CN107478743A - 一种建立制吴茱萸标准汤剂指纹图谱的方法 - Google Patents

Abstract

一种建立制吴茱萸标准汤剂指纹图谱的方法包括标准汤剂的制备，供试品溶液的制备，对照品溶液的制备，高效液相色谱分析条件及通过指纹图谱软件分析所得制吴茱萸标准汤剂的对照指纹图谱。本发明具有方法简便，稳定，精密度高及重现性好等特点；且所得标准汤剂的指纹图谱的峰多，峰型好，易于鉴别，相似度高，准确可靠；所建立的对照指纹图谱能有效地表征制吴茱萸标准汤剂的质量，为制吴茱萸配方颗粒的质量提供了新的对照标准，从而提高制吴茱萸配方颗粒的质量和疗效。

Description

一种建立制吴茱萸标准汤剂指纹图谱的方法

技术领域

本发明涉及到指纹图谱的建立领域，具体的说是一种建立制吴茱萸标准汤剂指纹图谱的方法。

背景技术

吴茱萸为芸香科植物吴茱萸、石虎或疏毛吴茱萸的干燥近成熟果实，在8-11月果实尚未开裂时，剪下果枝，晒干或低温干燥，除去枝、叶、果梗等杂质，其有散寒止痛，降逆止呕，助阳止泻之功效，用于厥阴头痛，寒疝腹痛，寒湿脚气，经行腹痛，脘腹胀痛，呕吐吞酸，五更泄泻。吴茱萸主要含有生物碱、柠檬苦素、萜类、黄酮、香豆精、甾体、挥发油等多种成分，研究表明，对其中一种或几种活性成分进行检测，就有失全面，不能真实反映吴茱萸药效的整体性。要有效的控制吴茱萸及其成方制剂的质量，就必须对它的物质群整体予以控制。指纹图谱为整体控制中药材及中成药的质量提供了可能，而且已成为国际共识。

传统中药饮片越来越不能满足快节奏的生活方式，人们渴望通过现今的科学技术实现传统中药饮片全成分的转移，于是中药配方颗粒应用而生。为了保持中药配方颗粒与传统饮片汤剂的一致性，标准汤剂的概念被引入，标准汤剂的质量标准的研究变得尤为重要，而标准汤剂指纹图谱的研究又是重中之重。

发明内容

本发明的目的是提供一种建立制吴茱萸标准汤剂指纹图谱的方法，通过本发明的方法建立的标准汤剂指纹图谱，能够更好地控制制吴茱萸配方颗粒，从而弥补现有的制吴茱萸质量控制技术的不足。

本发明为实现上述技术目的所采用的技术方案为：一种建立制吴茱萸标准汤剂指纹图谱的方法，包括以下步骤：

1）取制吴茱萸，依次经浸泡、煎煮、滤过、浓缩、冷冻干燥后得到粉末，备用；

2）取步骤1）得到的粉末加水后进行超声处理，而后过滤，即得供试品溶液，备用；

3）取吴茱萸作为对照药材，重复步骤1）和步骤2）制得对照药材溶液，备用；

4）取绿原酸对照品加水制成绿原酸对照品溶液，备用；

5）分别精密吸取供试品溶液、对照药材溶液和绿原酸对照品溶液注入液相色谱仪中，分别测定三种溶液的指纹图谱；

6）以绿原酸对照品溶液色谱峰的保留时间为1，计算供试品溶液、对照药材溶液各峰的相对保留时间，用指纹图谱软件对所得的数据和图谱进行处理，即得制吴茱萸标准汤剂对照指纹图谱。

所述步骤1）中，浸泡、煎煮、滤过、浓缩、冷冻干燥的具体操作为：称制吴茱萸，将其用水浸泡30分钟，煎煮两次，第一次加水为制吴茱萸重量的8倍，煎煮30分钟，滤过，滤液备用；第二次加水为制吴茱萸重量的6倍，煎煮25分钟，滤过，滤液备用；将两次煎煮得到的滤液合并减压浓缩，直至形成投料量：浓缩液质量为1:1的清膏后，先在-40℃、40Pa条件下预冻1h，而后在-50-60℃、15-25Pa条件下冻干成粉末；所述投料量：浓缩液质量投料量是指，称取的制吴茱萸重量与最后形成的清膏重量比例为1:1。

