CN102890124B - 桑葛制剂中总黄酮类和总生物碱类成分的指纹图谱构建方法及检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种桑葛制剂中总黄酮类成分和总生物碱类成分指纹图谱的构建方法以及桑葛制剂的质量检测方法。上述指纹图谱的构建方法包括：a)桑葛制剂溶液的制备，b)总黄酮类成分指纹图谱的构建，以及c)总生物碱类成分指纹图谱的构建。通过本发明提供的构建方法，得到了桑葛制剂中总黄酮类成分和总生物碱类成分的指纹图谱，该指纹图谱可用于桑葛制剂的质量控制。该构建方法和检测方法提高了桑葛制剂的质量控制标准，较为全面地反应了总黄酮类和总生物碱类活性成分的含量情况，而且具有稳定性好、重现性好的优点。

Description

桑葛制剂中总黄酮类和总生物碱类成分的指纹图谱构建方法及检测方法

技术领域

本发明涉及中药材的质量检测领域，具体而言，涉及一种对桑葛制剂中总黄酮类成分和总生物碱类成分的指纹图谱构建方法及对桑葛制剂的质量检测方法。 

背景技术

桑白皮为桑科植物桑Morus alba L.的干燥根皮，性甘、寒，归肺经，具有泻肺平喘、利水消肿的功能，主治肺热喘咳、水肿胀满尿少、面目肌肤浮肿。葛根为豆科多年生藤本植物野葛Pueraria lobata(Willd)Ohwi的干燥根，是中医临床常用药物，具有扩张冠状动脉、减慢心率、降低心肌耗氧量、改善心、脑血液循环等作用。 

在现有技术中，人们将桑白皮和葛根两味药材混合制成了桑葛制剂，并将其应用到降脂、脑卒中等中药组合物的制备中。由于桑葛制剂在中药组合物中的重要作用，所以其质量检测也一直受到人们的关注。现有的含量测定方法中仅以测定单一活性成分葛根素和1-脱氧野尻霉素(DNJ)为指标，这一方法虽然能够快速地检测出上述两种主要成分，但由于桑葛制剂中还存在着大量其他有效成分，而使得该药物在临床应用中的有效性和安全性无法得到较好的监控。 

发明内容

为了解决上述现有桑葛制剂检测方法不能全面反映总黄酮类和总生物碱类活性成分的含量，无法控制桑葛制剂质量的问题，本发明提供了一种桑葛制剂总黄酮类和总生物碱类活性成分的指纹图谱构建方法。 

本发明提供的桑葛制剂总黄酮类成分和总生物碱类活性成分指纹图谱的构建方法，包括以下步骤： 

a)将桑葛制剂制备成可用于液相色谱分离的桑葛制剂溶液； 

b)总黄酮类指纹图谱的构建 

将桑葛制剂溶液注入液相色谱仪，紫外检测器的波长为250nm；柱温为20-40℃；以乙腈为流动相A，以0.3％醋酸为流动相B进行梯度洗脱，得到总黄酮类指纹图谱；以及 

c)总生物碱类成分指纹图谱的构建 

称取预定量的桑葛制剂溶液，分别将硼酸盐缓冲液和芴甲氧酰氯乙腈溶液加入该桑葛制剂溶液，水浴下进行反应；再依次将甘氨酸溶液、醋酸水溶液加入到上述桑葛制剂溶液，过滤后取续滤液注入高效液相色谱仪，荧光检测器的激发波长为254nm，发射波长为309nm， 柱温在20-40℃的范围内；其中，高效液相色谱仪中的色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以乙腈为流动相C，0.1％醋酸为流动相D进行梯度洗脱，，得到总生物碱类成分指纹图谱。 

进一步地，步骤b)的梯度洗脱的程序如下： 

0～20分钟流动相A体积比保持为10.5％，流动相B体积比保持为89.5％； 

20～60分钟流动相A体积比由10.5％线性上升到40％，流动相B体积比由89.5％下降到60％； 

60～62分钟流动相A体积比由40％线性下降到10.5％，流动相B体积比由60％上升到89.5％； 

62～70分钟流动相A体积比保持为10.5％、流动相B体积比保持为89.5％，得到总黄酮类成分指纹图谱； 

进一步地，步骤c)的梯度洗脱程序如下： 

0～50分钟，流动相C体积比由30％上升到35％，流动相D体积比由70％下降到65％； 

50～60分钟，流动相C体积比保持为35％，流动相D体积比保持为65％； 

60～61分钟，流动相C体积比由35％上升到100％，流动相D体积比由65％下降到0％； 

61～70分钟，流动相C体积比保持为100％，流动相D体积比保持为0％； 

70～71分钟，流动相C体积比由100％下降到30％，流动相D体积比由0％上升到70％； 

进一步地，步骤b)包括通过将葛根素加入水中制备葛根素参照物溶液的步骤，上述葛根素参照物溶液与桑葛制剂溶液同时注入液相色谱仪。 

进一步地，步骤c)包括将1-脱氧野尻霉素盐酸加入水中制得1-脱氧野尻霉素盐酸参照物溶液的步骤；制得的1-脱氧野尻霉素盐酸盐参照物溶液与桑葛制剂溶液同时注入高效液相色谱仪。 

