CN113884587B - 一种白头翁汤多组分化学成分含量测定方法 - Google Patents

一种白头翁汤多组分化学成分含量测定方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种白头翁汤多组分化学成分含量测定方法，具体是利用HPLC‑MSMS分析法，分别建立白头翁皂苷B4、B5、D、A3、黑海常春藤皂苷A1、α‑常春藤皂苷、秦皮甲素、秦皮乙素、秦皮素、黄柏碱、盐酸巴马汀、盐酸黄连碱、盐酸小檗碱的标准曲线，测定煎煮法提取白头翁汤样品，制定标准曲线，测定13种化学成分的含量，为白头翁汤及其相关制剂的质量控制提供科学依据。

Description

一种白头翁汤多组分化学成分含量测定方法
技术领域
本发明涉及中药技术领域，更具体的说是涉及一种白头翁汤多组分化学成分含量测定方法。
背景技术
中药处方中化学成分复杂、作用靶点多，处方药物的单煎和合煎有可能改变其化学成分，而各种化学成分的总和是其治疗效果的物质基础。因此，为研究中药处方的作用机制、弄清药效的物质基础，有必要研究其化学成分。
白头翁汤出自张仲景《伤寒论》，组方包括4味中药，其中君药为白头翁、臣药为黄连和黄柏、使药秦皮，具有清热解毒、凉血止痢之功效，兽医临床上常用来治疗痢疾和肠炎。根据现代临床研究表明，白头翁汤在抗炎、抗菌等方面有显著疗效。但是，白头翁汤的临床上应用并不广泛，仅其主药白头翁的活性成分—白头翁皂苷在临床上进行实际应用，具有抗炎作用。
因此，为了进一步研究白头翁汤的作用机制，促进白头翁汤在实际临床中的应用，需要研究其化学成分，测定其中有效成分的含量，即提供一种白头翁汤多组分化学成分含量测定方法是本领域技术人员亟需解决的问题。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了一种白头翁汤多组分化学成分含量测定方法，具体是利用HPLC-MSMS分析法，分别建立白头翁皂苷B4、B5、D、A3、黑海常春藤皂苷A1、α-常春藤皂苷、秦皮甲素、秦皮乙素、秦皮素、黄柏碱、盐酸巴马汀、盐酸黄连碱、盐酸小檗碱的标准曲线，分别测定白头翁组、白头翁汤组和去白头翁组煎煮得到的三类样品的含量，比较其含量差异。测定13种化学成分的含量，为白头翁汤及其相关制剂的质量控制提供科学依据。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种白头翁汤多组分化学成分含量测定方法，包括如下步骤：
(1)称取对照品，然后加入甲醇中溶解，得到所述对照品储备液；
(2)取白头翁、黄柏、黄连和秦皮除杂、切碎，先加水浸泡并经初次加热至沸腾，然后经初次过滤分别得到滤渣和初次滤液，取所述滤渣加水经第二次加热至沸腾，再次过滤得到二次滤液，合并所述初次滤液和所述二次滤液后进行离心处理，取上清液稀释即得白头翁汤样品；
(3)取所述对照品储备液稀释得到对照品溶液，然后分别按照色谱条件和质谱条件、采用高效液相色谱-串联质谱进行检测，再最后以质量浓度为横坐标、峰面积积分值为纵坐标绘制标准曲线，进行线性回归，得到相关系数和回归方程；
(4)取所述白头翁汤样品按照所述色谱条件和所述质谱条件采用高效液相色谱-串联质谱进行检测，然后根据步骤(3)得到的回归方程，分别进行计算，得到各化学成分含量。
上述优选技术方案的有益效果是：本发明公开的测定方法操作简单、准确度高、重复性好，能够同时测量白头翁汤中白头翁皂苷B4、B5、D、A3、黑海常春藤皂苷A1、α-常春藤皂苷、秦皮甲素、秦皮乙素、秦皮素、黄柏碱、盐酸巴马汀、盐酸黄连碱、盐酸小檗碱13中化学成分的具体含量，可以进一步完善白头翁汤的质量控制研究。