本发明所述步骤1）中制吴茱萸在浸泡之前先经过以下处理：将制吴茱萸浸泡在温度为50-60℃的乙酸钠、硫酸钾、维生素C和谷氨酸的乙醇溶液中2-4h，浸泡结束后，采用600-800MHz的微波对其进行处理2-3min，而后过滤并用清水清洗，即完成对制吴茱萸的处理；所述乙酸钠、硫酸钾、维生素C和谷氨酸的乙醇溶液是指，按照重量比，取4-6份的乙酸钠、3-5份的硫酸钾、1-2份的维生素C和2-3份的谷氨酸与40-50份的乙醇溶液混合形成。

本发明所述步骤2）中供试品溶液的具体制备方法为：精密称定步骤1）制得的粉末0.4 g，精密加入水25mL，称定重量，以170KHz的超声频率超声处理30min，冷却后再次称定重量，用水补足减失的重量，摇匀后过滤，滤液再用0.45微米的微孔滤膜滤过，滤液即为供试品溶液。

本发明所述步骤4）中绿原酸对照品溶液的具体制备方法为：取绿原酸适量，精密称定，加水制成每1毫升溶液中含绿原酸30微克，即得绿原酸对照品溶液。

本发明所述步骤6）中的制吴茱萸标准汤剂对照指纹图谱的共有峰不少于21个。

本发明所述步骤5）中，指纹图谱测定的色谱条件为：色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，流动相为甲醇和质量浓度0.1%的磷酸溶液，检测波长为254nm，柱温为30℃，采集75min的检测数据。流动相按附图1所示的梯度进行洗脱。

本发明所述步骤5）中，分别精密吸取供试品溶液、对照药材溶液和绿原酸对照品溶液的量各为10微升。

与现有技术相比，本发明具有以下优点：

1）本发明以制吴茱萸标准汤剂建立起来的HPLC指纹图谱，代表了制吴茱萸的大部分药理活性成分，能反映制吴茱萸汤剂整体特征，可作为制吴茱萸配方颗粒或其他成方制剂质量检测和质量控制的标准指标之一；

2）本发明的方法具有简便、稳定、精密度高及重现性好等特点，而且所得标准汤剂指纹图谱的峰多，峰型好，易于鉴别，相似度高，准确可靠；

3）本发明先将制吴茱萸经过乙酸钠、硫酸钾、维生素C和谷氨酸的乙醇溶液浸泡和微波预处理，然后再经过浸泡、煎煮、滤过、浓缩、冷冻干燥后得到粉末后制成供试品溶液，从而使得色谱图中峰数量和峰的面积大幅度增加，其原理如下：

乙酸钠、硫酸钾、维生素C和谷氨酸分散在乙醇中，在制吴茱萸浸泡时，能够渗入到细胞内部，在体系中结合水分子，发生水合作用，使体系的粘性增加，同时提高了细胞的内部压力，在微波处理时，能够使细胞膜破损，这样在煎煮过程中，能够使其内的有效成分能够更好地进入到水中；而利用乙醇作溶剂，能够防止在预处理过程中，制吴茱萸内的有效成分提前进入到乙醇中，进而导致最后的色谱图中峰的数量和面积减小（如附图3所示）。

附图说明

图1为指纹图谱测定时流动相的洗脱梯度；

图2为实施例4中15批制吴茱萸标准汤剂指纹图谱的相似度计算表；

图3为对比实验1的色谱图；

图4为对比实验2的色谱图；

图5为制吴茱萸标准汤剂分别在215nm、254nm、290nm、320nm波长处的色谱图；

图6为制吴茱萸标准汤剂的DAD全扫描3D图；

图7为制吴茱萸标准汤剂分别在30℃、35℃、40℃下的色谱图；

图8为实施例4中15批制吴茱萸标准汤剂指纹图谱的叠加图；

图9为本发明最终得到的制吴茱萸标准汤剂对照图谱。

具体实施方式

为使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的以及有益效果易于明白了解，下面结合具体实施方式，进一步阐述本发明。

