CN114755338B - 一种藿香及其制剂的检测方法 - Google Patents

Abstract

本申请提供了一种藿香及其制剂的检测方法，其特征在于，包括：采用高效液相色谱法检测藿香及其制剂中的咖啡酸、田蓟苷和刺槐素；所述高效液相色谱法色谱条件为：以甲醇为流动相A，以1％醋酸、1％磷酸和1％甲酸溶液中的一种为流动相B，进行梯度洗脱。本方法具有更好的精密度和重复性，操作性强，可以实现对藿香及其制剂的质量控制。有利于提高整体评价藿香相关工艺过程的科学性、合理性，更能整体控制藿香及其制剂的内在质量，确保藿香配方颗粒等制剂的临床疗效。

Description

一种藿香及其制剂的检测方法

技术领域

本发明属于医药技术领域，具体涉及一种藿香及其制剂的检测方法。

背景技术

藿香，别名土藿香、大叶薄荷、野藿香等，为地区民间常用药材，其来源为多年生草本植物唇形科藿香Agastache rugosa(Fisch.et Mey.)O.Ktze.的干燥地上部分。藿香为芳香性植物，广泛分布于湖南、河南、浙江、江苏、江西及四川等省，具有很好的营养价值、药用价值和经济价值，味辛、性微温，归于脾、胃、肺经，具有芳香化浊、理气和胃、和中止呕、发表解暑的功效，常被用于缓解或治疗暑湿、头痛发热、胸闷腹胀、呕吐、泻痢等症。

现有技术中，对于藿香的研究多集中于化学成分和挥发油测定，藿香的化学成分研究以甲基胡椒酚和胡椒酚甲醚为主，除挥发性成分外，藿香主要含有萜类、苯丙素类、黄酮类等化学成分。现有技术中难以有效比较和分析藿香及其制剂的差异与变化，难以整体评价和控制藿香及其制剂的质量。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种藿香及其制剂的检测方法，本方法具有更好的精密度和重复性，可以实现对藿香及其制剂的质量控制。

为实现上述目的，本发明的技术方案为一种藿香及其制剂的检测方法，包括：采用高效液相色谱法检测藿香及其制剂中的咖啡酸、田蓟苷和刺槐素；所述高效液相色谱法色谱条件为：以乙腈为流动相A，以1％醋酸、1％磷酸和1％甲酸溶液中的一种为流动相B，进行梯度洗脱。

本发明所述藿香及其制剂的检测方法还包括：将藿香及其制剂进行前处理，所述前处理具体为：将藿香及其制剂与溶剂混合，进行超声或回流提取，得到藿香及其制剂的供试品溶液。

本发明所述前处理过程中，将藿香及其制剂与溶剂混合，所述溶剂为30～100％甲醇溶液、30～95％乙醇溶液和水中的一种；在一个实施例中，将藿香及其制剂与溶剂混合，所述溶剂为甲醇；所述藿香及其制剂与溶剂的质量与体积比为(0.1～0.5)g:(25～100)mL；在一个实施例中，将藿香及其制剂与溶剂混合，所述藿香及其制剂与溶剂的质量与体积比为0.5g:100mL。

将藿香及其制剂与溶剂混合后，进行超声或回流提取，得到藿香及其制剂的供试品溶液，所述超声或回流提取时间为30～90min，优选为30～60min。在一个实施例中，将藿香或其制剂与溶剂混合，进行超声或回流提取，超声或回流提取时间为30min。在一个实施例中，将藿香及其制剂与溶剂混合后，进行超声提取，所述超声提取的功率为500W，频率为40kHz。