进一步地，总黄酮类成分的对照指纹图谱中具有17个共有指纹峰，相对保留时间分别为： 

1号峰为0.487±0.009，2号峰为0.536±0.004，3号峰即S峰为1.000±0.000，4号峰为1.099±0.030，5号峰为1.217±0.002，6号峰为1.308±0.001，7号峰为1.890±0.002，8号峰为2.268±0.008，9号峰为2.314±0.006，10号峰为2.445±0.010，11号峰为2.507±0.028，12号峰为2.549±0.010，13号峰为2.722±0.012，14号峰为2.771±0.012，15号峰为2.930±0.007，16号峰为3.423±0.019，17号峰为3.529±0.017。 

进一步地，当桑葛制剂中桑白皮与葛根的质量比为2∶1时，总生物碱类活性成分的对照指纹图谱中具有13个共有指纹峰，相对保留时间分别为： 

1号峰为0.514±0.03，2号峰即S峰为1.000±0.000，3号峰为1.401±0.001，4号峰为1.427±0.003，5号峰为1.478±0.009，6号峰为1.522±0.008，7号峰为1.917±0.012，8号峰为2.030±0.007，9号峰为2.212±0.022，10号峰为2.530±0.044，11号峰为2.617±0.008， 12号峰为3.630±0.017，13号峰为3.740±0.018。 

进一步地，当桑葛制剂中桑白皮与葛根的质量比为4∶1、1∶2和1∶4时，总生物碱类活性成分的对照指纹图谱中具有9个共有指纹峰，相对保留时间分别为： 

1号峰为0.512±0.018，2号峰即S峰为1.000±0.000，3号峰为1.450±0.003，4号峰为1.880±0.002，5号峰为2.154±0.005，6号峰为2.288±0.006，7号峰为2.469±0.006，8号峰为2.559±0.013，9号峰为2.621±0.010。 

本发明的另一目的在于提供一种桑葛制剂的质量检测方法，包括以下步骤： 

将待测桑葛制剂制成液相色谱用溶液； 

按照上述构建方法中的步骤b)和c)所描述的方法获得待测桑葛制剂的总黄酮类成分和总生物碱类成分的指纹图谱；以及 

将待测桑葛制剂的总黄酮类成分指纹图谱与上述总黄酮类成分的对照指纹图谱进行比较，以及将待测桑葛制剂的总生物碱类成分指纹图谱与上述总生物碱类成分的对照指纹图谱进行比较。 

采用本发明提供的指纹图谱构建方法，可以有效、准确地构建出桑葛制剂的总黄酮类成分指纹图谱和总生物碱类成分指纹图谱。该指纹图谱构建方法具有稳定性好、重现性好的优点。另外，通过构建得到的指纹图谱及对照指纹图谱对现有桑葛制剂进行质量控制，有利于对市场现有桑葛制剂的监控，提高了药品安全度，维护了广大消费者的权益。 

附图说明

构成本申请的一部分的附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中： 

图1当桑葛制剂中桑白皮和葛根的质量比为2∶1时，总黄酮类成分的对照指纹图谱； 

图2当桑葛制剂中桑白皮和葛根的质量比为2∶1时，总生物碱类成分的对照指纹图谱； 

图3当桑葛制剂中桑白皮和葛根的质量比为4∶1时，总黄酮类成分的对照指纹图谱； 

图4当桑葛制剂中桑白皮和葛根的质量比为4∶1时，总生物碱类成分的对照指纹图谱； 

图5当桑葛制剂中桑白皮和葛根的质量比为1∶2时，总黄酮类成分的对照指纹图谱； 

图6当桑葛制剂中桑白皮和葛根的质量比为1∶2时，总生物碱类成分的对照指纹图谱； 

图7当桑葛制剂中桑白皮和葛根的质量比为1∶4时，总黄酮类成分的对照指纹图谱； 

图8当桑葛制剂中桑白皮和葛根的质量比为1∶4时，总生物碱类成分的对照指纹图谱； 

图9桑葛制剂中总黄酮类成分空白指纹图谱，即不加入任何桑葛制剂或参照物，只加入各种试剂而得到的高效液相色谱；以及 

图10总生物碱类活性成分空白指纹图谱，即不加入任何桑葛制剂或参照物，只加入各 种试剂而得到的高效液相色谱。 

图11待测桑葛制剂(桑白皮提取物S20100721和葛根提取物G20100813)按照质量比2∶1混合的总黄酮类成分指纹图谱； 

图12待测桑葛制剂(桑白皮提取物S20100721和葛根提取物G20100813)按照质量比4∶1混合的总黄酮类成分指纹图谱； 

图13待测桑葛制剂(桑白皮提取物S20100721和葛根提取物G20100813)按照质量比1∶2混合后的总黄酮类成分指纹图谱； 

图14待测桑葛制剂(桑白皮提取物S20100721和葛根提取物G20100813)按照质量比1∶4混合后的总黄酮类成分对照指纹图谱； 

图15待测桑葛制剂(桑白皮提取物S20100721和葛根提取物G20100813)按照质量比2∶1混合的总生物碱类成分指纹图谱； 

图16待测桑葛制剂(桑白皮提取物S20100721和葛根提取物G20100813)按照质量比4∶1混合后的总生物碱类成分指纹图谱； 

图17待测桑葛制剂(桑白皮提取物S20100721和葛根提取物G20100813)按照质量比1∶2混合后的总生物碱类成分指纹图谱； 

图18待测桑葛制剂(桑白皮提取物S20100721和葛根提取物G20100813)按照质量比1∶4混合后的总生物碱类成分指纹图谱。 

具体实施方式

需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。下面将参考附图并结合实施例来详细说明本发明。 

本发明所涉及的桑葛制剂可以通过如下方法制备： 

(1)桑白皮药材经过切制或粉碎，用水提取，获得桑白皮药材水提取液，提取液浓缩后离心，上清液过强酸型阳离子交换树脂，收集0.1～1N的氨水洗脱液，洗脱液浓缩后得到桑白皮提取物，或经过喷雾干燥、减压或常压干燥得桑白皮提取物； 