一种建立制吴茱萸标准汤剂指纹图谱的方法，包括以下步骤：

1）取制吴茱萸，依次经浸泡、煎煮、滤过、浓缩、冷冻干燥后得到粉末，备用；

2）取步骤1）得到的粉末加水后进行超声处理，而后过滤，即得供试品溶液，备用；

3）取吴茱萸作为对照药材，重复步骤1）和步骤2）制得对照药材溶液，备用；

4）取绿原酸对照品加水制成绿原酸对照品溶液，备用；

5）分别精密吸取供试品溶液、对照药材溶液和绿原酸对照品溶液注入液相色谱仪中，分别测定三种溶液的指纹图谱；

6）以绿原酸对照品溶液色谱峰的保留时间为1，计算供试品溶液、对照药材溶液各峰的相对保留时间，用指纹图谱软件对所得的数据和图谱进行处理，即得制吴茱萸标准汤剂对照指纹图谱。

以上为本发明的基本实施方式，可在以上基础上做进一步的改进、优化和限定：

如，所述步骤1）中，浸泡、煎煮、滤过、浓缩、冷冻干燥的具体操作为：称制吴茱萸，将其用水浸泡30分钟，煎煮两次，第一次加水为制吴茱萸重量的8倍，煎煮30分钟，滤过，滤液备用；第二次加水为制吴茱萸重量的6倍，煎煮25分钟，滤过，滤液备用；将两次煎煮得到的滤液合并减压浓缩，直至形成投料量：浓缩液质量为1:1的清膏后，先在-40℃、40Pa条件下预冻1h，而后在-50-60℃、15-25Pa条件下冻干成粉末；所述投料量：浓缩液质量投料量是指，称取的制吴茱萸重量与最后形成的清膏重量比例为1:1；

又如，本发明所述步骤1）中制吴茱萸在浸泡之前先经过以下处理：将制吴茱萸浸泡在温度为50-60℃的乙酸钠、硫酸钾、维生素C和谷氨酸的乙醇溶液中2-4h，浸泡结束后，采用600-800MHz的微波对其进行处理2-3min，而后过滤并用清水清洗，即完成对制吴茱萸的处理；所述乙酸钠、硫酸钾、维生素C和谷氨酸的乙醇溶液是指，按照重量比，取4-6份的乙酸钠、3-5份的硫酸钾、1-2份的维生素C和2-3份的谷氨酸与40-50份的乙醇溶液混合形成；

再如，本发明所述步骤2）中供试品溶液的具体制备方法为：精密称定步骤1）制得的粉末0.4 g，精密加入水25mL，称定重量，以170KHz的超声频率超声处理30min，冷却后再次称定重量，用水补足减失的重量，摇匀后过滤，滤液再用0.45微米的微孔滤膜滤过，滤液即为供试品溶液；

又再如，本发明所述步骤4）中绿原酸对照品溶液的具体制备方法为：取绿原酸适量，精密称定，加水制成每1毫升溶液中含绿原酸30微克，即得绿原酸对照品溶液；

又再如，本发明所述步骤6）中的制吴茱萸标准汤剂对照指纹图谱的共有峰不少于21个；

又再如，本发明所述步骤5）中，指纹图谱测定的色谱条件为：色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，流动相为甲醇和质量浓度0.1%的磷酸溶液，检测波长为254nm，柱温为30℃，采集75min的检测数据。流动相按附图1所示的梯度进行洗脱；

最后，本发明所述步骤5）中，分别精密吸取供试品溶液、对照药材溶液和绿原酸对照品溶液的量各为10微升。

下面结合附图以及具体的实施例对本发明的方案做进一步的阐述：

1．本实施例所用仪器与试药如下：

液相色谱仪Agilent1260、色谱柱Extent-C18（5微米，4.6×250mm）、电子分析天平梅特勒ME204E（万分之一）、梅特勒XS105DU（十万分之一）、甲醇为色谱纯，TEDIA；磷酸为分析纯，赛默飞世尔科技（中国）有限公司；

