CN112098556A - 一种当归六黄汤的检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种当归六黄汤的检测方法，该当归六黄汤的检测方法，包括指纹图谱和含量测定方法，指纹图谱检测方法为：a，构建当归六黄汤的对照指纹图谱；b，当归六黄汤对照指纹图谱，用于当归六黄汤指纹图谱检测的相似度评价；含量测定方法为：测定当归六黄汤中黄芩苷、黄连碱、小檗碱、黄柏碱和黄芪甲苷的含量。本发明同时建立指纹图谱和多成分含量测定，能实现当归六黄汤的整体质量控制，且方法的重复性、稳定性以及耐用性等均较好。

Description

一种当归六黄汤的检测方法
技术领域
本发明涉及药品检测技术领域，尤其涉及一种当归六黄汤的检测方法。
背景技术
当归六黄汤，是金元四大家之一的李东垣创制的一首名方，称它为“治盗汗之圣药”，主治阴虚火旺所致的盗汗。组成为：当归、生地黄、熟地黄、黄连、黄芩、黄柏、黄芪共7味药。目前当归六黄汤质量控制方面研究较少，没有建立完善的标准，使得药品质量难以保证，本发明提供了一种当归六黄汤的检测方法，重复性、稳定性以及耐用性等均较好。
发明内容
本发明提供了一种当归六黄汤的检测方法，包括如下步骤：包括指纹图谱检测方法和含量测定方法，其中，指纹图谱检测方法为：a，构建当归六黄汤的对照指纹图谱，构建方法如下：(1)供试品溶液的制备：用50％甲醇配制由当归、生地黄、熟地黄、黄柏、黄芩、黄连、黄芪制成的当归六黄汤的供试品溶液；(2)对照品溶液的制备：用甲醇配制含黄芩苷的对照品溶液；(3)将对照品溶液和供试品溶液进行液相色谱分析；(4)采集15批当归六黄汤指纹图谱通过中药色谱指纹图谱相似度评价系统生成对照指纹图谱；b，采用a中(1)-(3)的方法获得待测本品的指纹图谱，并与对照指纹图谱对比，按中药色谱指纹图谱相似度评价系统，计算相似度；含量测定方法为：测定当归六黄汤中黄芩苷、黄连碱、小檗碱、黄柏碱和黄芪甲苷的含量。
其中，步骤a(1)具体为：取本品约0.2g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入50％甲醇25ml，密塞，称定重量，超声处理30分钟，放冷，再称定重量，用50％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
其中，指纹图谱检测方法中，步骤a(2)具体为：取黄芩苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含130μg的溶液，即得。
其中，步骤a(3)中，色谱条件为：十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；甲醇为流动相A；0.1％磷酸水溶液为流动相B；柱温：25℃；流速：1.0ml/min；进样量：10μl；检测波长为280nm；梯度洗脱条件为：0-15min，A相5％-20％，B相95％-80％；15-40min，A相20％-30％，B相80％-70％；40-65min，A相30％-40％，B相70％-60％；65-75min，A相40％-51％，B相60％-49％；75-90min，A相51％，B相49％；90-110min，A相51％-95％，B相49％-5％；110-115min，A相95％，B相5％。
其中，当归六黄汤制备方法为：取当归2.5g、生地黄2.5g、熟地黄2.5g、黄柏2.5g、黄芩2.5g、黄连2.5g、黄芪5g，将各饮片最粗粉(指能全部通过10目筛，但混有能通过50目筛不超过20％的粉末)置于1.5L砂锅中，加纯化水600mL，加盖，用电陶炉以武火800W煎煮15min至沸腾，然后转文火400W煎煮60min至约300mL，用200目不锈钢滤网常压趁热过滤，滤液用旋转蒸发仪在80℃条件下减压浓缩25min至约150mL，浓缩液用真空冷冻干燥机干燥48h，收集，即得。
其中，黄芩苷、黄连碱、小檗碱含量测定步骤为：(1)供试品溶液制备：取本品约0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70％乙醇100ml，密塞，称定重量，超声处理30分钟，放冷，再称定重量，用70％乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得；(2)对照品溶液制备：取黄芩苷、盐酸黄连碱、盐酸小檗碱对照品适量，精密称定，分别加甲醇制成每1ml含90μg、10μg、50μg的混合对照品溶液，即得；(3)对照品溶液和供试品溶液进行液相色谱分析即得，色谱条件为：十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；乙腈为流动相A；0.05mol/L磷酸二氢钾溶液为流动相B；柱温：25℃；流速：1.0ml/min；进样量：10μl；检测波长为278nm；梯度洗脱条件为：0-5min，A相18％-21％，B相82％-79％；5-20min，A相21％-28％，B相79％-72％；20-25min，A相28％-33％，B相72％-67％；25-30min，A相33％，B相67％。
