CN105194079A

CN105194079A - 黑果枸杞果实提取物在制药中的应用

Info

Publication number: CN105194079A
Application number: CN201410287668.9A
Authority: CN
Inventors: 谭昌恒; 谭俊杰; 朱大元; 胡宗江
Original assignee: Qinghai Yuchentang Biotechnology Co ltd; Shanghai Institute of Materia Medica of CAS
Current assignee: Qinghai Yuchentang Biotechnology Co ltd; Shanghai Institute of Materia Medica of CAS
Priority date: 2014-06-24
Filing date: 2014-06-24
Publication date: 2015-12-30

Abstract

本发明公开了黑果枸杞果实提取物在制药中的应用，动物试验证明，所述的黑果枸杞果实提取物，对于所述的干燥综合征具有明显的治疗和改善效果，可以用于制备治疗干燥综合征药物，而且毒性较小，长期服用没有副作用。

Description

黑果枸杞果实提取物在制药中的应用

技术领域

本发明涉及一种黑果枸杞果实提取物的新用途，具体涉及在制备治疗干燥综合征药物中的应用。

背景技术

干燥综合征(syndrome,SS)是一种主要侵犯外分泌腺的慢性系统性自身免疫性疾病。该病最常见的临床表现为进行性口干、眼干，同时可累及肾、肺、甲状腺和肝等多种器官，出现高球蛋白性紫癜、间质性肺炎、肾小管酸中毒、胆汁性肝硬化、外周及中枢神经损伤等表现。本病分为原发性和继发性两类，不合并其他自身免疫性疾病者称为原发性干燥综合征(primarySS，pSS)；继发于类风湿关节炎(RA)、系统性红斑狼疮(SLE)等为继发性干燥综合征(secondarySS，sSS)。SS女性多发，约占全部病例的90％，发病年龄集中于30～60岁。流行病学调查显示，该病在我国人群患病率为0.29％～0.77％，在老年群体中患病率为3％～4％。是最常见的结缔组织病之一，目前尚无肯定的药物改变其病程(华红，干燥综合征西医、中医治疗研究进展，中国实用口腔科杂志，2012,5(3),142-145.)。

干燥综合征的病理机制尚不明确，多种动物模型被用来研究干燥综合征的病理过程，其中NOD小鼠模型被认为目前比较适宜的干燥综合征动物模型(高春鹤，刘维.干燥综合征NOD小鼠模型研究进展，中国实验动物学报，2008,16(1)，65-69)。水分子通道蛋白-5(AQP5)是细胞跨膜转运蛋白之一，具有高通透性，通过此通道水可以经过质膜向高渗方向快速移动。在SS的发病机制中，目前只有AQP5证实与唾液分泌功能密切相关。AQP5在SS涎腺及泪腺组织定位明确，其转运分布的异常，均能导致腺体破坏及M3R的异常，引起口眼干等症状。故可以通过AQP5途径刺激增加腺体分泌，改善SS口干等症状，达到治疗SS的目的(刘燕，钱先.AQP5在干燥综合征发病机制中作用研究进展，辽宁中医药大学学报，2014，16(1),85-87)。

黑果枸杞(LyciumruthenicumMurr.)系茄科枸杞属多年生耐盐抗旱灌木植物，主要生长于我国西北高原地区的盐碱荒漠地带，藏药称其果实为“旁玛”，据《四部医典》和《晶珠本草》等藏医药经典著作记载，可用于治疗心热病、心脏病、月经不调和停经等病症。天然花青素类化合物由于可清除人体内代谢过程中产生的过多自由基，具有较强的防止活性氧危害及抗氧化活性，对于疾病的防治起着重要作用。

目前还没有文献关于黑果枸杞果实及其提取物用于治疗干燥综合征的报道。

发明内容

本发明的目的是公开一种黑果枸杞果实提取物在制药中的应用，以满足临床应用的需要。

动物试验证明，所述的黑果枸杞果实提取物，对于所述的干燥综合征具有明显的治疗和改善效果，可以用于制备治疗干燥综合征药物。

所述的黑果枸杞果实提取物，可以根据我们此前申请的专利(专利名称：黑果枸杞果实提取物及制备方法和应用，申请号：201310274771.5)所公开的技术进行制备，具体的包括如下步骤：