优选的，步骤(1)中所述对照品包括白头翁皂苷B4、白头翁皂苷B5、黑海常春藤皂苷A1、白头翁皂苷D、白头翁皂苷A3、α-常春藤皂苷、秦皮素、秦皮甲素、秦皮乙素、黄柏碱、盐酸巴马汀、盐酸黄连碱和盐酸小檗碱。
上述优选技术方案的有益效果是：对白头翁汤中几味中药进行拆方研究，以白头翁皂苷B4、白头翁皂苷B5、黑海常春藤皂苷A1、白头翁皂苷D、白头翁皂苷A3、α-常春藤皂苷、秦皮素、秦皮甲素、秦皮乙素、黄柏碱、盐酸巴马汀、盐酸黄连碱和盐酸小檗碱为检测指标，利用液质联用仪测定以上指标的含量，监测随着组方的变化，导致的以上指标性成分的含量变化及其变化的规律。
《中国药典》2020年版规定：白头翁药材饮片的指标性成分为白头翁皂苷B4，秦皮药材饮片的指标性成分为秦皮素、秦皮甲素和秦皮乙素，黄柏药材饮片的指标性成分为黄柏碱，黄连药材饮片的指标性成分为盐酸巴马汀、盐酸黄连碱和盐酸小檗碱，所以，方案中选取测定的13个成分包括以上这些《中国药典》2020版规定的指标性成分，将具有较好的代表性。另外，白头翁皂苷B4、白头翁皂苷B5为白头翁药材饮片中的双糖链类皂苷，且一般在白头翁药材饮片中的含量最高，而黑海常春藤皂苷A1、白头翁皂苷D、白头翁皂苷A3、α-常春藤皂苷为单糖链类皂苷，因此，选用2个双糖链类皂苷和4个单糖链类皂苷作为白头翁药材饮片和白头翁汤对应的指标性成分将具有较好的代表性。
优选的，所述对照品储备液中白头翁皂苷B4的质量浓度为28.2ng/mL、所述对照品储备液中白头翁皂苷B5的质量浓度为19.8ng/mL、所述对照品储备液中黑海常春藤皂苷A1的质量浓度为33ng/mL、所述对照品储备液中白头翁皂苷D的质量浓度为23ng/mL、所述对照品储备液中白头翁皂苷A3的质量浓度为20.8ng/mL、所述对照品储备液中α-常春藤皂苷的质量浓度为23.4ng/mL、所述对照品储备液中秦皮素的质量浓度为48ng/mL、所述对照品储备液中秦皮甲素的质量浓度为41ng/mL、所述对照品储备液中秦皮乙素的质量浓度为29.2ng/mL、所述对照品储备液中黄柏碱的质量浓度为22.4ng/mL、所述对照品储备液中盐酸巴马汀的质量浓度为27.8ng/mL、所述对照品储备液中盐酸黄连碱的质量浓度为21.4ng/mL、所述对照品储备液中盐酸小檗碱的质量浓度为32.2ng/mL。
上述优选技术方案的有益效果是：
HPLC-MS/MS仪器具有很高的灵敏度，可以检测到很低浓度的样品，但由于仪器的灵敏度高，造成仪器在样品浓度过高的情况下被高浓度的样品污染，从而影响测定结果和仪器稳定。因此，需要严格控制样品溶液和对照品溶液的浓度。
优选的，步骤(2)中所述白头翁、所述黄柏、所述黄连和所述秦皮质量比为6:4.5:3:6；
所述浸泡的加水量为10倍质量，所述浸泡的时间30min；
所述一次加热至微沸后保持1h；
所述二次加热前加水量为8倍质量，所述二次加热至微沸保持1h；
所述离心的转速为12000rpm，时间为10min；
所述稀释加入体积比为50％的甲醇，稀释至所述白头翁浓度为6g/mL、所述黄柏浓度为4.5g/mL、所述黄连浓度为3g/mL、所述秦皮浓度为6g/mL。
上述优选技术方案的有益效果是：采用传统的白头翁汤提取方式即水煎煮法。提取前对药材进行切制，加热前浸泡30分钟，使水充分浸润药材，减少提取时气泡的产生。
优选的，步骤(3)中所述稀释具体为：移取对照品储备液100μL，置于10mL容量瓶中，用体积比为50％的甲醇定容，再采用倍数稀释法稀释，得到所述对照品溶液。
优选的，所述色谱条件为：色谱柱采用
Figure GDA0003397885530000041