其中，黄柏碱含量测定步骤为：(1)供试品溶液制备：取本品约0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入流动相25ml，密塞，称定重量，超声处理30分钟，放冷，再称定重量，用流动相补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得；(2)对照品溶液制备：取盐酸黄柏碱对照品，加流动相制成每1ml含60μg的溶液，即得；(3)对照品溶液和供试品溶液进行液相色谱分析即得，色谱条件为：十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈-0.1％磷酸溶液(每100ml加0.2g十二烷基磺酸钠)(38:62)为流动相，柱温：20℃；流速：1.0ml/min；进样量：20ul；检测波长为284nm。
其中，黄芪甲苷含量测定步骤为：(1)供试品溶液制备：取本品约2g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入含4％浓氨试液的80％甲醇50ml，密塞，称定重量，加热回流1小时，放冷，再称定重量，用含4％浓氨试液的80％甲醇补足减失的重量，摇匀，高速离心10分钟，精密量取25ml上清液于蒸发皿中，蒸至近干，残渣用80％甲醇溶解，转移至10ml量瓶中，并加80％甲醇定容至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得；(2)对照品溶液制备：取黄芪甲苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含0.4mg的溶液，即得；(3)分别精密吸取对照品溶液3μl、10μl，供试品溶液20μl进行液相色谱分析即得，色谱条件为：十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈-水(32：68)为流动相；柱温：25℃；流速：1.0ml/min；蒸发光散射检测器检测。
其中，对照指纹图谱中的主要色谱峰进行指认，其中峰2为黄连碱，峰5为小檗碱，峰6为巴马汀，峰7为黄芩苷，峰10为汉黄芩苷。
对当归六黄汤指纹图谱峰指认峰归属图中的31个色谱峰进行峰归属。
本发明所具有的优点是：
1、本发明的指纹图谱检测方法能全面反应当归六黄汤的整体质量信息。
2、本发明的含量测定方法对当归六黄汤中5种成分进行含量测定，大大提高了质量控制水平，全面保证了当归六黄汤的质量。
3、本发明的检测方法具有专属性强、重复性好、稳定性好、耐用性好等特点。
附图说明
图1为当归六黄汤对照指纹图谱；
图2为物质基准柱温考察的指纹图谱对比图；
图3为物质基准流速考察的指纹图谱对比图；
图4为物质基准色谱柱考察的指纹图谱对比图；
图5为当归六黄汤指纹图谱峰指认峰归属图；
图6为黄芩苷含量测定专属性色谱图；
图7为黄连碱含量测定专属性色谱图；
图8为小檗碱含量测定专属性色谱图；
图9为黄芩苷对照品标准曲线；
图10为盐酸黄连碱标准曲线；
图11为盐酸小檗碱对照品标准曲线；
图12为黄柏碱含量测定专属性色谱图；
图13为盐酸黄柏碱对照品标准曲线；
图14为黄芪甲苷含量测定专属性色谱图；
图15为黄芪甲苷对照品标准曲线。
具体实施方式
为能清楚说明本方案的技术特点，下面通过具体实施方式，并结合其附图，对本发明进行详细阐述。在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本申请。
1、当归六黄汤制备：当归2.5g、生地黄2.5g、熟地黄2.5g、黄柏2.5g、黄芩2.5g、黄连2.5g、黄芪5g以上七味制成最粗粉混合，并置于1.5L砂锅中，加纯化水600mL，加盖，用电陶炉以武火800W煎煮15min至沸腾，然后转文火400W煎煮60min至约300mL，用200目不锈钢滤网常压趁热过滤，滤液用旋转蒸发仪在80℃条件下减压浓缩25min至约150mL，浓缩液用真空冷冻干燥机干燥48h，收集，即得。
2、仪器与试剂
高效液相色谱仪Agilent 1260；电子天平BSASS4S-CW赛多利斯；电子天平XS105梅特勒。
盐酸小檗碱(批号：110713-201814，含量以86.7％计)、盐酸黄柏碱(批号：111895-201504，含量以94.9％计)、黄芩苷(批号：110715-201821，含量以95.4％计)、盐酸巴马汀(批号：110732-201913，含量以85.7％计)、盐酸黄连碱(批号：112026-201802，含量以94.0％计)、汉黄芩苷(批号：11202-201702)、黄芩素(批号：111595-201808，含量以97.9％计)、汉黄芩素(批号：112002-201702，含量以98.5％计)、5-羟甲基糠醛(批号：111626-201912，含量以99.2％计)、绿原酸(批号：110753-201716,含量以99.3％计)、藁本内酯(批号：111737-201608)、阿魏酸(批号：110773-201614，含量以99.0％计)、毛蕊异黄酮葡萄糖苷(批号：11920-201606，含量以97.6％计)以上对照品均购自中国食品药品检定研究院。
