时间分别为0.265﹣0.293、1.000、1.147﹣1.268、1.744﹣1.928、1.847﹣2.041、2.836﹣3.135、3.184﹣3.520、3.482﹣3.848、3.914﹣4.326、3.938﹣4.353。
2.根据权利要求1的一种藏茵陈药材的检测方法，其特征在于：藏茵陈HPLC指纹图谱的10个特征峰与标准峰相比，相对保留时间分别为0.279、1.000、1.207、1.836、1.944、2.986、3.352、3.665、4.120、4.145。
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