BEHC18色谱柱(2.1×50mm,1.7μm)；流动相为采用A相-B相，所述A相为甲醇，所述B相为0.1wt％的甲酸-水溶液，梯度洗脱方式为：0～0.5min采用10wt％甲醇，0.5～2min采用1wt0％～90wt％甲醇，2～4min采用90％wt甲醇，4～6min采用90wt％～10wt％甲醇；梯度洗脱过程的体积流量0.2mL/min，柱温24.5℃，进样量为2.0μL。
上述优选技术方案的有益效果是：本发明采用上述色谱条件得到的分离效果好。
优选的，所述质谱条件为：采用电喷雾电离离子源，毛细管电压为3.0kV，离子源温度为150℃，脱溶剂温为550℃,脱溶剂气体流速为1000L·h－1,锥孔气流量50L·h－1，检测模式为正负离子模式。
上述优选技术方案的有益效果是：考察13种待测成分的质谱条件，在正负离子模式下，通过质谱调谐得到母离子、子离子、锥孔电压、碰撞电压，结果显示正离子模式下黄柏碱、盐酸巴马汀、盐酸黄连碱、盐酸小檗碱、白头翁皂苷B5有响应，其他8种成分在负离子模式下有响应。所以，采用电喷雾电离离子源，毛细管电压为3.0kV，离子源温度为150℃，脱溶剂温为550℃,脱溶剂气体流速为1000L·h－1,锥孔气流量50L·h－1，检测模式为正负离子模式。
优选的，所述白头翁皂苷B4的回归方程为y＝12.164x+43.834，相关系数R2＝0.9957；
所述白头翁皂苷B5的回归方程为y＝73.834x-11.033，相关系数R2＝0.9970；
所述黑海常春藤皂苷A1的回归方程为y＝44.629x-55.865，相关系数R2＝0.9991；
所述白头翁皂苷D的回归方程为y＝6.9434x-49.337，相关系数R2＝0.9914；
所述白头翁皂苷A3的回归方程为y＝102.38x+192.54，相关系数R2＝0.9978；
所述α-常春藤皂苷的回归方程为y＝15.224x-65.522，相关系数R2＝0.9988；
所述秦皮素的回归方程为y＝618.24x+1195.6，相关系数R2＝0.9999；
所述秦皮甲素的回归方程为y＝1442.6x+6347，相关系数R2＝0.9978；
所述秦皮乙素的回归方程为y＝788.53x+2138.4，相关系数R2＝0.9978；
所述黄柏碱的回归方程为y＝386005x+1E+06，相关系数R2＝0.9903；
所述盐酸巴马汀的回归方程为y＝55528x+188470，相关系数R2＝0.9984；
所述盐酸黄连碱的回归方程为y＝79352x+239697，相关系数R2＝0.9980；
所述盐酸小檗碱的回归方程为y＝151735x+857480，相关系数R2＝0.9978。
上述优选技术方案的有益效果是：13种化学成分的线性关系良好，R2均>0.9900，可以用于白头翁皂苷B4、白头翁皂苷B5、黑海常春藤皂苷A1、白头翁皂苷D、白头翁皂苷A3、α-常春藤皂苷、秦皮素、秦皮甲素、秦皮乙素、黄柏碱、盐酸巴马汀、盐酸黄连碱和盐酸小檗碱13种化学成分的含量测定。
经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明公开的一种白头翁汤多组分化学成分含量测定方法具有如下有益效果：
(1)本发明公开的测定方法操作简单，而且经过试验验证表明方法稳定性稿、重复性好、结果准确度高，实际应用价值高；
(2)本发明可以同时测量白头翁汤中白头翁皂苷B4、B5、D、A3、黑海常春藤皂苷A1、α-常春藤皂苷、秦皮甲素、秦皮乙素、秦皮素、黄柏碱、盐酸巴马汀、盐酸黄连碱、盐酸小檗碱13中化学成分的具体含量，有利于进一步完善白头翁汤的质量控制研究。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。