甲醇(色谱纯)，Fisher；磷酸(分析纯)，天津市光复精细化工有限公司。
3、指纹图谱测定方法验证
3.1色谱条件为：十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；甲醇为流动相A；0.1％磷酸水溶液为流动相B；柱温：25℃；流速：1.0ml/min；进样量：10μl；检测波长为280nm；梯度洗脱条件为：0-15min，A相5％-20％，B相95％-80％；15-40min，A相20％-30％，B相80％-70％；40-65min，A相30％-40％，B相70％-60％；65-75min，A相40％-51％，B相60％-49％；75-90min，A相51％，B相49％；90-110min，A相51％-95％，B相49％-5％；110-115min，A相95％，B相5％。
3.2对照品溶液的制备：取黄芩苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含130μg的溶液，即得。
3.3供试品溶液的制备：取本品约0.2g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入50％甲醇25ml，密塞，称定重量，超声处理30分钟，放冷，再称定重量，用50％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
3.4方法学试验
3.4.1精密度：取供试品溶液一份，按照上述测定条件连续进样6次，测定色谱峰保留时间及峰面积，色谱图见图1。以峰7(黄芩苷)为参照峰计算峰面积大于总峰面积2％的峰相对保留时间及相对峰面积的RSD值，考察仪器的精密度，结果见表1-2。
表1精密度试验结果(共有峰相对保留时间)
Figure BDA0002692425950000061
表2精密度试验结果(共有峰相对峰面积)
Figure BDA0002692425950000062
结果表明,峰面积大于总峰面积2％的共有峰相对保留时间的RSD小于1％，相对峰面积的RSD小于1％,仪器精密度良好。
3.4.2重复性：按照供试品溶液的制备方法平行制备供试品溶液6份，分别进样分析，测定色谱峰保留时间及峰面积。以峰7(黄芩苷)为参照峰计算峰面积大于总峰面积2％的峰相对保留时间及相对峰面积的RSD值，考察方法的重复性，试验结果见表3-4。
表3重复性试验结果(共有峰相对保留时间)
Figure BDA0002692425950000071
表4重复性试验结果(共有峰相对峰面积)
Figure BDA0002692425950000072
试验结果表明，峰面积大于总峰面积2％的共有峰相对保留时间的RSD小于1％，相对峰面积的RSD小于4％，表明方法重复性良好。
3.4.3稳定性：取供试品溶液，分别于0、2、4、6、8、10、24h进样分析，测定色谱峰保留时间及峰面积。以峰7(黄芩苷)为参照峰计算峰面积大于总峰面积2％的共有峰的相对保留时间及相对峰面积的RSD值，考察供试品溶液的稳定性，结果见表5-6。
表5稳定性试验结果(共有峰相对保留时间)
Figure BDA0002692425950000081
表6稳定性试验结果(共有峰相对峰面积)
Figure BDA0002692425950000082
试验结果表明，峰面积大于总峰面积2％的共有峰相对保留时间的RSD小于1％，相对峰面积的RSD小于1％,表明供试品溶液在24h内稳定性良好。
3.4.4耐用性：(1)柱温的考察：分别考察了20℃、25℃、30℃三种柱温，如图2所示。(2)流速的考察：分别考察了0.9ml/min、1.0ml/min、1.1ml/min三种流速，如图3所示。(3)色谱柱考察：分别考察了Agilent ZORBAX SB-C18(5μm，250×4.6mm)、Agilent Eclipse plμsC18(5μm，250×4.6mm)、Kromasil 100-5-C18(5μm，250×4.6mm)三个不同色谱柱，如图4所示。试验结果表明，柱温、流速、色谱柱发生较小变化，对物质基准指纹图谱的峰信息、峰形及分离度没有明显的影响，说明该方法耐用性良好。
3.5对照指纹图谱的建立
按1中当归六黄汤的制备方法制备15批当归六黄汤，用3.3的供试品制备方法制备15批供试品溶液，按照3.1的条件注入液相色谱仪记录各供试品的指纹图谱色谱图，将15批指纹图谱色谱图导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统生成对照指纹图谱，如图1所示。
3.6对照指纹图谱的峰指认和峰归属
3.6.1对照品溶液的制备
取黄芩苷、盐酸小檗碱、盐酸黄柏碱、盐酸黄连碱、盐酸巴马汀、汉黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素、绿原酸、5-羟甲基糠醛、藁本内酯、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、阿魏酸对照品适量，精密称定，分别加甲醇制成每1ml含72.6μg、57.1μg、49.2μg、22.6μg、36.8μg、20.2μg、10.5μg、10.5μg、133.2μg、4.6μg、24.8μg、51.4μg、43.5μg的溶液，即得。