吴茱萸对照药材（批号：120909-201109）购自中国食品药品检定研究院；

绿原酸对照品（批号：110753-201716 纯度：99.3%）购自中国食品药品检定研究院；

2. 具体的实施方法和结果

2.1 色谱条件的选择

2.1.1 流动相和梯度洗脱程序的确定

本发明对流动相和梯度洗脱程序条件如附图1所示；

2.1.2 检测波长的确定

本发明选择了215、254、290和320这四个波长同时进行检测（见附图5），同时还用DAD检测器进行了全波长扫描（见附图6），结果表明：在320nm处，出峰明显较少；在215nm nm处出峰较多，但较为复杂且基线不平；在254nm 和290nm处各色谱峰均有较好的紫外吸收，色谱信息同样丰富，基线较平，但在290nm处，各峰的吸收值差异较大，因此选择254nm做为测定波长。

2.1.3柱温的选择

本发明分别设定柱温30℃，35℃，40℃进行了考察（见附图7），实验结果表明，在上述温度下的各色谱峰分离效果相同，为延长色谱柱填料的寿命，柱温选择30℃；

通过以上试验，确定了色谱条件如下：

色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；流动相：甲醇和0.1%磷酸溶液，检测波长：254nm，柱温：30℃。流动相按附图1中的梯度进行洗脱：

3. 制吴茱萸标准汤剂指纹图谱的测定

3.1制吴茱萸标准汤剂指纹图谱的测定

供试品溶液的制备：称制吴茱萸，将其用水浸泡30分钟，煎煮两次，第一次加水为制吴茱萸重量的8倍，煎煮30分钟，滤过，滤液备用；第二次加水为制吴茱萸重量的6倍，煎煮25分钟，滤过，滤液备用；将两次煎煮得到的滤液合并减压浓缩，直至形成投料量：浓缩液质量为1:1的清膏后，先在-40℃、40Pa条件下预冻1h，而后在-50--60℃、15-25Pa条件下冻干成粉末；所述投料量：浓缩液质量投料量是指，称取的制吴茱萸重量与最后形成的清膏重量比例为1:1；取上述粉末0.4 g（约相当于原药材2.0g），精密称定，精密加入水25mL，称定重量，170KHz超声 30min，放冷，再称定重量，用水补足减失的重量，摇匀，过滤，滤液用0.45微米微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。

对照溶液的制备：取吴茱萸对照药材2.0g，精密称定，按供试品溶液的制备项下的方法，自“加水25ml”起，同法制备对照药材溶液；取绿原酸对照品适量，精密称定，加水制成每1ml含绿原酸30微克的溶液，即得绿原酸对照品溶液。

参照物：选用绿原酸作为参照物。

分别精密吸取参照物溶液与供试品溶液各10微升，分别注入高效液相色谱仪，测定，记录75min的色谱图，即得所需指纹图谱。通过参照物峰确定了11号峰是绿原酸对照品峰。以绿原酸色谱峰的保留时间计算各峰的相对保留时间，同时用指纹图谱软件处理所得数据和图谱，即得对照指纹图谱。

3.1.1精密度试验

取本品粉末（过三号筛）约0.4g，精密称定，按正文供试品溶液的制备和测定法项下操作，连续进样6次，计算各共有峰的相对保留时间的RSD<1%，表明仪器精密度良好。

3.1.2稳定性试验

取本品粉末（过三号筛）约0.4g，精密称定，按正文供试品溶液的制备和测定法项下操作，分别在制备后放置0、2、4、8、12小时进样测定，计算各特征峰与S峰的相对保留时间的RSD<2%，表明供试品在12h内稳定。

3.1.3重复性试验

取本品粉末（过三号筛）约0.4g (共6份)，精密称定，按正文供试品溶液的制备和测定法项下操作，计算各特征峰与S峰的相对保留时间的RSD<1%，表明本方法重复性良好。