图1为实施例1提供的白头翁汤样品(A)和对照品中白头翁皂苷B4(B)对应的HPLC-MSMS色谱图；
图2为实施例1提供的白头翁汤样品(A)和对照品中白头翁皂苷B5(常春藤皂苷C)(B)对应的HPLC-MSMS色谱图；
图3为实施例1提供的白头翁汤样品(A)和对照品中黑海常春藤皂苷A1(B)对应的HPLC-MSMS色谱图；
图4为实施例1提供的白头翁汤样品(A)和对照品中白头翁皂苷D(B)对应的HPLC-MSMS色谱图；
图5为实施例1提供的白头翁汤样品(A)和对照品中白头翁皂苷A3(B)对应的HPLC-MSMS色谱图；
图6为实施例1提供的白头翁汤样品(A)和对照品中α-常春藤皂苷(B)对应的HPLC-MSMS色谱图；
图7为实施例1提供的白头翁汤样品(A)和对照品中秦皮素(B)对应的HPLC-MSMS色谱图；
图8为实施例1提供的白头翁汤样品(A)和对照品中秦皮甲素(B)对应的HPLC-MSMS色谱图；
图9为实施例1提供的白头翁汤样品(A)和对照品中秦皮乙素(B)对应的HPLC-MSMS色谱图；
图10为实施例1提供的白头翁汤样品(A)和对照品中黄柏碱(B)对应的HPLC-MSMS色谱图；
图11为实施例1提供的白头翁汤样品(A)和对照品中盐酸巴马汀(B)对应的HPLC-MSMS色谱图；
图12为实施例1提供的白头翁汤样品(A)和对照品中盐酸黄连碱(B)对应的HPLC-MSMS色谱图；
图13为实施例1提供的白头翁汤样品(A)和对照品中盐酸小檗碱(B)对应的HPLC-MSMS色谱图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
本发明实施例1公开了一种白头翁汤多组分化学成分含量测定方法，包括如下步骤：
(1)制备对照品溶液
精密称取白头翁皂苷B4、白头翁皂苷B5(常春藤皂苷C)、黑海常春藤皂苷A1、白头翁皂苷D、白头翁皂苷A3、α-常春藤皂苷、秦皮素、秦皮甲素、秦皮乙素、黄柏碱、盐酸巴马汀、盐酸黄连碱、盐酸小檗碱，加甲醇溶解，得到对照品储备液中白头翁皂苷B4的质量浓度为28.2ng/mL、白头翁皂苷B5的质量浓度为19.8ng/mL、黑海常春藤皂苷A1的质量浓度为33ng/mL、白头翁皂苷D的质量浓度为23ng/mL、白头翁皂苷A3的质量浓度为20.8ng/mL、中α-常春藤皂苷的质量浓度为23.4ng/mL、秦皮素的质量浓度为48ng/mL、秦皮甲素的质量浓度为41ng/mL、秦皮乙素的质量浓度为29.2ng/mL、黄柏碱的质量浓度为22.4ng/mL、盐酸巴马汀的质量浓度为27.8ng/mL、盐酸黄连碱的质量浓度为21.4ng/mL、盐酸小檗碱的质量浓度为32.2ng/mL，保存于4℃冰箱中备用；
(2)取白头翁、黄柏、黄连和秦皮除杂、切碎，先加10倍质量水浸泡30min、并经初次加热至微沸后保持1h，然后经初次过滤分别得到滤渣和初次滤液，取所述滤渣加8倍质量水经第二次加热至至微沸保持1h，再次过滤得到二次滤液，合并所述初次滤液和所述二次滤液后进行离心处理，离心的转速为12000rpm、时间为10min，取上清液加入50％的甲醇稀释即得白头翁汤样品；
其中，白头翁、黄柏、黄连和秦皮质量比为6:4.5:3:6；稀释至白头翁浓度为6g/mL、黄柏浓度为4.5g/mL、黄连浓度为3g/mL、秦皮浓度为6g/mL
(3)取所述对照品储备液然后，精密移取对照品储备液100μl，置于10ml容量瓶中，用50％甲醇定容，然后采用倍数稀释法，得到一定浓度的对照品溶液；然后分别按照色谱条件和质谱条件、采用高效液相色谱-串联质谱进行检测，得到的结果如图1～13所示；