3.6.2单味药材与阴性供试品溶液的制备
取各单味药材冻干粉约0.025g，精密称定，按3.1项下方法制备单味药材的供试品溶液。
分别取处方中除去生地黄、熟地黄、当归、黄芩、黄柏、黄芪、黄连的其他药味，按处方比例制成缺生地黄、熟地黄、当归、黄芩、黄柏、黄芪、黄连的阴性冻干粉。按3.1项下方法制备阴性供试品溶液。
3.6.3对照指纹图谱色谱峰指认及归属
分别精密吸取各对照品溶液、供试品溶液10μl，按3.1项下色谱条件，注入液相色谱仪，记录色谱图，如图5所示。通过对照品、单味药材、阴性与物质基准指纹图谱色谱峰保留时间对比，进行峰指认和归属，实验结果见表6。
表7当归六黄汤色谱峰指认及归属
Figure BDA0002692425950000091
Figure BDA0002692425950000101
4、黄芩苷、黄连碱、小檗碱含量测定方法验证
4.1供试品溶液的制备：取本品约0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70％乙醇100ml，密塞，称定重量，超声处理30分钟，放冷，再称定重量，用70％乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得；对照品溶液的制备：取黄芩苷、盐酸黄连碱、盐酸小檗碱对照品适量，精密称定，分别加甲醇制成每1ml含90μg、10μg、50μg的混合对照品溶液，即得；色谱条件为：十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；乙腈为流动相A；0.05mol/L磷酸二氢钾溶液为流动相B；柱温：25℃；流速：1.0ml/min；进样量：10μl；检测波长为278nm；梯度洗脱条件为：0-5min，A相18％-21％，B相82％-79％；5-20min，A相21％-28％，B相79％-72％；20-25min，A相28％-33％，B相72％-67％；25-30min，A相33％，B相67％。
4.2专属性：取黄芩苷、盐酸黄连碱、盐酸小檗碱对照品适量，精密称定，分别加甲醇制成浓度为50μg/ml、70μg/ml、90μg/ml的单个对照品溶液。取处方中除去黄连的其他药味，按处方比例制成缺黄连的阴性冻干粉，按供试品溶液的制备方法，制得黄连阴性对照溶液。同法制得黄芩阴性对照溶液和黄连黄柏双阴性对照溶液。分别精密吸取上述对照品溶液、供试品溶液及阴性对照溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定结果见图6-8，供试品色谱在与对照品色谱保留时间相同的位置上，有相应色谱峰，而空白和阴性对照色谱中无相应色谱峰，说明处方中其他药味对黄芩苷、黄连碱、小檗碱的测定结果无干扰，且黄芩苷、黄连碱、小檗碱与相邻色谱峰的分离度均大于1.5，因此该黄芩苷、黄连碱、小檗碱含量测定方法专属性良好。
4.3线性与范围：取黄芩苷、盐酸黄连碱、盐酸小檗碱对照品适量，精密称定，加甲醇制成浓度分别为469.35μg/ml、73.3μg/ml、186.4μg/ml的混合对照品溶液，依次以甲醇稀释2.5、5、25和50倍，得不同浓度的混合对照品溶液。精密吸取各浓度的混合对照品溶液10μl，注入液相色谱仪，分别测定峰面积，测定结果见表8-10。
表8黄芩苷线性关系试验结果
Figure BDA0002692425950000111
表9盐酸黄连碱线性关系试验结果
Figure BDA0002692425950000112
表10盐酸小檗碱线性关系试验结果
Figure BDA0002692425950000113
分别以黄芩苷、盐酸黄连碱、盐酸小檗碱混合对照品溶液的浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，进行线性回归，结果见表11，标准曲线图见图9-11。
表11黄芩苷、盐酸黄连碱、盐酸小檗碱线性回归关系
Figure BDA0002692425950000114
试验结果表明黄芩苷、盐酸黄连碱、盐酸小檗碱分别在9.387-469.35μg/ml、1.4664-73.32μg/ml、3.728-186.4μg/ml浓度范围内，浓度与其峰面积呈良好的线性关系。
4.4重复性：按4.1供试品制备方法平行制备供试品溶液6份。分别精密吸取对照品及供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，计算含量。结果见表12。各成分含量的RSD小于1％，表明方法的重复性良好。
表12黄芩苷、黄连碱、小檗碱重复性试验结果
Figure BDA0002692425950000121
4.5中间精密度：不同人员在不同日期采用不同仪器，按4.1供试品制备方法平行制备供试品溶液6份，分别精密吸取对照品及供试品溶液10μl，注入液相色谱仪，测定计算含量。结果见表13。三个成分的12次含量结果RSD均小于2％，表明方法的中间精密度良好。
