CN111175399A - 一种黑果枸杞高效液相色谱指纹图谱的检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于指纹图谱检测技术领域，公开了一种黑果枸杞高效液相色谱指纹图谱的检测方法，所述黑果枸杞高效液相色谱指纹图谱的检测方法包括：样品制备：称取样品，加入石油醚，振摇、超声、离心，取上清液过滤；设定色谱条件：选择色谱柱，设定梯度洗脱的流动相、洗脱时间、流速、检测波长、柱温、进样量；方法学考察：稳定性考察、精密度考察、重复性考察；通过中药色谱指纹图谱相似度评价系统建立指纹图谱。本发明利用中药色谱指纹图谱相似度评价系统建立的黑果枸杞高效液相色谱指纹图谱，与建立的对照图谱相比较，相似度能到达0.8以上，为黑果枸杞质量控制提供道地性的技术保障，对不同产地、不同质量的黑果枸杞的鉴别提供参考价值。

Description

一种黑果枸杞高效液相色谱指纹图谱的检测方法
技术领域
本发明属于指纹图谱检测技术领域，尤其涉及一种黑果枸杞高效液相色谱指纹图谱的检测方法。
背景技术
目前，最接近的现有技术：黑果枸杞(LyciumruthenicumMurr.)主要分布于高山沙林、盐化沙地、河湖沿岸和干河床中，为我国西部特有的沙漠药用植物品种，主产于我国青海东部，另外在新疆北部、内蒙古西部、陕西北部、甘肃和西藏等地有零星分布。它生长在人类无法生存的荒山野岭、河床沙滩，拥有着极强的生命力。野生黑枸杞含有的花色甙素是最有效的天然自由基清除剂，延缓人体细胞组织衰老，保持年轻状态，延年益寿，另外，长期用野生黑枸杞泡茶喝，具有明显保护视力的作用，对青少年假性近视，中老年眼花、眼底出血，糖尿病视网膜病变，白内障，视疲劳，干眼症都有良好的保健作用。黑果枸杞还可防治糖尿病，并具有明显的抗疲劳，保肝，抗肿瘤，疏通血管，降压，保护心血管系统作用。
目前，人们对黑果枸杞的研究仅限于对其多糖和色素的初步研究，并未见到有相关的方法。对于黑果枸杞这种高价值的产品在真伪鉴别，不同产地混淆，以次充好方面的研究比较欠缺。
综上所述，现有技术存在的问题是：现有技术对黑果枸杞的研究仅限于对其多糖和色素的初步研究，利用高效液相色谱法建立其指纹图谱的有相关方法尚未见报道。
解决上述技术问题的难度：黑果枸杞色素含量丰富，对色谱条件要求较高，只有在合适的色谱条件下才能得到独立的色谱峰，只有经过重复试验，选择最佳色谱条件。
解决上述技术问题的意义：黑果枸杞属于高附加值产品，价格昂贵，目前对于黑果枸杞多为色素的研究，但是对于真假，以次充好的检测方法却很少见，该方法从色谱角度解决了黑果枸杞掺假乱象，维护市场交易秩序。
发明内容
针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种黑果枸杞高效液相色谱指纹图谱的检测方法。
本发明是这样实现的，一种黑果枸杞高效液相色谱指纹图谱的检测方法，所述黑果枸杞高效液相色谱指纹图谱的检测方法包括以下步骤：
步骤一，样品制备：称取样品，加入石油醚，振摇、超声、离心，取上清液过滤。
步骤二，设定色谱条件：选择色谱柱，设定梯度洗脱的流动相、洗脱时间、流速、检测波长、柱温、进样量。
步骤三，方法学考察：稳定性考察、精密度考察、重复性考察。
步骤四，建立指纹图谱：通过中药色谱指纹图谱相似度评价系统得到对照图谱。
进一步，步骤一中，所述样品制备的方法为：准确称取2.00g样品，加入20mL石油醚，振摇10min，再超声30min，3000r/min离心5min，弃去石油醚，于50℃烘干残渣；准确加入20mL60％的乙醇(pH4.80)，振摇10min，超声30min，2000r/min离心5min，取上清液过0.45μm的膜过滤器过滤。
进一步，步骤二中，所述色谱条件设定为：色谱柱为Agilent ZORBAX SB-C18(250×4.6mm，5μm)，流动相为乙腈、水和1％甲酸0～70min梯度洗脱，流速1mL/min，检测波长196nm，柱温35℃，进样量10μL。
进一步，步骤三中，所述稳定性考察的方法为：取S1样品，按照上述的制备方法制备后，分别于0h，4h，8h，12h，18h，24h进样检测，以芦丁的保留时间和峰面积为参考，计算其相对保留时间，主要共有峰保留时间的RSD均小于3.0％；峰面积的RSD均小于3.0％，表明样品在24h内相对稳定。
进一步，步骤三中，所述精密度考察的方法为：取S1样品，按照上述的制备方法制备后，连续进样6次，以芦丁的保留时间和峰面积为参考，计算其相对保留时间，主要共有峰保留时间的RSD均小于3.0％；峰面积的RSD均小于3.0％，表明仪器的精密度良好。
进一步，步骤三中，所述重复性考察的方法为：取S1样品，称取6份，按照上述的制备方法制备后进行检测，以芦丁的保留时间和峰面积为参考，计算其相对保留时间，主要共有峰保留时间的RSD均小于3.0％；峰面积的RSD均小于3.0％，表明该方法具有很好的重复性。