其中色谱条件为：色谱柱采用
Figure GDA0003397885530000082
BEHC18色谱柱(2.1×50mm,1.7μm)；流动相采用A相-B相，所述A相为甲醇，所述B相为0.1wt％的甲酸-水溶液，梯度洗脱方式为：0～0.5min采用10％甲醇，0.5～2min采用10％～90％甲醇，2～4min采用90％甲醇，4～6min采用90％～10％甲醇；梯度洗脱过程的体积流量0.2mL/min，柱温24.5℃，进样量为2.0μL。
质谱条件为：采用电喷雾电离离子源，毛细管电压为3.0kV，离子源温度为150℃，脱溶剂温为550℃,脱溶剂气体流速为1000L·h－1,锥孔气流量50L·h－1，检测模式为正负离子模式；
具体的而言，白头翁皂苷B4、白头翁皂苷B5、黑海常春藤皂苷A1、白头翁皂苷D、白头翁皂苷A3、α-常春藤皂苷、秦皮素、秦皮甲素、秦皮乙素、黄柏碱、盐酸巴马汀、盐酸黄连碱和盐酸小檗碱的质谱检测参数如下表2所示；
表1
Figure GDA0003397885530000081
Figure GDA0003397885530000091
再以质量浓度为横坐标、峰面积积分值为纵坐标绘制标准曲线，进行线性回归，得到相关系数和回归方程如下表2所示；
表2
Figure GDA0003397885530000092
Figure GDA0003397885530000101
(4)取白头翁汤样品按照所述色谱条件和所述质谱条件采用高效液相色谱-串联质谱进行检测，得到的结果如图1-13所示，然后根据步骤(3)得到的回归方程，分别进行计算，得到各化学成分含量。共进行四组试验，得到的结果如下表3所示。
表3
Figure GDA0003397885530000102
Figure GDA0003397885530000111
对比例1
对比例1公开的技术方案与实施例1相同，除将步骤(2)替换为：取白头翁药材除杂、切碎，先加水浸泡并经初次加热至沸腾，然后经初次过滤分别得到滤渣和初次滤液，取所述滤渣加水经第二次加热至沸腾，再次过滤得到二次滤液，合并所述初次滤液和所述二次滤液后进行离心处理，取上清液稀释即得白头翁样品。共进行四组试验，得到的结果如下表4所示。
表4
Figure GDA0003397885530000112
对比例2
对比例2公开的技术方案与实施例1相同，仅将步骤(2)替换为取黄柏、黄连和秦皮除杂、切碎，先加水浸泡并经初次加热至沸腾，然后经初次过滤分别得到滤渣和初次滤液，取所述滤渣加水经第二次加热至沸腾，再次过滤得到二次滤液，合并所述初次滤液和所述二次滤液后进行离心处理，取上清液稀释即得去白头翁汤样品。共进行四组试验，得到的结果如下表5所示。
表5
Figure GDA0003397885530000113
Figure GDA0003397885530000121
需要说明的是：
其中采用的实验仪器包括，Xevo TQ-XS超高效液相色谱/三重四级杆串联质谱联用仪，美国Waters公司；SQP型十万分之一电子天平，赛多利斯科学仪器(北京)有限公司；JA2003型电子天平，上海浦春计量仪器有限公司；Genius NM32LA 230V氮气发生器，PeakScientific公司；DZTW型电热套，北京市永光明医疗仪器有限公司；Centrifuge5424R离心机，eppendorf公司。