本发明所述前处理过程具有制备简单、选择范围宽的优点，实验结果表明，藿香及其制剂采用本发明提供的溶剂和提取方法进行提取，均能达到有效分离。

得到藿香及其制剂的供试品溶液后，采用高效液相色谱法检测藿香及其制剂中的咖啡酸、田蓟苷和刺槐素。

本发明所述高效液相色谱法色谱条件为：乙腈为流动相A，以1％醋酸、1％磷酸和1％甲酸溶液中的一种为流动相B，进行梯度洗脱。

在一个实施例中，本发明所述高效液相色谱条件为：以乙腈为流动相A，以1％醋酸溶液为流动相B，进行梯度洗脱。

在一个实施例中，本发明所述高效液相色谱条件为：以乙腈为流动相A，以1％醋酸溶液为流动相B，进行梯度洗脱，所述梯度洗脱过程中，流动相A和B的体积百分含量为：

0～10min，流动相A为20→30％，流动相B为80→70％；

10～20min，流动相A为30→40％，流动相B为70→60％；

20～30min，流动相A为40％，流动相B为60％；

30～40min，流动相A为40→70％，流动相B为60→30％。

本发明所述高效液相色谱法以十八烷基硅烷键合硅胶为色谱柱填充剂；在一个实施例中，色谱柱柱长为250mm，内径为4.6mm，粒径为5μm。

本发明所述高效液相色谱法检测波长为254～380nm；在一个实施例中，高效液相色谱法检测波长为330nm；流速为0.8～1.2mL/min；在一个实施例中，高效液相色谱法流速为1.0mL/min；柱温为30～40℃；在一个实施例中，高效液相色谱法柱温为35℃。

在一个实施例中，高效液相色谱法检测波长为330nm，流速为1.0mL/min，柱温为35℃。

实验结果表明，本发明采用的不同的流动相B、波长、柱温、流速范围内检测藿香及其制剂，藿香及其制剂中各成分均能达到有效分离的目的。

本发明采用所述高效液相色谱法检测藿香及其制剂、咖啡酸、田蓟苷和刺槐素，得到藿香及其制剂、咖啡酸、田蓟苷和刺槐素的色谱图，将所述藿香及其制剂、咖啡酸、田蓟苷和刺槐素的色谱图进行对比。

在一个实施例中，可以根据藿香及其制剂中咖啡酸、田蓟苷和刺槐素的保留时间以及共有峰的有无，对藿香及其制剂的质量进行评价，同时根据藿香及其制剂中咖啡酸、田蓟苷和刺槐素的峰面积，对藿香及其制剂的质量进行评价。

在一个实施例中，分别将咖啡酸、田蓟苷和刺槐素对照品溶于溶剂中，所述溶剂为藿香或其制剂进行前处理采用的溶剂，制成浓度为40μg/mL的对照品溶液，采用高效液相色谱法进行分析，得到咖啡酸、田蓟苷和刺槐素对照品的色谱图。

本发明提供了一种藿香及其制剂的检测方法，包括：采用高效液相色谱法检测藿香及其制剂中的咖啡酸、田蓟苷和刺槐素；所述高效液相色谱法色谱条件为：以乙腈为流动相A，以1％醋酸、1％磷酸和1％甲酸溶液中的一种为流动相B，进行梯度洗脱。本发明建立了统一的藿香及其制剂的检测方法，检测方法具有操作性强、分析便捷、稳定、精密度高和重复性强，可以对藿香及其制剂的色谱成分进行有效分离，实现对藿香及其制剂的质量控制，有利于提高整体评价藿香相关工艺过程的科学性、合理性，更能整体控制藿香及其制剂的内在质量，确保藿香配方颗粒等制剂的临床疗效。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。

图1为藿香药材HPLC谱图分析流动相考察图；

图2为藿香药材HPLC谱图检测波长考察图；

图3为藿香药材HPLC 3D色谱图考察图；

图4为藿香药材HPLC谱图流速考察图；

图5为藿香药材HPLC谱图柱温考察图；

图6为藿香药材HPLC谱图延迟性考察图；

图7为藿香药材HPLC谱图提取溶剂考察图；

图8为藿香药材HPLC谱图提取方法考察图；

图9为藿香药材HPLC谱图提取时间考察图；

图10为藿香药材HPLC谱图提取溶剂加入量考察图；

图11为藿香药材特征图谱色谱峰指认；

图12为藿香药材HPLC分析仪器类型考察；

图13为藿香药材HPLC分析色谱柱类型考察；

图14为不同批次藿香药材HPLC特征图谱；

图15为藿香药材HPLC对照图谱；

图16为藿香标准汤剂HPLC谱图提取溶剂考察图；

图17为藿香标准汤剂HPLC谱图提取方法考察图；

图18为藿香标准汤剂HPLC谱图提取时间考察图；

图19为藿香标准汤剂HPLC谱图提取溶剂加入量考察图；

图20为不同批次藿香标准汤剂特征图谱；

图21为藿香标准汤剂HPLC对照图谱；

图22为藿香配方颗粒特征图谱；

图23为藿香配方颗粒HPLC对照图谱；

图24为藿香药材、标准汤剂、配方颗粒HPLC特征图谱对比。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。但本发明不限于以下实施例，基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