(2)葛根药材经过切制或粉碎，用水提取，获得葛根药材的水提取液，提取液浓缩后离心，上清液继续浓缩成稠膏得到葛根提取物，或经过喷雾干燥、减压或常压干燥得葛根提取物； 

(3)将桑白皮提取物和葛根提取物混合均匀，得桑葛提取物；将桑葛提取物加入常规赋形剂，按照常规工艺，制成临床可接受的剂型，包括但不限于浓缩丸剂、胶囊剂、滴丸剂、颗粒剂、片剂、软胶囊剂、缓释剂、口服液体制剂或冻干粉针剂，制得桑葛制剂。 

当然，上述制备方法并不是唯一制备桑葛制剂的方法。本领域技术人员完全可以根据实践操作，采用其他桑葛制剂的制备方法。 

本发明的一个目的在于提供一种桑葛制剂总黄酮类成分和总生物碱类活性成分指纹图谱的构建方法，包括以下步骤： 

a)将桑葛制剂制备成可用于液相色谱分离的桑葛制剂溶液； 

可将桑葛制剂溶于水中形成液相色谱分离桑葛制剂溶液。桑葛制剂在水中具有一定的溶解度，可通过超声振荡的方法加快桑葛制剂在水中的溶解。在本发明的一个具体实施例中，发明人采用了功率250W，频率33KHZ进行超声辅助处理，提高了桑葛制剂的溶解度。也可采用其他溶剂来溶解桑葛制剂，以使得桑葛制剂可用于液相分离，本领域技术人员可根据具体情况而采用不同的溶剂，在这里就不再赘述。 

b)总黄酮类指纹图谱的构建：桑葛制剂中含有多种黄酮各类活性成分，现有技术中仅以单一葛根素作为检测指标，而本发明采用液相检测方法，利用梯度洗脱工艺将桑葛制剂中总黄酮类成分完全分离出来，全面地考察桑葛制剂中总黄酮的成分及含量组成。具体的构建方法为：将桑葛制剂溶液注入液相色谱仪，紫外检测器的波长为250nm；柱温为20-40℃；以乙腈为流动相A，以0.3％醋酸为流动相B进行梯度洗脱，即可得到总黄酮类指纹图谱； 

c)总生物碱类成分指纹图谱的构建：桑葛制剂中含有多种总生物碱类活性成分，现有技术中仅以DNJ作为检测指标，而本发明在荧光检测法的基础上，利用梯度洗脱工艺将桑葛制剂中总生物碱类成分完全分离出来，全面考察桑葛制剂总的生物碱类活性成分及含量组成。该指纹图谱的构建方法包括：称取预定量的桑葛制剂溶液，分别将硼酸盐缓冲液和芴甲氧酰氯乙腈溶液加入该桑葛制剂溶液，水浴下反应；再依次将甘氨酸溶液、醋酸水溶液加入到上述桑葛制剂溶液，过滤后取续滤液注入高效液相色谱仪，荧光检测器的激发波长为254nm，发射波长为309nm，柱温在20-40℃的范围内；其中，高效液相色谱仪中的色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以乙腈为流动相C，0.1％醋酸为流动相D进行梯度洗脱，得到总生物碱类成分指纹图谱。这里所称“预定量”，是指按照液相色谱的性能以及实际需求设定注射到液相色谱柱中的样品的浓度，而计算取出的桑葛制剂溶液的体积。 

本发明所采用的柱温、检测器的波长均为常规实验参数，本领域技术人员可根据具体操作在此范围内选择合适的参数。 

通过以上步骤，可测得桑葛制剂中总黄酮及总生物碱类活性成分的指纹图谱，不仅仅单一地以一种有效成分作为测试目标，而是全面地反映了制剂中总黄酮及总生物碱活性成分的含量，有利于控制桑葛制剂的质量。 

在本发明提供的一个具体实施方式中，步骤b)总黄酮类指纹图谱的构建方法具体包括： 

将桑葛制剂溶液注入液相色谱仪(十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂)，紫外检测器的波长为250nm；柱温为20-40℃；流速为0.8-1.0ml/min；以乙腈为流动相A，以0.3％醋酸为流动相B进行梯度洗脱；梯度洗脱的程序如下： 