其中涉及的实验材料，对照品白头翁皂苷B4(批号PS010748)、白头翁皂苷B5(常春藤皂苷C)(批号PS010727，质量分数>98.0％)、黑海常春藤皂苷A1(批号PS001149，质量分数>98.0％)、白头翁皂苷D(批号PS190923-03，质量分数>93.0％)、白头翁皂苷A3(批号PS011161，质量分数>98.0％)、α-常春藤皂苷(批号PS000085，质量分数>98.0％)、秦皮甲素(批号PS011025)、秦皮乙素(批号PS011505)、秦皮素(批号PSOOO762，质量分数>98.0％)、黄柏碱(批号PS000447，质量分数>98.0％)，盐酸巴马汀(批号PS020011，质量分数>98.0％)、盐酸黄连碱(批号PS190923-04，质量分数>95.0％)，盐酸小檗碱(批号PS001003，质量分数>98.0％)、均购于成都普思生物科技股份有限公司；甲醇，色谱纯，购自赛默飞世尔科技(中国)有限公司；甲醇、甲酸为LC-MS级，购自赛默飞世尔科技(中国)有限公司；实验用水为屈臣氏饮用水，购自广州屈臣氏食品饮料有限公司。
白头翁汤组方一共4味药材，具体为白头翁、黄连、黄柏、秦皮，按《中国药典》2020年版一部项下检测均合格，产地、批次等具体信息如下表6所示。经广西中医药大学许琼明教授鉴定，各药材均符合《中国药典》2020年版一部相关项下的性状规定，鉴定结果白头翁为毛茛科植物白头翁(Pulsatilla chinensis(Bge.)Regel)的干燥根，秦皮为木犀科植物白蜡树(Fraxinus chinensisRoxb)的干燥枝皮，黄连为毛茛科植物黄连(CoptischinensisFranch)干燥根茎.，黄柏为芸香科植物黄皮树(Phellodendron chinenseSchneid)的干燥树皮。
表6
Figure GDA0003397885530000131
效果验证
一、专属性考察
1、实验方法
取实施例1中白头翁汤样品和对照品溶液各一份，按实施例1中色谱条件和质谱条件进行测定，对比两种溶液中13种化学成分的保留时间，结果如图1～13所示。
2、结果
由图4结果可以得知，在同一检测条件下，样品溶液和对照品溶液在同一出峰时间分别出现了13种化学成分的色谱峰，这13种化学成分的出峰时间合适，峰高合适。
二、精确度试验
1、实验方法
取对照品溶液，按实施例1中的色谱条件及质谱条件进行连续进样6次，记录各组分峰面积，计算其RSD，结果见表7。
2、结果
由表7结果可以得知白头翁皂苷B4、白头翁皂苷B5(常春藤皂苷C)、黑海常春藤皂苷A1、白头翁皂苷D、白头翁皂苷A3、α-常春藤皂苷、秦皮素、秦皮甲素、秦皮乙素、黄柏碱、盐酸巴马汀、盐酸黄连碱、盐酸小檗碱13中成分对应峰面积的精确度RSD值均小于10％，表明仪器精密度良好。
三、稳定性试验
1、实验方法
按实施例1步骤(2)方法制备供试品溶液，分别于第0、6、12、18、24h按实施例1中的色谱条件及质谱条件进行测定。记录各组分峰面积，计算其RSD，结果如表7。
2、结果
由表7结果可以得知，白头翁皂苷B4、白头翁皂苷B5(常春藤皂苷C)、黑海常春藤皂苷A1、白头翁皂苷D、白头翁皂苷A3、α-常春藤皂苷、秦皮素、秦皮甲素、秦皮乙素、黄柏碱、盐酸巴马汀、盐酸黄连碱、盐酸小檗碱13中成分对应峰面积的稳定性RSD值均小于11.0％，表明本发明实施例1制得的供试品溶液在24h内稳定性良好。
四、重复性试验
1、实验方法
平行称取白头翁汤组药材6份按实施例1步骤(2)方法制备供试品溶液，按实施例1中的色谱条件及质谱条件进行进样测定。记录各组分峰面积，计算其RSD，结果如表7所示。
由表7结果可以得知，白头翁皂苷B4、白头翁皂苷B5(常春藤皂苷C)、黑海常春藤皂苷A1、白头翁皂苷D、白头翁皂苷A3、α-常春藤皂苷、秦皮素、秦皮甲素、秦皮乙素、黄柏碱、盐酸巴马汀、盐酸黄连碱、盐酸小檗碱13中成分对应峰面积的稳定性RSD值均小于15.0％，表明该分析方法重复性良好。