仪器：高效液相色谱仪(安捷伦1260型超高效液相色谱仪、Waters 2695型高效液相色谱仪)、电子天平(梅特勒-托利多仪器有限公司，ME204E、XPE26)、超纯水机(上海摩勒科学仪器有限公司，细胞型1810A)、超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司，KQ5200DB型，600W，40KHz)、电子恒温水浴锅(北京中兴伟业仪器有限公司，DZKW型)、色谱柱(Agilent5TC-C18(2)250×4.6mm，5μm；Phenomenex 100-5-C18 250×4.6mm，5μm；岛津InterSustainC18 250×4.6mm，5μm)。

试剂：乙腈和醋酸为色谱纯，水为超纯水，其余试剂均为分析纯。

样品：藿香药材粗粉(四川新绿色药业科技发展有限公司制备，批号：XLS202107214～XLS202107230)，藿香标准汤剂冻干粉(四川新绿色药业科技发展有限公司制备，批号：HXBT211201～HXBT211217)，藿香配方颗粒(四川新绿色药业科技发展有限公司制备，批号：2006010、2006011和2006012)。

对照品：田蓟苷(四川普西奥标物科技有限公司，批号：M2109001，纯度为99.11％)、刺槐素(四川普西奥标物科技有限公司，批号：U40-1004416-02)、咖啡酸(中国食品药品检定研究院，批号：110885-201703)。

实施例1：

藿香药材HPLC检测方法包括以下步骤：

1、色谱条件与系统适用性试验：

1.1供试品溶液的制备：取藿香药材粗粉约0.5g，精密称定，置于具塞锥形瓶中，加入25mL甲醇，采用超声处理(功率500W，频率40kHz)30min，放冷，过滤，取续滤液，得到供试品溶液。

对照品溶液的制备：分别取咖啡酸、田蓟苷和刺槐素对照品适量，精密称定，采用甲醇分别制成浓度为40μg/mL的对照品溶液。

分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液各10μL，注入液相色谱仪，进行测定与分析。

1.2HPLC分析色谱条件：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(柱长为250mm，内径为4.5mm，粒度为5.0μm)；以乙腈为流动相A，以1.0％醋酸为流动相B，按照下表进行梯度洗脱，流动相梯度如表1所示，表1为实施例采用的流动相梯度。

表1实施例采用的流动相梯度

1.3流动相类型考察：在1.2所述HPLC分析色谱条件下，考察了3种不同流动相下供试品溶液的分离效果，流动相分别为：乙腈-1％醋酸、乙腈-1％磷酸和乙腈-1％甲酸，检测波长为330nm，流速为1.0mL/min，柱温为35℃。不同流动相下藿香药材HPLC谱图如图1所示，图1为藿香药材HPLC谱图分析流动相考察图，结果表明，1％醋酸溶液梯度洗脱条件下色谱峰基线较平稳，峰形较好。因此暂将乙腈-1％醋酸溶液梯度洗脱作为藿香特征图谱测定方法的流动相。

1.4检测波长考察：在1.2所述HPLC分析色谱条件下，考察了4种不同检测波长下供试品溶液的分离效果，检测波长分别为：380nm、330nm、300nm和254nm，流动相为乙腈-1％醋酸，流速为1.0mL/min，柱温为35℃。不同检测波长下藿香药材HPLC谱图如图2所示，不同检测波长下藿香药材HPLC 3D色谱图如图3所示，图2为藿香药材HPLC谱图检测波长考察图，图3为藿香药材HPLC 3D色谱图考察图，结果表明，330nm条件下色谱峰峰形较好。因此，暂时选择检测波长为330nm。

1.5流速考察：在1.2所述HPLC分析色谱条件下，考察了3种不同流速下供试品溶液的分离效果，流速分别为：0.8mL/min、1.0mL/min和1.2mL/min，流动相为甲醇-1％醋酸，检测波长为330nm，柱温为35℃，不同流速下藿香药材HPLC谱图如图4所示，图4为藿香药材HPLC谱图流速考察图，结果表明，流速为0.8mL/min、1.0mL/min和1.2mL/min时，色谱图峰形均较好，分离度均适中。因此，暂将流速确定为1.0mL/min。

1.6柱温考察：在1.2所述HPLC分析色谱条件下，考察了3种不同柱温下供试品溶液的分离效果，柱温分别为：30℃、35℃和40℃，流动相为乙腈-1％醋酸，检测波长为330nm，流速为1.0mL/min，不同柱温下藿香药材HPLC谱图如图5所示，图5为藿香药材HPLC谱图柱温考察图，结果表明，柱温为30℃、35℃和40℃时，色谱图峰形均较为对称，分离度均较好。因此，暂将柱温确定为35℃。