表13黄芩苷、黄连碱、小檗碱中间精密度试验结果
Figure BDA0002692425950000122
4.6加样回收：取本品约0.25g，精密称定，分别精密加入浓度为0.8941mg/ml的黄芩苷对照品溶液5ml，浓度为0.7332mg/ml的盐酸黄连碱对照品溶液1ml，浓度为1.2429mg/ml的盐酸小檗碱对照品溶液2ml，按供试品溶液的制备方法平行制备供试品溶液6份。分别精密吸取对照品溶液及供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，计算回收率。结果见表14-16。黄芩苷、黄连碱、小檗碱的平均回收率分别为96.7％、100.2％、95.1％，RSD均小于2％，表明方法的加样回收符合要求。
表14黄芩苷含量测定加样回收试验结果
Figure BDA0002692425950000131
表15黄连碱含量测定加样回收试验结果
Figure BDA0002692425950000132
表16小檗碱含量测定加样回收试验结果
Figure BDA0002692425950000133
4.7稳定性：精密吸取对照品溶液、供试品溶液各10μl，供试品溶液分别于0h、2h、4h、8h、12h、24h注入液相色谱仪测定，计算含量。结果见表17。三个成分在24h内的含量测定结果RSD均小于0.5％，表明供试品溶液在24小时内稳定性良好。
表17黄芩苷、黄连碱、小檗碱稳定性试验结果
Figure BDA0002692425950000141
4.8耐用性：不同色谱柱：分别考察了三根不同色谱柱Inertsil ODS-3(5μm，250×4.6mm)、Kromasil 100-5-C18(5μm，250×4.6mm)、Agilent ZORBAX SB-C18(5μm，250×4.6mm)，结果见表18。不同流速：分别考察了0.9ml/min、1.0ml/min、1.1ml/min的流速，结果见表19。不同柱温：分别考察了23℃、25℃、27℃的柱温，结果见表20。
表18不同色谱柱试验结果
Figure BDA0002692425950000142
表19不同流速试验结果
Figure BDA0002692425950000143
表20不同柱温试验结果
Figure BDA0002692425950000144
试验结果表明，色谱柱、流速、柱温发生较小变化，对黄芩苷、黄连碱、小檗碱含量测定结果影响不大，因此该含量测定方法耐用性良好。
5黄柏碱含量测定方法验证
5.1供试品溶液的制备：取本品约0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入流动相25ml，密塞称定重量，超声处理30分钟，放冷，再称定重量，用流动相补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得；对照品溶液的制备：取盐酸黄柏碱对照品，加流动相制成每1ml含60μg的溶液，即得；色谱条件：对照品溶液和供试品溶液的进样量分别为10μl、20μl；十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈-0.1％磷酸溶液(每100ml加0.2g十二烷基磺酸钠)(38:62)为流动相，柱温：20℃；流速：1.0ml/min；进样量：20μl；检测波长为284nm。
5.2专属性：取处方中除去黄柏的其他药味，按处方比例制成缺黄柏的阴性冻干粉，按供试品溶液的制备方法，制得黄柏阴性对照溶液。分别精密吸取盐酸黄柏碱对照品溶液、供试品溶液及阴性对照溶液各10μl、20μl、20μl，注入液相色谱仪，测定。结果见图12。如图12所示，当归六黄汤色谱在与对照品色谱保留时间相同的位置上，有相应色谱峰，而空白和阴性对照色谱中无相应色谱峰，说明处方中其他药味对黄柏碱的测定结果无干扰，且黄柏碱与相邻色谱峰的分离度大于1.5，因此该黄柏碱含量测定方法专属性良好。
5.3线性与范围：取盐酸黄柏碱对照品适量，精密称定，用流动相制成浓度为1.253mg/ml的溶液，依次加流动相稀释5、10、20、100和200倍，得不同浓度的盐酸黄柏碱对照品溶液。精密吸取各浓度对照品溶液10μl，注入液相色谱仪，分别测定峰面积，测定结果见表21。
表21盐酸黄柏碱线性关系试验结果
Figure BDA0002692425950000151
以盐酸黄柏碱对照品溶液的浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，进行线性回归，结果见表22，标准曲线图见图13。
表22盐酸黄柏碱线性回归关系
Figure BDA0002692425950000152
试验结果表明盐酸黄柏碱在6.26-250.54μg/ml浓度范围内，浓度与峰面积呈良好的线性关系。
5.4重复性：按5.1供试品制备方法平行制备供试品溶液6份。分别精密吸取对照品及供试品溶液10μl、20μl，注入液相色谱仪测定，计算含量。结果见表23。黄柏碱含量RSD小于1％，表明方法的重复性良好。