0～20分钟流动相A体积比保持为10.5％，流动相B体积比保持为89.5％； 

20～60分钟流动相A体积比由10.5％线性上升到40％，流动相B体积比由89.5％下降到60％； 

60～62分钟流动相A体积比由40％线性下降到10.5％，流动相B体积比由60％上升到89.5％； 

62～70分钟流动相A体积比保持为10.5％、流动相B体积比保持为89.5％，得到总黄酮类成分指纹图谱； 

经过上述梯度洗脱方法，可以有效地将桑葛制剂中的总黄酮类成分梯度洗脱出来，所得图谱的分离度较高。 

优选地，在上述步骤中还可包括将葛根素加入水中制得葛根素参照物溶液的步骤；将葛根素参照物溶液与桑葛制剂溶液同时注入液相色谱仪。参照物的加入可用于考察指纹图谱的稳定程度和重现性，有助于色谱的辨认； 

在本发明提供的一个具体实施方式中，步骤c)总生物碱类成分指纹图谱的构建方法中的梯度洗脱程序如下： 

0～50分钟，流动相C体积比由30％上升到35％，流动相D体积比由70％下降到65％； 

50～60分钟，流动相C体积比保持为35％，流动相D体积比保持为65％； 

60～61分钟，流动相C体积比由35％上升到100％，流动相D体积比由65％下降到0％； 

61～70分钟，流动相C体积比保持为100％，流动相D体积比保持为0％； 

70～71分钟，流动相C体积比由100％下降到30％，流动相D体积比由0％上升到70％；得到总生物碱类成分指纹图谱。 

优选地，步骤c)中还包括将1-脱氧野尻霉素盐酸加入水中制得1-脱氧野尻霉素盐酸盐参照物溶液的步骤，1-脱氧野尻霉素盐酸盐参照物溶液与桑葛制剂溶液可同时注入高效液相色谱仪。 

在本发明提供的具体实施例中，通过对10批桑葛制剂的指纹图谱测试和比较分析，得到的总黄酮类成分对照指纹图谱(对照指纹图谱)中具有17个共有指纹峰的，相对保留时间分别为： 

1号峰为0.487±0.009，2号峰为0.536±0.004，3号峰即S峰为1.000±0.000，4号峰为1.099±0.030，5号峰为1.217±0.002，6号峰为1.308±0.001，7号峰为1.890±0.002，8号峰为2.268±0.008，9号峰为2.314±0.006，10号峰为2.445±0.010，11号峰为2.507±0.028，12号峰为2.549±0.010，13号峰为2.722±0.012，14号峰为2.771±0.012，15号峰为2.930±0.007，16号峰为3.423±0.019，17号峰为3.529±0.017。这些共有峰构成了桑葛制剂中总黄酮活性成分的指纹特征，可作为桑葛制剂总黄酮类活性成分的对照指纹图谱。 

在本发明提供的另一具体实施例中，当桑葛制剂中桑白皮与葛根的质量比为2∶1时，通过对10批桑葛制剂的指纹图谱测试和比较分析，总生物碱类活性成分共有模式指纹图谱(对照指纹图谱)中具有13个共有指纹峰，相对保留时间分别为： 

1号峰为0.514±0.03，2号峰即S峰为1.000±0.000，3号峰为1.401±0.001，4号峰为 1.427±0.003，5号峰为1.478±0.009，6号峰为1.522±0.008，7号峰为1.917±0.012，8号峰为2.030±0.007，9号峰为2.212±0.022，10号峰为2.530±0.044，11号峰为2.617±0.008，12号峰为3.630±0.017，13号峰为3.740±0.018。这些共有峰构成了桑葛制剂中总生物碱活性成分的指纹特征，可作为桑葛制剂总生物碱类活性成分的对照指纹图谱。 

在本发明提供的又一具体实施例中，当桑葛制剂中桑白皮与葛根的质量比为4∶1、1∶2和1∶4时，通过对10批桑葛制剂的指纹图谱测试和比较分析，得到的总生物碱类对照指纹图谱(对照图谱)中具有9个共有指纹峰，相对保留时间分别为： 

1号峰为0.512±0.018，2号峰即S峰为1.000±0.000，3号峰为1.450±0.003，4号峰为1.880±0.002，5号峰为2.154±0.005，6号峰为2.288±0.006，7号峰为2.469±0.006，8号峰为2.559±0.013，9号峰为2.621±0.010。这些共有峰构成了桑葛制剂中总生物碱活性成分的指纹特征，可作为桑葛制剂总生物碱类活性成分的对照指纹图谱。 

在得到上述对照指纹图谱的基础上，本发明提供了一种桑葛制剂的质量检测方法，包括以下步骤：将待测桑葛制剂制成可用于液相色谱分离的溶液；按照上述构建方法所记载的步骤b)和c)获得待测桑葛制剂中总黄酮类成分和总生物碱类成分的指纹图谱；将待测桑葛制剂总黄酮类成分的指纹图谱与总黄酮类成分对照指纹图谱进行比较，以及将待测桑葛制剂总生物碱类成分指纹图谱与总生物碱类成分对照指纹图谱进行比较。以《中药色谱指纹图谱相似度评价系统A版》计算待测桑葛制剂的指纹图谱与对照指纹图谱的相似性。相似度高，则表明待测桑葛制剂的质量较好；如果相似度低，则表明待测桑葛制剂的质量较差，总黄酮和总生物碱成分含量不达标。 