1.7延迟性考察：在HPLC分析色谱条件下，流动相为乙腈-1％醋酸，检测波长为330nm，流速1.0mL/min，柱温为35℃，进行延迟性考察实验，检测时间由40min延长至80min，不同检测时间长度下藿香药材HPLC谱图如图6所示，图6为藿香药材HPLC谱图延迟性考察图，结果表明，样品在40min后基本无色谱峰检测出。因此，将样品检测时间确定为40min。

2、供试品溶液的制备考察：

2.1HPLC分析色谱条件：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(柱长为250mm，内径为4.5mm，粒度为5.0μm)；以乙腈为流动相A，以1.0％醋酸为流动相B，按照实施例1中表1进行梯度洗脱，检测波长为330nm，流速1.0mL/min，柱温为35℃。

2.2提取溶剂考察：取藿香药材粗粉0.5g，精密称定，置于具塞锥形瓶中，分别将甲醇、70％甲醇、30％甲醇、95％乙醇、30％乙醇和水各25mL作为提取溶剂，密塞，称定重量，超声处理(功率600W，频率40kHz)30分钟，放冷，过滤，取滤液，即得不同提取溶剂的供试品溶液。

在HPLC分析色谱条件，考察了6种不同提取溶剂下藿香药材的分离效果，结果如图7所示，图7为藿香药材HPLC谱图提取溶剂考察图，结果表明，提取溶剂为甲醇时色谱图各峰分离效果均较佳，因此，暂定提取溶剂为甲醇。

2.3提取方法考察：精密称定藿香药材粗粉0.5g，置于具塞锥形瓶中，精密加入25mL甲醇，密塞，称定重量，进行提取，分别采用回流和超声的提取方法进行考察，提取时间为30分钟，提取结束后放冷，过滤，取滤液，即得不同提取方法的供试品溶液。

在HPLC分析色谱条件，考察了2种不同提取方法下藿香药材的分离效果，结果如图8所示，图8为藿香药材HPLC谱图提取方法考察图，结果表明，采用回流提取方法时效果较佳，因此，提取方法确定为回流提取。

2.4提取时间考察：精密称定藿香药材粗粉0.5g，置于具塞锥形瓶中，精密加入25mL甲醇，密塞，称定重量，采用回流提取，提取时间分别为30min、60min和90min，进行考察，放冷，采用甲醇补重，过滤，取滤液，即得不同提取时间的供试品溶液。

在HPLC分析色谱条件，考察了3种不同提取时间下藿香药材的分离效果，结果如图9所示，图9为藿香药材HPLC谱图提取时间考察图，结果表明，提取时间为30min时，色谱图峰形与分离度较好，达到分离要求，因此，提取时间确定为30min。

2.5提取溶剂加入量考察：精密称定藿香药材粗粉0.5g，置于具塞锥形瓶中，分别精密加入甲醇25mL、50mL、75mL和100ml进行考察，密塞，称定重量，回流处理30min，放冷，采用甲醇补重，过滤，取滤液，即得不同提取溶剂加入量的供试品溶液。

在HPLC分析色谱条件，考察了4种不同提取溶剂加入量下藿香药材的分离效果，结果如图10所示，图10为藿香药材HPLC谱图提取溶剂加入量考察图，结果表明，提取溶剂加入量为100mL时，各个色谱峰峰形与分离度较好，因此，溶剂量确定为100mL。

综上所述，藿香供试品溶液的制备方法确定为：取藿香药材粗粉0.5g，精密称定，置于锥形瓶中，加入100mL甲醇，回流处理30min，放冷，采用甲醇补重，摇匀，过滤，取滤液，即得供试品溶液。

3、方法学考察：

3.1色谱峰指认：根据步骤2确定的供试品溶液制备方法和采用的HPLC分析色谱条件，对藿香特征图谱峰进行定位，结果如图11所示，图11为藿香药材特征图谱色谱峰指认，其中1～7为7个特征峰，特征峰3(S)为S峰。结果表明，确定了7个特征峰，其中特征峰1为咖啡酸，特征峰3为田蓟苷，特征峰7为刺槐素，特征图谱中特征峰3田蓟苷峰面积最大。