表23黄柏碱重复性试验结果
Figure BDA0002692425950000161
5.5中间精密度：不同人员在不同日期采用不同仪器，平行制备供试品溶液6份。分别精密吸取对照品及供试品溶液10μl、20μl，注入液相色谱仪测定，计算含量。结果见表24。黄柏碱12次的含量RSD小于3％，表明方法的中间精密度良好。
表24黄柏碱中间精密度试验结果
Figure BDA0002692425950000162
5.6加样回收：取本品约0.25g，精密称定，分别精密加入125.23μg/ml的盐酸黄柏碱对照品溶液2ml，按5.1供试品制备方法平行制备供试品溶液6份。分别精密吸取对照品及供试品溶液10μl和20μl，注入液相色谱仪测定，计算含量。结果见表25。黄柏碱的平均回收率为97.1％，RSD小于2％，表明方法的加样回收符合要求。
表25黄柏碱含量测定加样回收试验结果
Figure BDA0002692425950000171
5.7稳定性：分别精密吸取对照品及供试品溶液10μl和20μl，供试品溶液分别在0h、2h、4h、8h、24h注入液相色谱仪，测定，计算含量，结果见表26。黄柏碱含量RSD小于2％，表明供试品溶液在24小时内稳定性良好。
表26黄柏碱含量测定稳定性结果
Figure BDA0002692425950000172
5.8耐用性：不同色谱柱：分别考察了三根不同色谱柱Agilent ZORBAX SB-C18(5μm，250×4.6mm)、Aglient Eclipse Plμs C18(5μm，250×4.6mm)、Agilent ZORBAX XDB-C18(5μm，250×4.6mm)，结果见表27。不同流速：分别考察了0.9ml/min、1.0ml/min、1.1ml/min的流速，结果见表28。不同柱温：分别考察了18℃、20℃、22℃的柱温，结果见表29。
表27不同色谱柱试验结果
Figure BDA0002692425950000173
表28不同流速试验结果
Figure BDA0002692425950000174
表29不同柱温试验结果
Figure BDA0002692425950000175
试验结果表明，色谱柱、流速、柱温发生较小变化，黄柏碱含量测定结果基本一致，因此该含量测定方法耐用性良好。
6黄芪甲苷含量测定方法验证
6.1供试品溶液的制备：取本品约2g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入含4％浓氨试液的80％甲醇50ml，密塞，称定重量，加热回流1小时，放冷，再称定重量，用含4％浓氨试液的80％甲醇补足减失的重量，摇匀，高速离心10分钟，精密量取25ml上清液于蒸发皿中，蒸至近干，残渣用80％甲醇溶解，转移至10ml量瓶中，并加80％甲醇定容至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得；对照品溶液的制备：取黄芪甲苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含0.4mg的溶液，即得；色谱条件为：十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈-水(32：68)为流动相；柱温：25℃；流速：1.0ml/min；蒸发光散射检测器检测。
6.2专属性：取黄芪甲苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成浓度为1030.047μg/ml的溶液。取处方中除去黄芪的其他药味，按处方比例制成缺黄芪的阴性冻干粉，按供试品溶液的制备方法，制得黄芪阴性对照溶液。分别精密吸取黄芪甲苷对照品溶液2μl、供试品溶液及阴性对照溶液各20μl，注入液相色谱仪，测定。结果见图14。当归六黄汤色谱在与对照品色谱保留时间相同的位置上，有相应色谱峰，而空白和阴性对照色谱中无相应色谱峰，说明处方中其他药味对黄芪甲苷的测定结果无干扰，且黄芪甲苷与相邻色谱峰的分离度大于1.5，因此该黄芪甲苷含量测定方法专属性良好。
6.3线性与范围：精密称定黄芪甲苷对照品12.73mg，转移至20ml容量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，摇匀，即得黄芪甲苷对照品溶液，浓度为616.768μg/ml。精密量取上述对照品溶液，依次以甲醇稀释2.5、6.7(3→20ml)、10、20倍，得到不同浓度的黄芪甲苷对照品溶液。分别精密吸取各浓度对照品溶液20μl，注入液相色谱仪，分别测定峰面积，并计算黄芪甲苷对照品进样量和峰面积的常用对数值，结果见表30。
表30黄芪甲苷线性关系试验结果
Figure BDA0002692425950000191
以黄芪甲苷对照品进样量的常用对数值为横坐标，峰面积的常用对数值为纵坐标，进行线性回归，线性回归方程见表31，标准曲线见图15。
表31黄芪甲苷线性回归关系
Figure BDA0002692425950000192