实施例1 桑葛制剂总黄酮类对照指纹图谱的构建 

实施例1所采用的10批桑白皮药材和葛根的产地主要为河南、河北、安徽、广西、湖南，上述品种经过鉴别，符合药典标准，无明显生物差异性，具体情况请见表1： 

表1 

	批号	产地	是否有生物差异性
				桑白皮	Y070609HN	河南	无
桑白皮	Y100513HB	河北	无
				桑白皮	Y100716HB	河北	无
桑白皮	Y101113HB	河北	无
				桑白皮	Y101229HB	河北	无
桑白皮	Y110104HN	湖南	无
				桑白皮	Y101230AH	安徽	无
桑白皮	Y100826HN	河南	无

[0093] 

桑白皮	Y101026HB	河北	无
				桑白皮	Y101102HN	河南	无
葛根	G110111HN	河南	无
				葛根	G110112HN	河南	无
葛根	G110112AH	安徽	无
				葛根	G110113AH	安徽	无
葛根	G110114AH	安徽	无
				葛根	G110117HN	河南	无
葛根	G110118HN	河南	无
				葛根	G110314AH	安徽	无
葛根	G110516HN	河南	无
				葛根	G110604HN	河南	无

表2示出了10批桑葛制剂中桑白皮和葛根的具体批号。

表2 

桑葛制剂编号	桑白皮批号	葛根批号
			1	Y070609HN	G110111HN
2	Y100513HB	G110112HN
			3	Y100716HB	G110112AH
4	Y101113HB	G110113AH
			5	Y101229HB	G110114AH
6	Y110104HN	G110117HN
			7	Y101230AH	G110118HN
8	Y100826HN	G110314AH
			9	Y101026HB	G110516HN
10	Y101102HN	G110604HN

所用仪器：SHIMADZU高效液相色谱仪包括LC-20AT色谱泵、SPD-M20A紫外检测器、CBM-20A控制器、DGU-20A5脱气机、SIL-20A自动进样器、CTO-10AS柱温箱、class-vp工 作站；色谱柱：Apollo-C18(250×4.6mm，5μm)分析柱。 

参照物溶液的制备：取葛根素参照物(中国药品生物制品检定所，批号：110752-200912，供含量测定用)适量，精密称定，加30％乙醇制成每1ml含80μg的溶液； 

1)桑葛制剂溶液的制备：根据桑白皮和葛根药材在总桑葛制剂中所占比例的不同，将每一批桑葛制剂按照质量比分别为2∶1、4∶1、1∶2、1∶4制得四种桑葛制剂。分给取上述四种桑葛制剂约0.05g，精密称定，置100ml具塞锥形瓶中，精密加入50ml水，称定重量，超声处理(功率250W，频率33KHZ)30分钟；放冷，再称定重量，用水补足减失的重量，摇匀，滤过，制得四种桑葛制剂溶液； 

2)色谱条件与系统适应性试验：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；紫外检测器波长为250nm，柱温为40℃，流速为1.0ml/min；以乙腈为流动相A，以0.3％醋酸为流动相B进行梯度洗脱；流动相梯度洗脱程序为： 

0～20分钟流动相A体积比保持为10.5％，流动相B体积比保持为89.5％； 

20～60分钟流动相A体积比由10.5％线性上升到40％，流动相B体积比由89.5％下降到60％； 

60～62分钟流动相A体积比由40％线性下降到10.5％，流动相B体积比由60％上升到89.5％；以及 

62～70分钟流动相A体积比保持为10.5％、流动相B体积比保持为89.5％。 

其中，指纹图谱完成时间为62分钟，62～70分钟为系统平衡时间。 

分别精密吸取葛根素对照品溶液与四个桑葛制剂溶液各10μl，注入液相色谱仪，按照上述色谱条件进行测定，记录70分钟色谱图，即得总黄酮成分的指纹色谱； 

3)经过对实施例1提供的10批桑葛制剂指纹图谱的比较和分析，确定总黄酮类成分的对照指纹图谱具有17个共有指纹峰，参照峰为葛根素S； 

17个共有指纹峰的相对保留时间分别为：1号峰为0.488±0.010，2号峰为0.535±0.005，3号峰即S峰为1.000±0.000，4号峰为1.100±0.031，5号峰为1.216±0.004，6号峰为1.307±0.006，7号峰为1.891±0.009，8号峰为2.267±0.046，9号峰为2.314±0.046，10号峰为2.448±0.024，11号峰为2.520±0.041，12号峰为2.552±0.027，13号峰为2.726±0.030，14号峰为2.774±0.030，15号峰为2.934±0.027，16号峰为3.427±0.037，17号峰为3.534±0.039。这些共有峰构成了桑葛制剂总黄酮类活性成分的指纹特征，可作为桑葛制剂总黄酮类活性成分的对照指纹图谱。 

附图1、附图3、附图5、附图7分别为2∶1、4∶1、1∶2、1∶4四种桑葛制剂所得总黄酮类成分的对照指纹图谱。 

4)为了验证本发明提供的桑葛制剂总黄酮成分指纹图谱构建方法的精密度、稳定性及重现性，对上述构建方法进行了以下实验，其结果如下： 

a.桑葛制剂总黄酮类指纹图谱精密度试验 

取同一桑葛制剂溶液(桑葛制剂2，桑白皮∶葛根＝1∶2)，按上述色谱条件连续进样5针，结果见表3。各指纹图谱比较相似度＞0.90，结果表明方法精密度良好。 

表3 桑葛制剂总黄酮类指纹图谱精密度考察结果 

	S1	S2	S3	S4	S5
						相似度	0.998	0.999	1.000	0.999	0.998

b.桑葛制剂总黄酮类指纹图谱稳定性试验 

取同一桑葛制剂溶液(桑葛制剂5，桑白皮∶葛根＝2∶1)，按上述色谱条件分别于0、8、16、24、36h进样，结果见表4。各指纹图谱比较相似度＞0.90，结果表明供试品桑葛制剂溶液在36h内稳定。 