进一步，步骤四中，所述指纹图谱的建立方法为：将所得到的青海黑果枸杞色谱图导入国家药典委员会开发的中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012.130723版本)中，进入生成对照的模式下，以S2为参照图谱，设定中位数的生成方式，生成对照图谱R，计算其相似度，并得到对照图谱。
综上所述，本发明的优点及积极效果为：利用色谱技术，区分不同产地、野生/种植黑果枸杞，该方法简单快速，结果准确，本发明旨在利用高效液相色谱法建立其指纹图谱，以达到快速检测黑果枸杞的真伪，产地和质量的目的，为黑果枸杞的质量控制建立有效方法，并为其鉴别提供参考。本发明提供的黑果枸杞高效液相色谱指纹图谱的检测方法，以高效液相色谱技术，选用超声波提取，于196nm波长下检测，建立黑果枸杞的指纹图谱，采用中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012.130723版本)，对30批黑果枸杞进行分析，在以上色谱条件下能得到最多的色谱峰，稳定性、精密度和重复性良好，通过此方法建立的黑果枸杞指纹图谱具有较好的可控性。
本发明利用中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012.130723版本)，对30批黑果枸杞进行分析，色谱条件为：Agilent ZORBAX SB-C18(250×4.6mm，5μm)，流动相为乙腈、水和1％甲酸0～70min梯度洗脱，流速1mL/min，检测波长196nm，柱温35℃。本发明建立的黑果枸杞高效液相色谱指纹图谱，与建立的对照图谱相比较，相似度能到达0.8以上，为以后黑果枸杞质量控制提供地道性的技术保障，试验的前处理方法简单，具有很强的操作性。
黑果枸杞具有很好的营养价值，目前市场上鱼目混杂，以次充好，而通过本发明所建立的黑果枸杞指纹图谱能很好的区分不同产地，不同质量的黑果枸杞，对不同产地、不同质量的黑果枸杞的鉴别提供参考价值。
附图说明
图1是本发明实施例提供的黑果枸杞高效液相色谱指纹图谱的检测方法流程图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种黑果枸杞高效液相色谱指纹图谱的检测方法，下面结合附图对本发明作详细的描述。
如图1所示，本发明实施例提供的黑果枸杞高效液相色谱指纹图谱的检测方法包括以下步骤：
S101：样品制备：称取样品，加入石油醚，振摇、超声、离心，取上清液过滤。
S102：设定色谱条件：选择色谱柱，设定梯度洗脱的流动相、洗脱时间、流速、检测波长、柱温、进样量。
S103：方法学考察：稳定性考察、精密度考察、重复性考察。
S104：建立指纹图谱：通过中药色谱指纹图谱相似度评价系统得到对照图谱。
下面结合实验对本发明的技术方案作进一步描述。
1、实验材料
1.1实验仪器
Agilent 1260高效液相色谱仪(配四元泵，自动进样器，DAD检测器)，粉碎机，超声波清洗器。
1.2实验药品
乙腈、甲酸为色谱纯，甲醇、石油醚均为分析纯。
供试样品分别采自青海格尔木、诺木洪、德令哈、都兰、察尔汗；(见表1)，样品均为黑果枸杞干果。
表1样品编号及产地
Figure BDA0002361905390000051
2、实验方法
2.1样品制备
准确称取2.00g样品，加入20mL石油醚，振摇10min，再超声30min，3000r/min离心5min，弃去石油醚，于50℃烘干残渣；准确加入20mL60％的乙醇(pH4.80)，振摇10min，超声30min，2000r/min离心5min，取上清液过0.45μm的膜过滤器过滤。
2.2色谱条件
色谱柱为Agilent ZORBAX SB-C18(250×4.6mm，5μm)，流动相为乙腈、水和1％甲酸0～70min梯度洗脱(见表2)，流速1mL/min，检测波长196nm，柱温35℃，进样量10μL。
表2梯度洗脱条件
Figure BDA0002361905390000061
2.3方法学考察
2.3.1稳定性考察
取S1样品，按照上述的制备方法制备后，分别于0h，4h，8h，12h，18h，24h进样检测，以芦丁的保留时间和峰面积为参考，计算其相对保留时间，主要共有峰保留时间的RSD均小于3.0％；峰面积的RSD均小于3.0％，表明样品在24h内相对稳定(见表3～表4)。
表3稳定性实验结果-相对保留时间
Figure BDA0002361905390000062
表4稳定性实验结果-相对峰面积
Figure BDA0002361905390000063
2.3.2精密度考察
取S1样品，按照上述的制备方法制备后，连续进样6次，以芦丁的保留时间和峰面积为参考，计算其相对保留时间，主要共有峰保留时间的RSD均小于3.0％；峰面积的RSD均小于3.0％，表明仪器的精密度良好(见表5～表6)。
表5精密度实验结果-相对保留时间
Figure BDA0002361905390000071
表6精密度实验结果-相对峰面积
Figure BDA0002361905390000072