3.2精密度试验：取藿香药材粗粉1份，约0.5g，精密称定，根据步骤2确定的供试品溶液制备方法和采用的HPLC分析色谱条件，连续进样6次，进行色谱峰分析，结果如表2和表3所示，表2为藿香药材HPLC分析保留时间的精密度考察，表3为藿香药材HPLC分析峰面积的精密度考察。结果表明，各峰保留时间的RSD值为0.17％～0.49％，各峰峰面积的RSD值为0.35％～2.69％，该仪器精密度良好。结合图11、表2和表3，发现田蓟苷峰面积大且稳定，因此以特征峰3为S峰。

表2藿香药材HPLC分析保留时间的精密度考察

表3藿香药材HPLC分析峰面积的精密度考察

3.3重复性考察：取藿香药材粗粉6份，每份约0.5g，精密称定，根据步骤2确定的供试品溶液制备方法和采用的HPLC分析色谱条件，进行色谱峰分析，结果如表4和表5所示，表4藿香药材HPLC分析相对保留时间的重复性考察，表5香药材HPLC分析相对峰面积比值的重复性考察。结果表明，各特征峰相对保留时间的RSD在0.09％～0.51％，各特征峰相对峰面积的RSD在0.49％～5.34％，表明本方法重复性良好。

表4藿香药材HPLC分析相对保留时间比值的重复性考察

表5藿香药材HPLC分析相对峰面积比值的重复性考察

3.4中间精密度考察：

3.4.1不同仪器考察：取藿香药材粗粉2份，每份约0.5g，精密称定，根据步骤2确定的供试品溶液制备方法和采用的HPLC分析色谱条件，分别在安捷伦1260和Waters 2695型高效液相色谱仪上进行测定，并进行色谱峰分析，结果如图12、表6和表7所示，图12为藿香药材HPLC分析仪器类型考察，表6为藿香药材HPLC分析不同仪器的相对保留时间考察，表7为藿香药材HPLC分析不同仪器的相对峰面积比值考察，结果表明，用上述2种仪器对供试品进行检测时，各特征峰相对保留时间的RSD在0.17％～1.82％，各特征峰相对峰面积的RSD在1.99％～21.56％，本方法适用于不同的仪器。

表6藿香药材HPLC分析不同仪器的相对保留时间比值考察

表7藿香药材HPLC分析不同仪器的相对峰面积比值考察

3.4.2不同人员和时间考察：根据步骤2确定的供试品溶液制备方法和采用的HPLC分析色谱条件，由不同人员(A和B)在不同时间(T1和T2)分别取藿香药材粗粉各2份，每份约0.5g，精密称定，制备供试品溶液，进行测定，结果如表8和表9所示，表8为藿香药材HPLC分析不同人员与时间的相对保留时间考察，表9为藿香药材HPLC分析不同人员与时间的相对峰面积比值考察。结果表明，不同样品制备人员和不同样品制备时间条件下，各特征峰相对保留时间的RSD在0.10％～0.19％，各特征峰相对峰面积的RSD在1.07％～8.21％。本方法结果具有精密性。

表8藿香药材HPLC分析不同人员与时间的相对保留时间比值考察

表9藿香药材HPLC分析不同人员与时间的相对峰面积比值考察

3.5耐用性考察：对色谱柱耐用性进行考察，根据步骤2确定的供试品溶液制备方法和采用的HPLC分析色谱条件，分别对色谱柱Agilent 5TC-C18(2)250×4.6mm，5μm；Phenomenex 100-5-C18250×4.6mm，5μm；岛津InterSustain C18 250×4.6mm，5μm进行考察。结果如图13、表10和表11所示，图13为藿香药材HPLC分析色谱柱类型考察，S1～S3依次为岛津、Phenomenex和安捷伦(Agilent)检测的藿香药材HPLC特征图谱，表10藿香药材HPLC不同色谱柱的相对保留时间考察，表11为藿香药材HPLC分析不同色谱柱的相对峰面积比值考察。结果表明，不同品牌色谱柱各特征峰相对保留时间的RSD在0.95～4.88％，不同品牌色谱柱各特征峰相对峰面积的RSD在1.91～19.99％，本方法具有耐用性。

表10藿香药材HPLC分析不同色谱柱的相对保留时间比值考察

表11藿香药材HPLC分析不同色谱柱的相对峰面积比值考察

3.6稳定性考察：根据步骤2确定的供试品溶液制备方法和采用的HPLC分析色谱条件，制备并分析供试品溶液，取同一供试品溶液，分别于0h、2h、4h、8h、12h和24h时测定。结果如表12和表13所示，表12为藿香药材HPLC不同测定时间的保留时间考察、表13为藿香药材HPLC不同测定时间的峰面积考察。结果表明，其相对应的特征峰保留时间的RSD在0.28％～0.48％，其相对应的特征峰峰面积的RSD在0.61％～8.47％，样品溶液在24小时内较稳定。