表4 桑葛制剂总黄酮类指纹图谱稳定性考察结果 

	S1	S2	S3	S4	S5
						相似度	0.990	0.983	0.986	0.988	0.985

c.桑葛制剂总黄酮类指纹图谱重现性试验 

取同一桑葛制剂溶液(桑葛制剂1，桑白皮∶葛根＝4∶1)，分别制备5份桑葛制剂供试品溶液，按上述色谱条件进样，结果见表5。各指纹图谱比较相似度＞0.90，结果表明该方法的重现性良好。 

表5 桑葛制剂总黄酮类指纹图谱重现性考察结果 

	S1	S2	S3	S4	S5
						相似度	0.992	0.995	0.989	0.990	0.988

从上述实验可以看出，该指纹图谱的构建方法所得指纹图谱精密度、稳定性以及重现性都比较好。 

实施例2 对桑葛制剂中总黄酮类成分的质量检测方法 

待测桑葛制剂的来源： 

由桑白皮提取物S20100721(由批号为Y070609HN的桑白皮药材提取而得)和葛根提取物G20100813(由批号为G110118HN的葛根药材提取而成)按照药材比例2∶1、4∶1、1∶2、1∶4混合制成。 

所用仪器、参照物溶液、待测桑葛制剂溶液的制备与以及色谱条件均与实施例1相同。 

分别精密吸取参照物溶液与待测桑葛制剂溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，记录70分钟色谱图。待测桑葛制剂的总黄酮类成分的指纹图谱，请见附图11、12、13、14，上述指纹色谱分别对应桑白皮和葛根的质量比为2∶1、4∶1、1∶2、1∶4。 

以《中药色谱指纹图谱相似度评价系统A版》计算附图1、附图3、附图5、附图7所示的对照指纹图谱与待测桑葛制剂所得的指纹图谱进行比较。两者之间有良好的相似性，相似度＞0.85；此产品在总黄酮含量上满足桑葛制剂的要求。 

实施例3 桑葛制剂总生物碱类成分指纹图谱的构建 

所用仪器：SHIMADZU高效液相色谱仪包括LC-20AT色谱泵、RF-20A荧光检测器、CBM-20A控制器、DGU-20A5脱气机、SIL-20A自动进样器、CTO-10AS柱温箱、class-vp工作站；色谱柱：Cosmosil C18(250×4.6mm，5μm)分析柱 

参照物溶液的制备：精密称取1-脱氧野尻霉素盐酸盐对照品(Sigma公司，批号078K4062)适量，加水制成每1ml含4μg的溶液； 

1)桑葛制剂溶液的制备：分别将每批桑葛制剂按照桑白皮和葛根的质量比为2∶1，4∶1，1∶2，以及1∶4，制得四种桑葛制剂。称取上述桑葛制剂各约0.05g，精密称定，置100ml具塞锥形瓶中，精密加入50ml水，称定重量，超声处理(功率250W，频率33KHZ)30分钟；放冷，再称定重量，用水补足减失的重量，摇匀； 

2)色谱条件与系统适应性试验：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈为流动相C，以0.1％醋酸为流动相D进行梯度洗脱；荧光检测器激发波长为254nm，发射波长为309nm；柱温为20℃；流速为0.8ml/min；流动相梯度洗脱程序为： 

0～50分钟流动相C体积比由30％线性上升到35％，流动相D体积比由70％下降到65％； 

50～60分钟流动相C体积比保持为35％、流动相D体积比保持为65％； 

60～61分钟流动相C体积比由35％线性上升到100％，流动相D体积比由65％线性下降到0％； 

61～70分钟流动相C体积比保持为100％，流动相D体积比保持为0％； 

70～71分钟流动相C体积比由100％线性下降到30％，流动相D体积比由0％线性上升到70％； 

71～80分钟流动相C体积比保持为30％、流动相D体积比保持为70％。 

其中指纹图谱完成时间为70分钟，71～80分钟为系统平衡时间。 

精密吸取上述参照物溶液与桑葛制剂溶液各100μl，置10ml离心管中，分别精密加入硼酸盐缓冲液(0.4mol/L，pH8.5)100μl、芴甲氧酰氯乙腈溶液(5mmol/L)200μl，于30℃水浴下反应10min，再分别依次加入甘氨酸溶液(0.1mol/L)100μl，0.1％醋酸水溶液9.50ml，摇匀，滤过，取续滤液各10μl注入高效液相色谱仪，测定，记录80分钟色谱图，得到指纹图谱。 

3)对实施例1提供的10批不同来源的桑葛制剂(2∶1)进行了指纹图谱测试，最终确 认在此质量比例下，对照指纹图谱共有13个指纹峰，参照峰为1-脱氧野尻霉素(DNJ)S； 