2.3.3重复性考察
取S1样品，称取6份，按照上述的制备方法制备后进行检测，以芦丁的保留时间和峰面积为参考，计算其相对保留时间，主要共有峰保留时间的RSD均小于3.0％；峰面积的RSD均小于3.0％，表明该方法具有很好的重复性(见表7～表8)。
表7重复性实验结果-相对保留时间
Figure BDA0002361905390000073
表8重复性实验结果-相对峰面积
Figure BDA0002361905390000074
Figure BDA0002361905390000081
2.4指纹图谱的建立
将所得到的青海黑果枸杞色谱图导入国家药典委员会开发的中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012.130723版本)中，进入生成对照的模式下，以S2为参照图谱，设定中位数的生成方式，生成对照图谱R，计算其相似度，并得到对照图谱。
3、结果
3.1本次试验以高效液相色谱技术，选用超声波提取，于196nm波长下检测，建立黑果枸杞的指纹图谱，采用中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012.130723版本)，对青海地区的30批黑果枸杞进行分析，在以上色谱条件下能得到最多的色谱峰，稳定性、精密度和重复性良好，通过此方法建立的黑果枸杞指纹图谱具有较好的可控性。
3.2本试验利用中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012.130723版本)，建立了青海地区黑果枸杞的指纹图谱，与建立的对照图谱相比较，相似度能到达0.8以上，为以后黑果枸杞质量控制提供技术保障，试验的前处理方法简单，具有很强的操作性。
3.3黑果枸杞具有很好的营养价值，目前市场上鱼目混杂，以次充好，而通过本试验所建立的黑果枸杞指纹图谱能很好的区分不同产地，不同质量的黑果枸杞，为青海黑果枸杞的道地性提供保障。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (7)

1.一种黑果枸杞高效液相色谱指纹图谱的检测方法，其特征在于，所述黑果枸杞高效液相色谱指纹图谱的检测方法包括以下步骤：
步骤一，称取样品，加入石油醚，振摇、超声、离心，取上清液过滤；
步骤二，选择色谱柱，设定梯度洗脱的流动相、洗脱时间、流速、检测波长、柱温、进样量；
步骤三，稳定性考察、精密度考察、重复性考察；
步骤四，通过中药色谱指纹图谱相似度评价系统得到对照图谱。
2.如权利要求1所述的黑果枸杞高效液相色谱指纹图谱的检测方法，其特征在于，步骤一中，所述样品制备的方法为：
称取2.00g样品，加入20mL石油醚，振摇10min，再超声30min，3000r/min离心5min，弃去石油醚，于50℃烘干残渣；
加入20mL60％的乙醇，pH4.80，振摇10min，超声30min，2000r/min离心5min，取上清液过0.45μm的膜过滤器过滤。
3.如权利要求1所述的黑果枸杞高效液相色谱指纹图谱的检测方法，其特征在于，步骤二中，所述色谱条件设定为：色谱柱为AgilentZORBAX SB-C18，250×4.6mm，5μm，流动相为乙腈、水和1％甲酸0～70min梯度洗脱，流速1mL/min，检测波长196nm，柱温35℃，进样量10μL。
4.如权利要求1所述的黑果枸杞高效液相色谱指纹图谱的检测方法，其特征在于，步骤三中，所述稳定性考察的方法为：取S1样品，按照上述的制备方法制备后，分别于0h，4h，8h，12h，18h，24h进样检测，以芦丁的保留时间和峰面积为参考，计算其相对保留时间，共有峰保留时间的RSD均小于3.0％；峰面积的RSD均小于3.0％，表明样品在24h内相对稳定。
5.如权利要求1所述的黑果枸杞高效液相色谱指纹图谱的检测方法，其特征在于，步骤三中，所述精密度考察的方法为：取S1样品，按照上述的制备方法制备后，连续进样6次，以芦丁的保留时间和峰面积为参考，计算其相对保留时间，主要共有峰保留时间的RSD均小于3.0％；峰面积的RSD均小于3.0％，表明仪器的精密度良好。
6.如权利要求1所述的黑果枸杞高效液相色谱指纹图谱的检测方法，其特征在于，步骤三中，所述重复性考察的方法为：取S1样品，称取6份，按照上述的制备方法制备后进行检测，以芦丁的保留时间和峰面积为参考，计算其相对保留时间，主要共有峰保留时间的RSD均小于3.0％；峰面积的RSD均小于3.0％，表明该方法具有很好的重复性。
7.如权利要求1所述的黑果枸杞高效液相色谱指纹图谱的检测方法，其特征在于，步骤四中，所述指纹图谱的建立方法为：将所得到的青海黑果枸杞色谱图导入国家药典委员会开发的中药色谱指纹图谱相似度评价系统中，进入生成对照的模式下，以S2为参照图谱，设定中位数的生成方式，生成对照图谱R，计算其相似度，并得到对照图谱。
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