(1)提取：将黑果枸杞果实，加入重量浓度为1～2‰酸的水溶液，温度10～60℃搅拌提取，提取时间为1～3小时，优选提取1～3次，每次0.5～1小时，过滤收集提取液；

酸的水溶液的重量用量为黑果枸杞果实的8～12倍；

所述的酸选自盐酸、醋酸、甲酸、柠檬酸、草酸或磷酸；

(2)吸附：将步骤(1)中得到的提取液，通过装有聚苯乙烯—二乙烯苯大孔树脂的层析柱，使黑果枸杞果实提取液得到选择性充分吸附；

(3)洗脱：先用水洗脱步骤(2)中吸附了黑果枸杞果实提取液的层析柱，直至洗脱液为中性或检测无糖反应，再用洗脱液洗脱，收集层析柱流出的洗脱液；

所述洗脱液由如下重量百分比的组分组成：

酸0.1～2‰

体积浓度为75％的乙醇水溶液余量

洗脱液的重量用量为步骤(1)中黑果枸杞果实重量的15～20倍；

所述的酸为盐酸、醋酸或柠檬酸；

(4)浓缩：将步骤(3)中所得洗脱液于50～60℃条件下减压浓缩回收乙醇，直至25℃时的溶液密度为1.1～1.2，得黑果枸杞果实提取物浸膏；

(5)干燥：将步骤(4)中所得黑果枸杞果实提取物浸膏进行冷冻干燥，获得所述黑果枸杞果实提取物。

上述的黑果枸杞果实提取物，含有：矮牵牛单宁(petanin)的重量含量为14％～18％。

结构式如下：

优选的，是采用包括如下步骤的方法制备的：

(1)提取：将黑果枸杞果实，加入重量浓度为2‰盐酸的水溶液，在温度60℃搅拌提取三次，每次0.5小时，过滤收集提取液；

盐酸的水溶液的重量用量为黑果枸杞果实的8倍；

(2)吸附：将步骤(1)中得到的提取液，通过装有聚苯乙烯—二乙烯苯大孔树脂的层析柱，使黑果枸杞果实提取液得到选择性吸附；

洗脱液由如下重量百分比的组分组成：

酸2‰

体积浓度为75％的乙醇水溶液余量

洗脱液的重量用量为步骤(1)中黑果果实的20倍；

所述的酸为盐酸；

(4)浓缩：将步骤(3)中所得洗脱液于60℃条件下减压浓缩回收乙醇，直至25℃时的溶液密度为1.1，得黑果枸杞果实提取物浸膏；

(5)干燥：将步骤(4)中所得黑果枸杞果实提取物浸膏进行冷冻干燥，获得黑果枸杞果实提取物；其中：矮牵牛单宁(petanin)的重量含量为16.33％。

进一步优选的，是采用包括如下步骤的方法制备的：

(1)提取：将黑果枸杞果实，加入重量浓度为1‰柠檬酸的水溶液，在温度10℃搅拌提取三次，每次1小时，过滤收集提取液；

酸的水溶液的重量用量为黑果枸杞果实的12倍；

(2)吸附：将步骤(1)中得到的提取液，通过装有聚苯乙烯—二乙烯苯大孔树脂的层析柱，使黑果枸杞提取液得到选择性吸附；

洗脱液由如下重量百分比的组分组成：

酸0.1‰

体积浓度为75％的乙醇水溶液余量

洗脱液的重量用量为步骤(1)中黑果枸杞果实的15倍；

所述的酸为柠檬酸；

(4)浓缩：将步骤(3)中所得洗脱液于60℃条件下减压浓缩回收乙醇，直至25℃时的溶液密度为1.2，得黑果枸杞果实提取物浸膏；

(5)干燥：将步骤(4)中所得黑果枸杞果实提取物浸膏进行冷冻干燥，获得黑果枸杞果实提取物，其中：矮牵牛单宁的重量含量为：15.5％。

进一步，所述的药物，包括治疗有效量的所述的黑果枸杞果实提取物和医药学上可接受的载体，所述载体如：稀释剂、赋形剂(比如水)等，填充剂如淀粉、蔗糖、乳糖、微晶纤维素等，粘合剂如纤维素衍生物、明胶和聚乙烯吡咯烷酮等，润湿剂如甘油等，表面活性剂如十六烷醇等，崩解剂如碳酸钙、交聚维酮、羟基乙酸淀粉钠等，润滑剂如滑石粉、硬脂酰富马酸钠、硬脂酸钙和镁等。