3.1.4制吴茱萸标准汤剂指纹图谱共有峰的确定及相似度计算

以绿原酸为对照品参照物溶液，对15批供试品色谱峰进行了分析，结果供试品指纹图谱中有21个共有峰（见附图8），其中峰11应与对照品参照物峰保留时间相一致；

这15批制吴茱萸标准汤剂指纹图谱的相似度计算结果如附图2所示；

3.2制吴茱萸标准汤剂对照图谱的建立

采用国家药典委员会颁布中药色谱指纹图谱相似度评价软件系2012.120723版，以15批制吴茱萸标准汤剂HPLC图谱色谱峰进行自动匹配建立对照图谱（见附图9）。

为了检测不同的提取方法对制吴茱萸的色谱图的影响，本发明做以下对比实验：

对比实验1

制吴茱萸供试品溶液样本1，其制备方法为：称制吴茱萸，将其用水浸泡30分钟，煎煮两次，第一次加水为制吴茱萸重量的8倍，煎煮30分钟，滤过，滤液备用；第二次加水为制吴茱萸重量的6倍，煎煮25分钟，滤过，滤液备用；将两次煎煮得到的滤液合并减压浓缩，直至形成投料量：浓缩液质量为1:1的清膏后，先在-40℃、40Pa条件下预冻1h，而后在-60℃、15Pa条件下冻干成粉末；所述投料量：浓缩液质量投料量是指，称取的制吴茱萸重量与最后形成的清膏重量比例为1:1；取上述粉末0.4 g（约相当于原药材2.0g），精密称定，精密加入水25mL，称定重量，170KHz超声 30min，放冷，再称定重量，用水补足减失的重量，摇匀，过滤，滤液用0.45微米微孔滤膜滤过，取续滤液，即得样本1；

制吴茱萸供试品溶液样本2，其制备方法与样本1相同，唯一区别在于称取制吴茱萸后，经过以下预处理操作：将制吴茱萸浸泡在温度为60℃的乙酸钠、硫酸钾、维生素C和谷氨酸的乙醇溶液中2h，浸泡结束后，采用600MHz的微波对其进行处理2min，而后过滤并用清水清洗，即完成对制吴茱萸的处理；所述乙酸钠、硫酸钾、维生素C和谷氨酸的乙醇溶液是指，按照重量比，取4份的乙酸钠、3份的硫酸钾、1份的维生素C和2份的谷氨酸与40份的乙醇溶液混合形成；

制吴茱萸供试品溶液样本3，其制备方法与样本2相同，唯一区别在于预处理浸泡时，采用60℃的乙酸钠、硫酸钾、维生素C和谷氨酸的水溶液中2h，浸泡结束后，采用600MHz的微波对其进行处理2min，而后过滤并用清水清洗，即完成对制吴茱萸的处理。

分别对三种样本注入色谱仪中进行检测，检测方法和条件以及对照溶液均与以上相同，其色谱结果如附图3所示；

由附图3的结果可以看出，样本2的共有峰峰值要远大于样本3，而样本3的共有峰峰值要远大于样本1，由此可知，采用本发明的预处理操作，可以提高检测的精确度，而在预处操作时，采用乙酸钠、硫酸钾、维生素C和谷氨酸的乙醇溶液浸泡的效果也远远好于采用乙酸钠、硫酸钾、维生素C和谷氨酸的水溶液浸泡。

为了进一步检测预处理时加入微波对制吴茱萸的色谱图的影响，本发明做以下对比实验：

对比实验2

制吴茱萸供试品溶液样本4，其制备方法与样本2相同，区别在于具体参数不同：将制吴茱萸浸泡在温度为50℃的乙酸钠、硫酸钾、维生素C和谷氨酸的乙醇溶液中4h，浸泡结束后，采用800MHz的微波对其进行处理3min，而后过滤并用清水清洗，即完成对制吴茱萸的处理；所述乙酸钠、硫酸钾、维生素C和谷氨酸的乙醇溶液是指，按照重量比，取6份的乙酸钠、5份的硫酸钾、2份的维生素C和3份的谷氨酸与50份的乙醇溶液混合形成；

制吴茱萸供试品溶液样本5，其制备方法与样本4相同，区别在于未经过微波处理：将制吴茱萸浸泡在温度为50℃的乙酸钠、硫酸钾、维生素C和谷氨酸的乙醇溶液中4h，浸泡结束后，过滤并用清水清洗，即完成对制吴茱萸的处理；所述乙酸钠、硫酸钾、维生素C和谷氨酸的乙醇溶液是指，按照重量比，取6份的乙酸钠、5份的硫酸钾、2份的维生素C和3份的谷氨酸与50份的乙醇溶液混合形成。