表7
Figure GDA0003397885530000151
五、加样回收率试验
1、实验方法
精密称取实施例1中白头翁汤组样品6份，每份1ml，按照测定的各组分含量分别加入等量的对照品，然后实施例1所述方法制备供试品溶液，接着按照实施例1所述色谱条件和质谱条件进样测定，记录峰面积并计算各成分质量浓度，计算加样回收率。
结果白头翁皂苷B4、白头翁皂苷B5、黑海常春藤皂苷A1、白头翁皂苷D、白头翁皂苷A3、α-常春藤皂苷、秦皮素、秦皮甲素、秦皮乙素、黄柏碱、盐酸巴马汀、盐酸黄连碱、盐酸小檗碱的平均加样回收率分别106.20％、105.57％、99.67％、101.98％、98.33％、111.10％、113.55％、100.09％、93.97％、102.51％、98.90％、97.98％、94.35％，各成分的平均回收率均在93％～114％之间，说明所用的实验方法良好。
从单个化合物分析发现合煎会导致白头翁皂苷B4、B5、A3、α-常春藤皂苷、黑海常春藤皂苷A1、秦皮甲素、生物碱类化合物的溶出量降低，而白头翁皂苷D、秦皮乙素、秦皮素的溶出量升高。从化合物种类分析发现合煎会导致皂苷类和生物碱的溶出量降低，香豆素类的溶出量升高。白头翁汤中的其他药材提高香豆素类成分的溶出，所以检测到白头翁汤中香豆素的含量升高。皂苷和生物碱的溶出量均降低，可能是皂苷与生物碱结合生成其他化合物，导致皂苷与生物碱的含量降低。
本说明书中各个实施例采用递进的方式描述，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处，各个实施例之间相同相似部分互相参见即可。对于实施例公开的装置而言，由于其与实施例公开的方法相对应，所以描述的比较简单，相关之处参见方法部分说明即可。
对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

Claims (5)

1.一种白头翁汤多组分化学成分含量测定方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)称取对照品，然后加入甲醇溶解，得到对照品储备液，所述对照品包括白头翁皂苷B4、白头翁皂苷B5、黑海常春藤皂苷A1、白头翁皂苷D、白头翁皂苷A3、α-常春藤皂苷、秦皮素、秦皮甲素、秦皮乙素、黄柏碱、盐酸巴马汀、盐酸黄连碱和盐酸小檗碱；
(2)取白头翁、黄柏、黄连和秦皮除杂、切碎，先加水浸泡并经初次加热至沸腾，然后经初次过滤分别得到滤渣和初次滤液，取所述滤渣加水经第二次加热至沸腾，再次过滤得到二次滤液，合并所述初次滤液和所述二次滤液后进行离心处理，取上清液稀释即得白头翁汤样品；
(3)取所述对照品储备液稀释得到的对照品溶液，然后按照色谱条件和质谱条件、采用高效液相色谱-串联质谱进行检测，再最后以质量浓度为横坐标、峰面积积分值为纵坐标绘制标准曲线，进行线性回归，得到相关系数和回归方程,所述色谱条件为：色谱柱采用
Figure FDA0004054711940000011
BEHC18色谱柱，规格为2.1×50mm,1.7μm；流动相采用A相-B相，所述A相为甲醇，所述B相为0.1wt％的甲酸-水溶液，梯度洗脱方式为：0～0.5min采用10wt％甲醇，0.5～2min采用10wt％～90wt％甲醇，2～4min采用90％wt甲醇，4～6min采用90wt％～10wt％甲醇；梯度洗脱过程的体积流量0.2mL/min，柱温24.5℃，进样量为2.0μL；