可采用本领域公知的方法，将治疗有效量的黑果枸杞果实提取物与一种或多种药学上可接受的载体相混合，制备成常规的固体制剂如片剂、粉剂、颗粒剂、胶囊、滴丸、软胶囊、口服液、注射液、针剂、乳剂(含微乳、亚微乳)、软膏、栓剂、贴剂、巴布剂等，其中活性成分的含量为0.1％～99.5％(重量比)。

本发明可通过口服途径施加于需要治疗的患者，剂量为50-200mg/kg/体重/天；

本发明与现有技术相比具有下列优点：

毒性试验证明，所述黑果枸杞果实提取物毒性小鼠口服给药5g/kg·体重·天未见明显毒性，即使长期使用，也对人体无害；在申请人此前申请的专利(专利名称：黑果枸杞果实提取物及制备方法和应用，申请号：201310274771.5)基础上，通过动物体内试验，发现了黑果枸杞果实提取物对干燥综合征有显著疗效，可以用于制备治疗干燥综合征的药物。

附图说明

图1.矮牵牛单宁(petanin)对照品液相图谱。

图2.黑果枸杞果实提取物中矮牵牛单宁含量测定液相图谱。

图3.空白溶液液相图谱。

图4.AQP5免疫组化染色结果(模型对照组)

图5.AQP5免疫组化染色结果(HGGQ组).

图6.AQP5RT—PCR测定结果

具体实施方式

实施例1

黑果枸杞果实提取物的检测方法

黑果枸杞果实提取物中矮牵牛单宁(petanin)的含量测定照高效液相色谱法(中华人民共和国药典附录VID)和我们此前申请的专利(申请号：201310274771.5)所公开的测定方法测定，具体方法为：

1.仪器和试药

Waterse2695高效液相色谱仪，配Waters2998PAD二极管阵列紫外检测器，乙腈为色谱纯，甲酸为分析纯(97％，AlfaAesar公司)，水为纯净水(娃哈哈公司)。对照品矮牵牛单宁(petanin)为从黑果枸杞果实提取物中分离制备，其理化数据如下：

紫红色粉末，¹H-NMR(CD₃OD+CF₃COOD,9:1):矮牵牛花苷元部分8.89(s,H-4),6.97(d,J＝1.5Hz,H-6),6.98(d,J＝1.5Hz,H-8),7.89(d,J＝2.0Hz,H-2′),7.73(d,J＝2.0Hz,H-6′),3.95(3H,s,OMe)；3-O-β-葡萄糖部分5.51(d,J＝7.5Hz,H-1),3.77(dd,J＝7.5,9.0Hz,H-2),3.67(t-like,J＝9.0Hz,H-3),3.53(dd,J＝9.0,9.5Hz,H-4),3.89(m,H-5),4.04(dd,J＝11.5,2.0Hz,H-6a),3.77(dd,J＝11.5,5.8Hz,H-6b)；鼠李糖部分4.71(brs,H-1),3.85(brs,H-2),3.86(d,J＝9.5Hz,H-3),4.89(t-like,J＝9.5Hz,H-4),3.78(dd,J＝9.5,6.5Hz,H-5),1.09(d,J＝6.5Hz,H-6)；5-O-β-葡萄糖部分5.18(d,J＝8.0Hz,H-1),3.74(m,H-2),3.63(m,H-3),3.57(m,H-4),3.64(m,H-5),3.98(d,J＝12.0Hz,H-6a),3.84(dd,J＝12.0,6.0Hz,H-6b)；反式香豆酰部分7.38(2H,d,J＝8.5Hz,H-2andH-6),6.78(2H,d,J＝8.5Hz,H-3andH-5),6.19(d,J＝16.0Hz,H-7),7.52(d,J＝16.0Hz,H-8).¹³C-NMR(CD₃OD+CF₃COOD,9:1):矮牵牛花苷元部分164.4(s,C-2),146.4(s,C-3),134.5(d,C-4),157.3(s,C-5),105.9(d,C-6),170.1(s,C-7),97.8(d,C-8),157.0(s,C-9),113.4(s,C-10),119.9(s,C-1′),109.9(d,C-2′),150.1(s,C-3′),147.9(s,C-4′),146.5(s,C-5′),114.4(d,C-6′)；3-O-β-葡萄糖部分103.0(d,C-1),75.0(d,C-2),78.6(d,C-3),71.6(d,C-4),78.0(d,C-5),67.6(t,C-6)；鼠李糖部分102.4(d,C-1),72.4(d,C-2),70.7(d,C-3),75.7(d,C-4),68.2(d,C-5),18.1(q,C-6)；5-O-β-葡萄糖部分103.1(d,C-1),75.1(d,C-2),78.2(d,C-3),71.3(d,C-4),79.0(d,C-5),62.4(t,C-6)；反式香豆酰部分127.5(s,C-1),131.6(2C,d,C-2andC-6),117.2(2C,d,C-3andC-5),161.6(s,C-4),147.4(d,C-7),115.3(d,C-8),169.4(s,C-9).LC-ESI-MS(positive):933(M⁺).以上数据与文献(SlimestadR.,AabergA.,AndersenФ.M.,Acylatedanthocyaninsfrompetuniaflowers,Phytochemistry,1999,50,1084-1086)的petanin数据一致。