13个共有指纹峰的相对保留时间分别为：1号峰为0.514±0.03，2号峰即S峰为1.000±0.000，3号峰为1.401±0.001，4号峰为1.427±0.003，5号峰为1.478±0.009，6号峰为1.522±0.008，7号峰为1.917±0.012，8号峰为2.030±0.007，9号峰为2.212±0.022，10号峰为2.530±0.044，11号峰为2.617±0.008，12号峰为3.630±0.017，13号峰为3.740±0.018。 

这些共有峰构成了桑葛制剂总生物碱类活性成分的指纹特征，可作为桑葛制剂总生物碱类活性成分的对照指纹图谱，如图2所示。 

4)本发明的发明人又对实施例1提供的10批不同来源的桑葛制剂(4∶1、1∶2和1∶4)进行了指纹图谱测试，对照指纹图谱共有9个指纹峰，参照峰为1-脱氧野尻霉素(DNJ)S； 

9个共有指纹峰的相对保留时间分别为：1号峰为0.512±0.018，2号峰即S峰为1.000±0.000，3号峰为1.450±0.003，4号峰为1.880±0.002，5号峰为2.154±0.005，6号峰为2.288±0.006，7号峰为2.469±0.006，8号峰为2.559±0.013，9号峰为2.621±0.010，这些共有峰构成了桑葛制剂总生物碱类活性成分的指纹特征，可作为桑葛制剂总生物碱类活性成分的对照指纹图谱，如图4，6，8所示。 

5)为了验证本发明提供的桑葛制剂总生物碱类活性成分指纹图谱构建方法的精密度、稳定性及重现性，对上述方法进行了以下实验，其结果如下： 

a.桑葛制剂总生物碱类活性成分指纹图谱精密度试验 

取同一供试品溶液(桑葛制剂3，桑白皮∶葛根＝4∶1)，按上述色谱条件连续进样5针，结果见表6。各指纹图谱比较相似度＞0.90，结果表明方法精密度良好。 

表6 桑葛制剂总生物碱类指纹图谱精密度考察结果 

	S1	S2	S3	S4	S5
						相似度	0.998	0.999	1.000	0.999	0.997

b.桑葛制剂总生物碱类指纹图谱稳定性试验 

取同一供试品溶液(桑葛制剂4，桑白皮∶葛根＝2∶1)，按上述色谱条件分别于0、8、16、24、36h进样，结果见表7。各指纹图谱比较相似度＞0.90，结果表明供试品溶液在36h内稳定。 

表7 桑葛制剂总生物碱类指纹图谱稳定性考察结果 

	S1	S2	S3	S4	S5
						相似度	0.992	0.985	0.987	0.982	0.984

c.桑葛制剂总生物碱类指纹图谱重现性试验 

取同一供试品(桑葛制剂7，桑白皮∶葛根＝1∶2)，分别制备5份供试品溶液，按上述色谱条件进样，结果见表8。各指纹图谱比较相似度＞0.90，结果表明该方法的重现性良好。 

表8 桑葛制剂总生物碱类指纹图谱重现性考察结果 

	S1	S2	S3	S4	S5
						相似度	0.992	0.982	0.990	0.988	0.985

实施例4 桑葛制剂中总生物碱类活性成分的质量检测 

待测桑葛制剂的来源(由桑白皮提取物S20100721和葛根提取物G20100813按照药材比例2∶1、4∶1、1∶2、1∶4混合制成)； 

所用仪器、参照物溶液、待测桑葛制剂溶液的制备与以及色谱条件均与实施例3相同。 

参照物溶液的制备，精密称取1-脱氧野尻霉素盐酸盐对照品适量，加水制成每1ml含4μg的溶液，即得； 

待测桑葛制剂品溶液的制备，取本品约0.15g，精密称定，置15ml具塞试管中，精密加入10ml水，称定重量，超声处理(功率250W，频率33KHZ)30分钟；放冷，再称定重量，用水补足减失的重量，摇匀，即得； 

测定法，精密吸取对照品溶液与供试品溶液各100μl，置10ml离心管中，分别精密加入硼酸盐缓冲液(0.4mol/L，pH8.5)100μl、芴甲氧酰氯乙腈溶液(5mmol/L)200μl，于30℃水浴下反应10min，再分别依次加入甘氨酸溶液(0.1mol/L)100μl，0.1％醋酸水溶液9.50ml，摇匀，滤过，取续滤液各10μl注入高效液相色谱仪，测定，记录80分钟色谱图，即得。待测桑葛制剂的总生物碱类成分)指纹图谱，请见附图15、16、17、18，上述指纹色谱分别对应桑白皮和葛根的质量比为2∶1、4∶1、1∶2、1∶4。 

以《中药色谱指纹图谱相似度评价系统A版》计算上述附图15、16、17、18与实施例3得到的对照指纹图谱的相似性，计算结果显示，二者之间有良好的相似性，相似度＞0.85；此产品在总生物碱类成分含量上满足桑葛制剂的要求。 

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。 

Claims (7)