表12藿香药材HPLC不同测定时间的保留时间考察

表13藿香药材HPLC不同测定时间的峰面积考察

4、特征峰的确定及对照图谱的建立：

根据步骤2确定的供试品溶液制备方法和采用的HPLC分析色谱条件，对本品17样品(批号为XLS202107214～XLS202107230)进行特征图谱的测定，计算相对保留时间和相对峰面积，结果如图14和表14所示，图14为不同批次藿香药材HPLC特征图谱，其中S1(7)～S17(7)依次为批号XLS202107214～XLS202107230的藿香药材HPLC特征图谱，1～7为7个特征峰，特征峰1为咖啡酸，特征峰3(S)为田蓟苷，特征峰7为刺槐素，表15为不同批次藿香药材HPLC的相对保留时间比值。

结果表明，根据相对保留时间稳定性、各批次样品均能检出和峰值相对较高的原则，共选择了7个重复性较好的峰作为特征峰，以田蓟苷参照物相应的特征峰3为S峰，特征峰1～7相对保留时间的RSD为0.03％～0.06％。

最终规定：藿香药材HPLC特征图谱中应呈现7个特征峰，其中特征峰1与参照物咖啡酸峰保留时间相同，特征峰3与参照物田蓟苷峰保留时间相同，特征峰7与参照物刺槐素峰保留时间相同，与田蓟苷参照物相应的特征峰3为S峰，计算各特征峰与S峰的相对保留时间，相对保留时间应在规定值的±10％之内。规定值为：0.352(峰1)、0.635(峰2)、1.174(峰4)、1.413(峰5)、1.442(峰6)、1.887(峰7)。

表14藿香药材HPLC的相对保留时间比值

表15藿香药材HPLC的相对峰面积比值

采用中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012版)对17批藿香药材特征图谱进行合成，建立了藿香药材特征图谱的对照图谱。结果如图15所示，图15为藿香药材HPLC对照图谱，其中1～7为7个特征峰，特征峰1为咖啡酸，特征峰3(S)为田蓟苷，特征峰7为刺槐素。

实施例2：

藿香标准汤剂HPLC检测方法包括以下步骤：

1、色谱条件与系统适应性试验：

按照实施例1的方法进行色谱条件与系统适应性试验，其中藿香药材替换为藿香标准汤剂冻干粉，结果表明，得到藿香标准汤剂的HPLC分析色谱条件为：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(柱长为250mm，内径为4.5mm，粒度为5.0μm)；以乙腈为流动相A，以1.0％醋酸为流动相B，按照实施例1中表1进行梯度洗脱，检测波长为330nm，流速1.0mL/min，柱温为35℃。

2、供试品溶液的制备考察：

2.1提取溶剂考察：取藿香标准汤剂冻干粉0.1g，精密称定，置于具塞锥形瓶中，分别以甲醇、70％甲醇、30％甲醇、95％乙醇、30％乙醇和水各25mL作为提取溶剂进行考察，密塞，称定重量，进行超声处理(功率600W，频率40kHz)30分钟，放冷，过滤，取滤液，即得供试品溶液。

采用藿香标准汤剂的HPLC分析色谱条件进行分析，考察了6种不同提取溶剂下藿香标准汤剂的分离效果，结果如图16所示，图16为藿香标准汤剂HPLC谱图提取溶剂考察图，结果表明，提取溶剂为甲醇时，色谱图各峰分离效果均较佳，因此，暂定提取溶剂为甲醇。

2.2提取方法考察：取藿香标准汤剂冻干粉0.1g，精密称定，置于具塞锥形瓶中，精密加入25mL甲醇，密塞，称定重量，分别采用回流和超声的提取方法进行考察，提取时间为30分钟，放冷，过滤，取滤液，即得供试品溶液。

采用藿香标准汤剂HPLC分析色谱条件进行分析，考察了2种不同提取方法下藿香标准汤剂的分离效果，结果如图17所示，图17为藿香标准汤剂HPLC谱图提取方法考察图，结果表明，采用回流提取方法时效果较佳，因此，暂定提取方法为回流提取。