2.色谱条件和系统适应性

色谱柱：Alltima^TMC185μ250*4.6mm；流动相：溶剂A为10％HCOOH–H₂O,溶剂B为10％HCOOH–CH₃CN，A:B＝84:16；柱温：35℃；流速：1.0ml/min；检测波长：525nm；理论塔板数按petanin计不应低于3000，供试品中petanin与相邻峰的分离度符合要求。

3.对照品溶液的制备

精密称取对照品petanin适量，加流动相溶液配制成每1ml中约含800μg的溶液，摇匀，用0.45μm膜滤过，取续滤液，即得。

4.供试品溶液的制备

精密称取黑果枸杞果实提取物适量，加流动相溶液配制成每1ml中约含5.0mg的溶液，摇匀，用0.45μm膜滤过，取续滤液，即得。

5.测定法

分别精密吸取对照品和供试品溶液20μl，注入高效液相色谱仪(见图1和图2)，测定，按外标法以峰面积计算，即得。此方法可用于测定黑果枸杞果实提取物中petanin的含量，对该黑果枸杞果实提取物进行质量控制。

实施例2

黑果枸杞果提取物的提取方法：

盐酸的水溶液的重量用量为黑果枸杞果实的8倍；

(2)吸附：将步骤(1)中得到的提取液，通过装有聚苯乙烯—二乙烯苯大孔树脂的层析柱，黑果枸杞提取液中有效组分得到选择性充分吸附；

(3)洗脱：先用水洗脱步骤(2)中吸附了黑果枸杞有效组分的层析柱，直至洗脱液为中性或检测无糖反应，再用洗脱液洗脱，收集层析柱流出的洗脱液，为浅红色液体，获得黑果枸杞黑果枸杞有效组分；

洗脱液由如下重量百分比的组分组成：

酸2‰

体积浓度为75％的乙醇水溶液余量

洗脱液的重量用量为步骤(1)中黑果果实的20倍；

所述的酸为盐酸；

(4)浓缩：将步骤(3)中所得黑果枸杞有效组分洗脱液于60℃条件下减压浓缩回收乙醇，直至25℃时的溶液密度为1.1，得黑果枸杞有效组分浸膏；

(5)干燥：将步骤(4)中所得黑果枸杞有效组分浸膏进行冷冻干燥，获得黑果枸杞黑果枸杞果提取物。

采用上述方法获得的黑果枸杞果提取物，含有：

矮牵牛单宁(petanin,1)的重量含量为16.33％。

检测方法：采用实施例1的检测方法，其中：

以黑果枸杞有效组分中所含化合物矮牵牛单宁(petanin)为指标性成分。

色谱条件：色谱系统,Waterse2695+2998PAD检测器；色谱柱，Alltima^TMC185μ250*4.6mm；流动相，溶剂A为10％HCOOH–H₂O,溶剂B为10％HCOOH–CH₃CN，A:B＝84:16；柱温35℃；流速，1.0ml/min；检测波长，525nm。