1.一种桑葛制剂中总黄酮类成分和总生物碱类成分指纹图谱的构建方法，其特征在于，所述方法包括：

a)将所述桑葛制剂制备成液相分离用桑葛制剂溶液；

b)总黄酮类成分指纹图谱的构建：

将所述桑葛制剂溶液注入以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的液相色谱仪，紫外检测器波长为250nm；柱温为20-40℃；以乙腈为流动相A，以0.3％醋酸为流动相B进行梯度洗脱，得到所述总黄酮类成分指纹图谱；以及

c)总生物碱类成分指纹图谱的构建：

将预定量的所述桑葛制剂溶液置于容器中，将硼酸盐缓冲液和芴甲氧酰氯乙腈溶液加入所述容器中，水浴下反应；再依次将甘氨酸溶液、醋酸水溶液加入到所述桑葛制剂溶液，过滤后取续滤液注入高效液相色谱仪，其中，

所述高效液相色谱仪中的色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，荧光检测器激发波长为254nm，发射波长为309nm，柱温为20-40℃，以乙腈为流动相C，0.1％醋酸为流动相D进行梯度洗脱，得到所述总生物碱类成分指纹图谱，其中，

所述步骤b)的梯度洗脱程序如下：

0～20分钟流动相A体积比保持为10.5％，流动相B体积比保持为89.5％；

20～60分钟流动相A体积比由10.5％线性上升到40％，流动相B体积比由89.5％下降到60％；

60～62分钟流动相A体积比由40％线性下降到10.5％，流动相B体积比由60％上升到89.5％；

62～70分钟流动相A体积比保持为10.5％、流动相B体积比保持为89.5％，得到所述总黄酮类成分指纹图谱，

所述步骤c)的梯度洗脱程序如下：

0～50分钟，所述流动相C体积比由30％上升到35％，所述流动相D体积比由70％下降到65％；

50～60分钟，所述流动相C体积比保持为35％，所述流动相D体积比保持为65％；

60～61分钟，所述流动相C体积比由35％上升到100％，所述流动相D体积比由65％下降到0％；

61～70分钟，所述流动相C体积比保持为100％，所述流动相D体积比保持为0％；

70～71分钟，所述流动相C体积比由100％下降到30％，所述流动相D体积比由0％上升到70％，得到所述总生物碱类成分指纹图谱。

2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述步骤b)进一步包括将葛根素加入水中制得葛根素参照物溶液的步骤，所述葛根素参照物溶液与所述桑葛制剂溶液同时注入所述液相色谱仪。

3.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述步骤c)进一步包括将1-脱氧野尻霉素盐酸盐溶入水中制得1-脱氧野尻霉素盐酸盐参照物溶液的步骤，所述1-脱氧野尻霉素盐酸盐参照物溶液与所述桑葛制剂溶液同时注入所述高效液相色谱仪。

4.根据权利要求1-3中任一项所述的构建方法，其特征在于，所述总黄酮类成分的对照指纹图谱具有17个共有指纹峰，相对保留时间分别为：

1号峰为0.487±0.009，2号峰为0.536±0.004，3号峰为S峰，为1.000±0.000，4号峰为1.099±0.030，5号峰为1.217±0.002，6号峰为1.308±0.001，7号峰为1.890±0.002，8号峰为2.268±0.008，9号峰为2.314±0.006，10号峰为2.445±0.010，11号峰为2.507±0.028，12号峰为2.549±0.010，13号峰为2.722±0.012，14号峰为2.771±0.012，15号峰为2.930±0.007，16号峰为3.423±0.019，17号峰为3.529±0.017。

5.根据权利要求1-3中任一项所述的构建方法，其特征在于，当所述桑葛制剂中桑白皮与葛根的质量比为2:1时，所述步骤c)得到的总生物碱类成分的对照指纹图谱具有13个共有指纹峰，相对保留时间分别为：

1号峰为0.514±0.03，2号峰为S峰，为1.000±0.000，3号峰为1.401±0.001，4号峰为1.427±0.003，5号峰为1.478±0.009，6号峰为1.522±0.008，7号峰为1.917±0.012，8号峰为2.030±0.007，9号峰为2.212±0.022，10号峰为2.530±0.044，11号峰为2.617±0.008，12号峰为3.630±0.017，13号峰为3.740±0.018。

6.根据权利要求1-3中任一项所述的构建方法，其特征在于，当所述桑葛制剂中桑白皮与葛根的质量比为4:1、1:2和1:4时，所述步骤c)得到的总生物碱类成分的对照指纹图谱中具有9个共有指纹峰，相对保留时间分别为：

1号峰为0.512±0.018，2号峰为S峰，为1.000±0.000，3号峰为1.450±0.003，4号峰为1.880±0.002，5号峰为2.154±0.005，6号峰为2.288±0.006，7号峰为2.469±0.006，8号峰为2.559±0.013，9号峰为2.621±0.010。

7.一种桑葛制剂的检测方法，其特征在于，所述检测方法包括：

将待测桑葛制剂制备成液相分离用桑葛制剂溶液；

所述待测桑葛制剂总黄酮类成分和总生物碱类成分指纹图谱的获得：按照权利要求1所述构建方法中的步骤b)和c)获得所述待测桑葛制剂的总黄酮类成分和总生物碱类成分指纹图谱；以及

将所述待测桑葛制剂的总黄酮类成分指纹图谱与权利要求4所述构建方法中的总黄酮类成分对照指纹图谱进行比较，以及将所述待测桑葛制剂的总生物碱类成分指纹图谱与权利要求5或6所述构建方法中的总生物碱类成分对照指纹图谱进行比较。