试验结果表明，黄芪甲苷在0.617～12.335μg进样量范围内，进样量的常用对数值与峰面积的常用对数值呈良好的线性关系。
6.4重复性：按6.1供试品制备方法平行制备供试品溶液6份。分别精密吸取对照品3μl、10μl，供试品溶液20μl，注入液相色谱仪测定，计算含量。结果见表32。黄芪甲苷含量RSD小于3％，表明方法的重复性良好。
表32黄芪甲苷含量测定重复性试验结果
Figure BDA0002692425950000193
6.5中间精密度：不同人员在不同日期采用不同仪器，按6.1供试品制备方法平行制备供试品溶液6份。分别精密吸取对照品3μl、10μl，供试品溶液20μl，注入液相色谱仪测定计算含量。结果见表33。黄芪甲苷的12次含量RSD小于3％，表明方法的中间精密度良好。
表33黄芪甲苷中间精密度试验结果
Figure BDA0002692425950000194
Figure BDA0002692425950000201
6.6加样回收：取本品约1g，精密称定，分别精密加入浓度为364.0μg/ml的黄芪甲苷对照品溶液2ml，按6.1项下制备方法平行制备供试品溶液6份。分别精密吸取对照品溶液3μl、10μl，供试品溶液20μl，注入液相色谱仪，测定，计算回收率。结果见表34。黄芪甲苷含量的平均回收率为96.0％，RSD小于4％，表明方法的加样回收符合要求。
表34黄芪甲苷含量测定加样回收试验结果
Figure BDA0002692425950000202
6.7稳定性：分别精密吸取对照品溶液3μl、10μl，供试品溶液20μl，供试品溶液分别在0h、2h、4h、8h、12h、24h注入液相色谱仪，测定，计算含量。结果见表35。黄芪甲苷含量RSD小于4％，表明供试品溶液在24h内稳定性良好。
表35黄芪甲苷含量测定稳定性结果
Figure BDA0002692425950000203
Figure BDA0002692425950000211
6.8耐用性：不同色谱柱：分别考察了三根不同的色谱柱Agilent ZORBAX SB-C18(5μm，250×4.6mm，SN:ΜSCL083279)、Inersil ODS-3((5μm，250×4.6mm，SN:1A7173051)、Inersil ODS-3((5μm，250×4.6mm，SN:1A7150505)结果见表36。不同流速：分别考察了0.8ml/min、1.0ml/min、1.2ml/min的流速，结果见表37。不同柱温：分别考察了20℃、25℃、30℃的柱温，结果见表38。
表36不同色谱柱试验结果
Figure BDA0002692425950000212
表37不同流速试验结果
Figure BDA0002692425950000213
表38不同柱温试验结果
Figure BDA0002692425950000214
试验结果表明，色谱柱、流速、柱温发生较小变化，对黄芪甲苷含量测定结果影响不大，因此该含量测定方法耐用性良好，能满足系统适应性试验要求。上述具体实施方式不能作为对本发明保护范围的限制，对于本领域技术领域的技术人员来说，对本发明实施方式所做出的任何替代改进或变换均落在本发明的保护范围内。本发明未详述之处，均为本技术领域技术人员公知技术。

Claims (10)

1.一种当归六黄汤的检测方法，其特征在于，包括指纹图谱检测方法和含量测定方法，指纹图谱检测方法为：a，构建当归六黄汤的对照指纹图谱，构建方法如下：(1)供试品溶液的制备：用50％甲醇配制由当归、生地黄、熟地黄、黄柏、黄芩、黄连、黄芪制成的当归六黄汤供试品溶液；(2)对照品溶液的制备：用甲醇配制含黄芩苷的对照品溶液；(3)将对照品溶液和供试品溶液进行液相色谱分析；(4)采集15批当归六黄汤指纹图谱通过中药色谱指纹图谱相似度评价系统生成对照指纹图谱；b，采用a中(1)-(3)的方法获得待测本品的指纹图谱，并与对照指纹图谱对比，按中药色谱指纹图谱相似度评价系统，计算相似度；含量测定方法为：测定当归六黄汤中黄芩苷、黄连碱、小檗碱、黄柏碱和黄芪甲苷的含量。
2.根据权利要求1所述的当归六黄汤的检测方法，其特征在于，步骤a(1)具体为：取本品0.2±10％g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入50％甲醇25ml，密塞，称定重量，超声处理30分钟，放冷，再称定重量，用50％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
3.根据权利要求1所述的当归六黄汤的检测方法，其特征在于，指纹图谱检测方法中，步骤a(2)具体为：取黄芩苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含130μg的溶液，即得。