图1为Petanin对照品液相图谱，图2为黑果枸杞果实有效组分中化合物petanin含量测定液相图谱，图3为空白溶液液相图谱。

其中：矮牵牛单宁(petanin)来源于从黑果枸杞果实中分离制备得到。

实施例3

黑果枸杞提取物(HGGQ)对NOD干燥综合征小鼠干燥改善作用的研究。

1.试验样品：

黑果枸杞提取物HGGQ以生理盐水溶解至重量浓度为1.0mg/ml；

其中：HGGQ为实施例2的产物。

2试验动物：

NOD8周龄糖尿病小鼠，性别雌性。

来源：上海西普尔—必凯实验动物有限公司SCXK(沪)2008—0016

3.试验方法：

3.1样品对NOD8周龄糖尿病小鼠干燥综合征作用的影响

因为NOD糖尿病小鼠在8周龄后产生干燥综合症(SS)并发症，故使用8周龄以上NOD小鼠作为干燥综合症模式动物。

NOD8周龄糖尿病小鼠20只，随机分为2组每组10只，黑果枸杞提取物HGGQ组和模型对照组，模型对照组采用(模型对照正常饮水)；

HGGQ组小鼠每天口服灌胃相应黑果枸杞提取物HGGQ30mg/kg，0.7ml/只；连续给药30天。记录每组小鼠每周饮水量变化，30天后处死小鼠取颌下腺进行免疫组化及RT-PCR测定AQP5变化。

3.2RT—PCR测定AQP5

小鼠颌下腺组织使用TIANGEN公司RNAprepPure动物组织总RNA提取试剂盒提取出各组动物颌下腺RNA，再使用PrimeScript^TMRTMasterMix(PerfectRealTime)试剂盒进行反转录，PCR引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成AQP5上游引物GCGCTCAGCAACAACACAAC，下游引物GTGTGACCGACAAGCCAATG扩增片段长度为149bp。

4、实验结果：

4.1样品对NOD干燥综合征小鼠饮水量的影响见下表1

表1.样品对NOD干燥综合征小鼠饮水量的影响

结果显示：HGGQ组给药后，每日饮水量明显少于模型对照组

4.2样品对NOD干燥综合征小鼠颌下腺AQP5的影响

4.2.1AQP5免疫组化染色结果(模型对照组和HGGQ组分别见图4和图5)：

免疫组化染色的结果显示，HGGQ组的颌下腺组织细胞中AQP5染色程度明显强于模型对照组(深色为AQP5染色阳性部分)，显示HGGQ组的颌下腺组织中，AQP5的表达量明显增加。

4.2.2AQP5RT—PCR测定结果(见图6)

AQP5电泳图经灰度扫描分析显示：HGGQ组半定量值为12.046、空白对照组半定量值为5.264。结果显示HGGQ组AQP5的表达量明显高于空白对照组。

Claims

1.黑果枸杞果实提取物在制备治疗干燥综合征药物中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的药物，包括治疗有效量的所述的黑果枸杞果实提取物和医药学上可接受的载体。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的药物为片剂、粉剂、颗粒剂、胶囊、滴丸、软胶囊、口服液、注射液、针剂、乳剂(含微乳、亚微乳)、软膏、栓剂、贴剂或巴布剂。

4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，通过口服途径施加于需要治疗的患者，剂量为50-200mg/kg/体重/天。

5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的黑果枸杞果实提取物的制备方法，包括如下步骤：

(1)提取：将黑果枸杞果实，加入重量浓度为1～2‰酸的水溶液，温度10～60℃搅拌提取，提取时间为1～3小时，过滤收集提取液；

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，步骤(1)中，酸的水溶液的重量用量为黑果枸杞果实的8～12倍；所述的酸选自盐酸、醋酸、甲酸、柠檬酸、草酸或磷酸。

7.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，步骤(3)中，所述洗脱液由如下重量百分比的组分组成：

酸0.1～2‰

体积浓度为75％的乙醇水溶液余量。

8.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，洗脱液的重量用量为步骤(1)中黑果枸杞果实重量的15～20倍；所述的酸为盐酸、醋酸或柠檬酸。

9.根据权利要求1～8任一项所述的应用，其特征在于，所述黑果枸杞果实提取物，含有：矮牵牛单宁(petanin)的重量含量为14％～18％。