分别对两种样本注入色谱仪中进行检测，检测方法和条件以及对照溶液均与以上相同，其色谱结果如附图4所示；

由附图4的结果可以看出，样本4的共有峰峰值要远大于样本5，也就是说，采用微波处理后，可以提高检测的精确度。

以上显示和描述了本发明的主要特征、基本原理以及本发明的优点。本行业技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会根据实际情况有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。

Claims (6)

1.一种建立制吴茱萸标准汤剂指纹图谱的方法，其特征在于，包括以下步骤：

1）取制吴茱萸，依次经浸泡、煎煮、滤过、浓缩、冷冻干燥后得到粉末，备用；

2）取步骤1）得到的粉末加水后进行超声处理，而后过滤，即得供试品溶液，备用；

3）取吴茱萸作为对照药材，重复步骤1）和步骤2）制得对照药材溶液，备用；

4）取绿原酸对照品加水制成绿原酸对照品溶液，备用；

5）分别精密吸取供试品溶液、对照药材溶液和绿原酸对照品溶液注入液相色谱仪中，分别测定三种溶液的指纹图谱；

6）以绿原酸对照品溶液色谱峰的保留时间为1，计算供试品溶液、对照药材溶液各峰的相对保留时间，用指纹图谱软件对所得的数据和图谱进行处理，即得制吴茱萸标准汤剂对照指纹图谱。

2.根据权利要求1所述的一种建立制吴茱萸标准汤剂指纹图谱的方法，其特征在于，所述步骤1）中，浸泡、煎煮、滤过、浓缩、冷冻干燥的具体操作为：称制吴茱萸，将其用水浸泡30分钟，煎煮两次，第一次加水为制吴茱萸重量的8倍，煎煮30分钟，滤过，滤液备用；第二次加水为制吴茱萸重量的6倍，煎煮25分钟，滤过，滤液备用；将两次煎煮得到的滤液合并减压浓缩，直至形成投料量：浓缩液质量为1:1的清膏后，先在-40℃、40Pa条件下预冻1h，而后在-50-60℃、15-25Pa条件下冻干成粉末；所述投料量：浓缩液质量投料量是指，称取的制吴茱萸重量与最后形成的清膏重量比例为1:1。

3.根据权利要求1所述的一种建立制吴茱萸标准汤剂指纹图谱的方法，其特征在于，所述步骤1）中制吴茱萸在浸泡之前先经过以下处理：将制吴茱萸浸泡在温度为50-60℃的乙酸钠、硫酸钾、维生素C和谷氨酸的乙醇溶液中2-4h，浸泡结束后，采用600-800MHz的微波对其进行处理2-3min，而后过滤并用清水清洗，即完成对制吴茱萸的处理；所述乙酸钠、硫酸钾、维生素C和谷氨酸的乙醇溶液是指，按照重量比，取4-6份的乙酸钠、3-5份的硫酸钾、1-2份的维生素C和2-3份的谷氨酸与40-50份的乙醇溶液混合形成。

4.根据权利要求1所述的一种建立制吴茱萸标准汤剂指纹图谱的方法，其特征在于，所述步骤2）中供试品溶液的具体制备方法为：精密称定步骤1）制得的粉末0.4 g，精密加入水25mL，称定重量，以170KHz的超声频率超声处理30min，冷却后再次称定重量，用水补足减失的重量，摇匀后过滤，滤液再用0.45微米的微孔滤膜滤过，滤液即为供试品溶液。

5.根据权利要求1所述的一种建立制吴茱萸标准汤剂指纹图谱的方法，其特征在于，所述步骤4）中绿原酸对照品溶液的具体制备方法为：取绿原酸适量，精密称定，加水制成每1毫升溶液中含绿原酸30微克，即得绿原酸对照品溶液。

6.根据权利要求1所述的一种建立制吴茱萸标准汤剂指纹图谱的方法，其特征在于，所述步骤6）中的制吴茱萸标准汤剂对照指纹图谱的共有峰不少于21个。