2.3提取时间考察：取藿香标准汤剂冻干粉0.1g，精密称定，置于具塞锥形瓶中，精密加入25mL甲醇，密塞，称定重量，采用回流提取，分别提取30min、60min和90min，进行考察，放冷，用甲醇补重，过滤，取滤液，即得供试品溶液。

采用藿香标准汤剂HPLC分析色谱条件进行分析，考察了3种不同提取时间下藿香标准汤剂的分离效果，结果如图18所示，图18为藿香标准汤剂HPLC谱图提取时间考察图，结果表明，提取时间为30min时，色谱图峰形与分离度较好，峰面积最大，因此，提取时间确定为30min。

2.4提取溶剂加入量考察：取藿香标准汤剂冻干粉0.1g，精密称定，置于具塞锥形瓶中，分别精密加入25mL、50mL、75mL和100mL甲醇进行考察，密塞，称定重量，回流处理30min，放冷，采用甲醇补重，过滤，取滤液，即得供试溶液。

采用藿香标准汤剂HPLC分析色谱条件进行分析，考察了4种不同提取溶剂加入量下藿香标准汤剂的分离效果，结果如图19所示，图19为藿香标准汤剂HPLC谱图提取溶剂加入量考察图，结果表明，提取溶剂加入量为75mL时，各个色谱峰峰形与分离度较好，因此，提取溶剂加入量选择75mL。

综上所述，藿香标准汤剂HPLC特征图谱供试品溶液的制备方法确定为：取藿香标准汤剂冻干粉0.1g，精密称定，置锥形瓶中，加入75mL甲醇，回流处理30min，放冷，采用甲醇补重，摇匀，过滤，取滤液，即得藿香标准汤剂供试品溶液。

3、特征峰的确定及对照图谱的建立：

将17批藿香标准汤剂样品(批号为HXBT211201～HXBT211217)制备成藿香标准汤剂供试品溶液，采用藿香标准汤剂HPLC分析色谱条件，进行特征图谱的测定，计算相对保留时间和相对峰面积。结果如图20、表16和表17所示，图20为不同批次藿香标准汤剂特征图谱，其中T1(7)～T17(7)依次为批号HXBT211201～HXBT211217的藿香标准汤剂HPLC特征图谱，1～7为7个特征峰，特征峰1为咖啡酸，特征峰3(S)为田蓟苷，特征峰7为刺槐素，表16为17批藿香标准汤剂HPLC的相对保留时间比值，表17为17批藿香标准汤剂HPLC的相对峰面积间比值。

结果表明，根据相对保留时间的稳定性、各批次样品均能检出且峰相对较高的原则，选择了7个重复性较好的峰作为特征峰，以田蓟苷参照物相应的特征峰3为S峰，特征峰1～特征峰7相对保留时间的RSD为0.00％～0.05％。

最终规定：供试品特征图谱中应呈现7个特征峰，其中特征峰1与参照物咖啡酸峰保留时间相同，特征峰3与参照物田蓟苷峰保留时间相同，特征峰7与参照物刺槐素峰保留时间相同，以田蓟苷参照物相应的特征峰3为S峰，计算各特征峰与S峰的相对保留时间，其相对保留时间应在规定值的±10％之内。规定值为：0.351(峰1)、0.633(峰2)、1.173(峰4)、1.412(峰5)、1.441(峰6)、1.881(峰7)。

表16 17批藿香标准汤剂HPLC的相对保留时间比值

表17 17批藿香标准汤剂HPLC的相对峰面积比值

采用中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012版)对17批藿香标汤特征图谱进行合成，建立了藿香标汤特征图谱的对照图谱。结果如图21所示，图21为藿香标准汤剂HPLC对照图谱，其中1～7为7个特征峰，特征峰1为咖啡酸，特征峰3(S)为田蓟苷，特征峰7为刺槐素。

实施例3：

藿香配方颗粒HPLC检测方法包括以下步骤：

1、色谱条件与系统适应性试验：

按照实施例1的方法进行色谱条件与系统适应性试验，其中藿香药材替换为藿香配方颗粒，结果表明，得到的藿香配方颗粒HPLC分析色谱条件为：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(柱长为250mm，内径为4.5mm，粒度为5.0μm)；以乙腈为流动相A，以1.0％醋酸为流动相B，按照实施例1中表1进行梯度洗脱，检测波长为330nm，流速1.0mL/min，柱温为35℃。