(4)取所述白头翁汤样品按照步骤(3)所述色谱条件和所述质谱条件采用高效液相色谱-串联质谱进行检测，然后根据步骤(3)得到的回归方程，分别进行计算，得到各化学成分含量。
2.根据权利要求1所述的一种白头翁汤多组分化学成分含量测定方法，其特征在于，所述对照品储备液中白头翁皂苷B4的质量浓度为28.2ng/mL、所述对照品储备液中白头翁皂苷B5的质量浓度为19.8ng/mL、所述对照品储备液中黑海常春藤皂苷A1的质量浓度为33ng/mL、所述对照品储备液中白头翁皂苷D的质量浓度为23ng/mL、所述对照品储备液中白头翁皂苷A3的质量浓度为20.8ng/mL、所述对照品储备液中α-常春藤皂苷的质量浓度为23.4ng/mL、所述对照品储备液中秦皮素的质量浓度为48ng/mL、所述对照品储备液中秦皮甲素的质量浓度为41ng/mL、所述对照品储备液中秦皮乙素的质量浓度为29.2ng/mL、所述对照品储备液中黄柏碱的质量浓度为22.4ng/mL、所述对照品储备液中盐酸巴马汀的质量浓度为27.8ng/mL、所述对照品储备液中盐酸黄连碱的质量浓度为21.4ng/mL、所述对照品储备液中盐酸小檗碱的质量浓度为32.2ng/mL。
3.根据权利要求2所述的一种白头翁汤多组分化学成分含量测定方法，其特征在于，步骤(2)中所述白头翁、所述黄柏、所述黄连和所述秦皮质量比为6:4.5:3:6；所述浸泡的加水量为10倍质量，所述浸泡的时间30min；所述一次加热至微沸后保持1h；所述二次加热前加水量为8倍质量，所述二次加热至微沸保持1h；所述离心的转速为12000rpm，时间为10min；所述稀释加入体积比为50％的甲醇，稀释至所述白头翁浓度为6g/mL、所述黄柏浓度为4.5g/mL、所述黄连浓度为3g/mL、所述秦皮浓度为6g/mL。
4.根据权利要求1所述的一种白头翁汤多组分化学成分含量测定方法，其特征在于，所述质谱条件为：采用电喷雾电离离子源，毛细管电压为3.0kV，离子源温度为150℃，脱溶剂温为550℃，脱溶剂气体流速为1000L·h-1，锥孔气流量50L·h-1，检测模式为正负离子模式。
5.根据权利要求4所述的一种白头翁汤多组分化学成分含量测定方法，其特征在于，所述白头翁皂苷B4的回归方程为y＝12.164x+43.834，相关系数R2＝0.9957；
所述白头翁皂苷B5的回归方程为y＝73.834x-11.033，相关系数R2＝0.9970；
所述黑海常春藤皂苷A1的回归方程为y＝44.629x-55.865，相关系数R2＝0.9991；
所述白头翁皂苷D的回归方程为y＝6.9434x-49.337，相关系数R2＝0.9914；
所述白头翁皂苷A3的回归方程为y＝102.38x+192.54，相关系数R2＝0.9978；
所述α-常春藤皂苷的回归方程为y＝15.224x-65.522，相关系数R2＝0.9988；
所述秦皮素的回归方程为y＝618.24x+1195.6，相关系数R2＝0.9999；
所述秦皮甲素的回归方程为y＝1442.6x+6347，相关系数R2＝0.9978；
所述秦皮乙素的回归方程为y＝788.53x+2138.4，相关系数R2＝0.9978；
所述黄柏碱的回归方程为y＝386005x+1E+06，相关系数R2＝0.9903；
所述盐酸巴马汀的回归方程为y＝55528x+188470，相关系数R2＝0.9984；
所述盐酸黄连碱的回归方程为y＝79352x+239697，相关系数R2＝0.9980；
所述盐酸小檗碱的回归方程为y＝151735x+857480，相关系数R2＝0.9978。
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