4.根据权利要求1所述的当归六黄汤的检测方法，其特征在于，步骤a(3)中，色谱条件为：十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；甲醇为流动相A；0.1％磷酸水溶液为流动相B；柱温：25℃；流速：1.0ml/min；进样量：10μl；检测波长为280nm；梯度洗脱条件为：0-15min，A相5％-20％，B相95％-80％；15-40min，A相20％-30％，B相80％-70％；40-65min，A相30％-40％，B相70％-60％；65-75min，A相40％-51％，B相60％-49％；75-90min，A相51％，B相49％；90-110min，A相51％-95％，B相49％-5％；110-115min，A相95％，B相5％。
5.根据权利要求1所述的当归六黄汤的检测方法，其特征在于，当归六黄汤的制备方法为：将当归六黄汤中的各饮片制成最粗粉，并按照一定的质量比混合，加水煎煮，之后趁热过滤，干燥得棕黄色至棕色粉末。
6.根据权利要求5所述的当归六黄汤的制备方法，其特征在于，当归六黄汤的制备方法具体为：取当归2.5g、生地黄2.5g、熟地黄2.5g、黄柏2.5g、黄芩2.5g、黄连2.5g、黄芪5g，将各饮片最粗粉置于1.5L砂锅中，加纯化水600mL，加盖，用电陶炉以武火800W煎煮15min至沸腾，然后转文火400W煎煮60min至300mL，用200目不锈钢滤网常压趁热过滤，滤液用旋转蒸发仪在80℃条件下减压浓缩25min至150mL，浓缩液用真空冷冻干燥机干燥48h，收集，即得。
7.根据权利要求1所述的当归六黄汤的检测方法，其特征在于，黄芩苷、黄连碱、小檗碱的含量测定步骤为：(1)供试品溶液制备：取本品0.5±10％g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70％乙醇100ml，密塞，称定重量，超声处理30分钟，放冷，再称定重量，用70％乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得；(2)对照品溶液制备：取黄芩苷、盐酸黄连碱、盐酸小檗碱对照品适量，精密称定，分别加甲醇制成每1ml含90μg、10μg、50μg的混合对照品溶液，即得；(3)对照品溶液和供试品溶液进行液相色谱分析即得，色谱条件为：十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；乙腈为流动相A；0.05mol/L磷酸二氢钾溶液为流动相B；柱温：25℃；流速：1.0ml/min；进样量：10μl；检测波长为278nm；梯度洗脱条件为：0-5min，A相18％-21％，B相82％-79％；5-20min，A相21％-28％，B相79％-72％；20-25min，A相28％-33％，B相72％-67％；25-30min，A相33％，B相67％。
8.根据权利要求1所述的当归六黄汤的检测方法，其特征在于，黄柏碱的测定步骤为：(1)供试品溶液制备：取本品0.5±10％g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入流动相25ml，密塞，称定重量，超声处理30分钟，放冷，再称定重量，用流动相补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得；(2)对照品溶液制备：取盐酸黄柏碱对照品，加流动相制成每1ml含60μg的溶液，即得；(3)对照品溶液和供试品溶液进行液相色谱分析即得，色谱条件为：十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈-0.1％磷酸溶液(每100ml加0.2g十二烷基磺酸钠)(38:62)为流动相，柱温：20℃；流速：1.0ml/min；进样量：20μl；检测波长为284nm。
9.根据权利要求1所述的当归六黄汤的检测方法，其特征在于，黄芪甲苷的测定步骤为：(1)供试品溶液制备：取本品2±10％g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入含4％浓氨试液的80％甲醇50ml，密塞，称定重量，加热回流1小时，放冷，再称定重量，用含4％浓氨试液的80％甲醇补足减失的重量，摇匀，高速离心10分钟，精密量取25ml上清液于蒸发皿中，蒸至近干，残渣用80％甲醇溶解，转移至10ml量瓶中，并加80％甲醇定容至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得；(2)对照品溶液制备：取黄芪甲苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含0.4mg的溶液，即得；(3)分别精密吸取对照品溶液3μl、10μl，供试品溶液20μl进行液相色谱分析即得，色谱条件为：十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈-水(32：68)为流动相；柱温：25℃；流速：1.0ml/min；蒸发光散射检测器检测。
10.根据权利要求1所述的当归六黄汤的检测方法，其特征在于，将对照指纹图谱中的主要色谱峰进行指认，其中峰2为黄连碱，峰5为小檗碱，峰6为巴马汀，峰7为黄芩苷，峰10为汉黄芩苷。
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