2、供试品溶液的制备考察：

取藿香配方颗粒0.1g，精密称定，置锥形瓶中，加入75mL甲醇，回流处理30min，放冷，采用甲醇补重，摇匀，过滤，取滤液，即得藿香配方颗粒供试品溶液。

3、特征峰的确定及对照图谱的建立

将3批藿香配方颗粒样品(批号：2006010、2006011、2006012)制备成藿香配方颗粒供试品溶液，采用藿香配方颗粒HPLC分析色谱条件，进行特征图谱的测定，计算相对保留时间和相对峰面积，结果如图22和表18、表19所示，图22为藿香配方颗粒特征图谱，其中K1(7)～K3(7)依次为批号2006010、2006011、2006012的藿香配方颗粒特征图谱，1～7为7个特征峰，特征峰1为咖啡酸，特征峰3(S)为田蓟苷，特征峰7为刺槐素，表18为3批藿香配方颗粒HPLC相对保留时间比值，表19为3批藿香配方颗粒HPLC相对峰面积比值。

根据相对保留时间的稳定性、各批次样品均能检出峰且峰相对较高的原则，共选择了7个重复性较好的峰作为特征峰。结果表明，以特征峰3作为S峰时，3批次藿香配方颗粒7个特征峰相对保留时间RSD范围在0.04％～0.76％。

最终规定：供试品特征图谱中应呈现7个特征峰，其中峰1与参照物咖啡酸峰保留时间相同，峰3与参照物田蓟苷峰保留时间相同，峰7与参照物刺槐素峰保留时间相同，与田蓟苷参照物相应的峰为S峰，计算各特征峰与S峰的相对保留时间，其相对保留时间应在规定值的±10％之内。规定值为：0.358(峰1)、0.643(峰2)、1.164(峰4)、1.404(峰5)、1.437(峰6)、1.859(峰7)。

表18 3批藿香配方颗粒HPLC相对保留时间比值

表19 3批藿香配方颗粒HPLC相对峰面积比值

色谱指纹图谱相似度评价系统(2012版)对17批藿香配方颗粒特征图谱进行合成，建立了藿香配方颗粒特征图谱的对照图谱。结果如图23所示，图23为藿香配方颗粒HPLC对照图谱，其中1～7为7个特征峰，特征峰1为咖啡酸，特征峰3(S)为田蓟苷，特征峰7为刺槐素。

实施例4：

采用中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012版)分别将实施例1～3得到的藿香药材、藿香标准汤剂和藿香配方颗粒特征图谱合成一张对照图谱，建立了藿香药材、藿香标准汤剂和藿香颗粒特征图谱的对照图谱。

结果如图24所示，图24为藿香药材、藿香标准汤剂和藿香颗粒HPLC特征图谱对比，其中S1(7)～S3(7)分别为藿香药材、藿香标准汤剂和藿香颗粒HPLC特征图谱对比，1～7为7个特征峰，特征峰1为咖啡酸，特征峰3(S)为田蓟苷，特征峰7为刺槐素。本发明能够分析藿香及其制剂的差异与变化，有利于整体评价藿香相关工艺过程的科学性、合理性，更能整体控制藿香及其制剂的内在质量，确保藿香配方颗粒的临床疗效。

以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要求的保护范围内。

Claims (4)

1.一种藿香及其制剂的检测方法，其特征在于，包括：

将藿香及其制剂与溶剂混合，进行超声或回流提取，得到藿香及其制剂的供试品溶液；所述溶剂为甲醇溶液；

采用高效液相色谱法检测藿香及其制剂中的咖啡酸、田蓟苷和刺槐素；

高效液相色谱法色谱条件为：以甲醇为流动相A，以1%醋酸为流动相B，进行梯度洗脱;

所述梯度洗脱过程中，流动相A和B的比例变化为：

0~10min，流动相A为20→30%，流动相B为80→70%；

10~20min，流动相A为30→40%，流动相B为70→60%；

20~30min，流动相A为40%，流动相B为60%；

30~40min，流动相A为40→70%，流动相B为60→30%；

高效液相色谱法检测波长为330nm；

所述高效液相色谱法以十八烷基硅烷键合硅胶为色谱柱填充剂。

2.根据权利要求1所述藿香及其制剂的检测方法，其特征在于，色谱柱柱长为250mm，内径为4.6mm，粒径为5μm。

3.根据权利要求1所述藿香及其制剂的检测方法，其特征在于，高效液相色谱法流速为0.8~1.2mL/min。

4.根据权利要求1所述藿香及其制剂的检测方法，其特征在于，高效液相色谱法柱温为30~40℃。