CN103340983A - 黑果枸杞果实提取物及制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种黑果枸杞果实提取物及制备方法和应用，所述黑果枸杞果实提取物，是采用包括如下步骤的方法制备的：（1）将黑果枸杞果实，加入重量浓度为1～2‰酸的水溶液提取，过滤收集提取液；（2）将步骤（1）获得提取液，通过装有大孔树脂的层析柱吸附；（3）先用水洗脱步骤（2）中吸附了黑果枸杞果实提取液的层析柱，再用洗脱液洗脱，收集层析柱流出的洗脱液；（4）将步骤（3）所得的洗脱液减压浓缩，得黑果枸杞果实提取物浸膏；（5）将步骤（4）所得浸膏干燥，获得所述黑果枸杞果实提取物。本发明对改善细胞毒性药物如环磷酰胺和有毒化学品如苯造成的小鼠白细胞降低有显著疗效，可以用于制备治疗人体的白细胞降低的药物。
Description
技术领域
本发明涉及一种黑果枸杞果实提取物及其应用，具体涉及黑果枸杞果实提取物在制备治疗因细胞毒性药物（如环磷酰胺）和有毒化学品（如苯）诱导的白细胞降低药物中的应用。
背景技术
很多情况可导致人体的白细胞降低，病因可以是继发性，某些感染例如细菌、病毒等，化学或物理因素例如一定剂量的药物（抗肿瘤药物）、有毒化学品(苯)、电离辐射等以及血液病、脾功能亢进，结缔组织疾病等，原发性疾病例如某些少见的原发性疾病、遗传性疾病以及细胞毒性药物，包括环磷酰胺、白消安、氟尿嘧啶等。此外，许多药物都可以偶致某些病人患白细胞减少症，白细胞减少症的最主要合并症是造成感染，感染严重者可以致死。而一般的白细胞减少症患者常致疲乏、无力、易感染等。
目前，为了减轻人体的白细胞降低，目前国内外临床均广泛使用粒-单细胞刺激因子（GM-CSF）和粒细胞刺激因子（G-CSF），已证明有肯定疗效。但是，由于此二药物半衰期短，只有2～3h，最好每12h皮下注射1次（口服无效），而且是蛋白多肽药物，稳定性差，储存条件严格，给病人治疗带来很大的不便。
黑果枸杞（LyciumruthenicumMurr.）系茄科枸杞属多年生耐盐抗旱灌木植物，主要生长于我国西北高原地区的盐碱荒漠地带，藏药称其果实为“旁玛”，据《四部医典》和《晶珠本草》等藏医药经典著作记载，可用于治疗心热病、心脏病、月经不调和停经等病症。天然花青素类化合物由于可清除人体内代谢过程中产生的过多自由基，具有较强的防止活性氧危害及抗氧化活性，对于疾病的防治起着重要作用。
目前，针对黑果枸杞果实中花青素的提取，赵晓辉等公布了一种采用膜分离技术制备黑果枸杞原花青素产品的方法（黑果枸杞原花青素产品及其制备方法，申请号：201010525734.3），该方法包括以下步骤：黑果枸杞鲜果榨汁→陶瓷膜过滤→滤液过非极性大孔树脂柱→水洗→乙醇洗脱得含原花青素的洗脱液→有机膜处理洗脱液得原花青素精提液→喷雾干燥得产品。该方法主要是通过不同粒度的有机膜来处理样品，得到的原花青素样品中必然含有大量与黑果枸杞中花青素类化合物分子量接近的其他成分，同时，果渣中的花青素成分被浪费了，资源没有得到充分利用；最后的干燥工艺用的是喷 雾干燥，由于其温度较高，花青素成分易被氧化破坏；并且申请者没有公布这些原花青素产品主要包括哪些花青素化合物，也没有公布其含量测定的方法，很难保证产品的质量。另外，丁晨旭等也公布了一种从黑果枸杞果实中提取花色苷的方法（申请号：201010571739.X），该方法通过以下步骤完成：黑果枸杞果实用pH=1～4的乙醇溶液浸提，过滤，得浸提液→减压浓缩至固形物浓度大于40%的浓缩液→聚苯乙烯大孔树脂吸附浓缩液，用乙醇水溶液洗脱，当颜色变深时开始收集，得纯化的黑果枸杞果实花色苷提取液→减压浓缩得固形物大于60%的浓缩液，然后冷冻干燥的黑果枸杞果实花色苷产品。该方法提取时用的是酸性乙醇溶液，在上树脂前需要浓缩除去乙醇，需要耗能，同时，会将很多非花色苷的醇溶性成分带入产品中；另外，提取浓缩液用大孔树脂吸附后，直接用乙醇水溶液洗脱，会使得其大量的糖类成分没有被除去而带入产品中，影响产品花色苷的纯度，且会有较多花青素成分洗脱不下来，造成不必要的浪费。最为主要的是这两个提取方法得到的产品成分不清楚，也没有质量控制方法，产品质量难以保证。发明内容
本发明的目的是公开一种黑果枸杞果实提取物及制备方法和应用，以满足临床应用的需要。
所述的黑果枸杞果实提取物，是采用包括如下步骤的方法制备的：
（1）提取：将黑果枸杞果实，加入重量浓度为1～2‰酸的水溶液，温度10～60℃搅拌提取，提取时间为1～3小时，优选提取1～3次，每次0.5～1小时，过滤收集提取液；
酸的水溶液的重量用量为黑果枸杞果实的8～12倍；
所述的酸选自盐酸、醋酸、甲酸、柠檬酸、草酸或磷酸；
（2）吸附：将步骤（1）中得到的提取液，通过装有聚苯乙烯—二乙烯苯大孔树脂的层析柱，使黑果枸杞果实提取液得到选择性充分吸附；
（3）洗脱：先用水洗脱步骤（2）中吸附了黑果枸杞果实提取液的层析柱，直至洗脱液为中性或检测无糖反应，再用洗脱液洗脱，收集层析柱流出的洗脱液；
所述洗脱液由如下重量百分比的组分组成：
酸 0.1～2‰
体积浓度为75%的乙醇水溶液 余量
洗脱液的重量用量为步骤（1）中黑果枸杞果实重量的15～20倍；
所述的酸为盐酸、醋酸或柠檬酸；
（4）浓缩：将步骤（3）中所得洗脱液于50～60℃条件下减压浓缩回收乙醇，直至25℃时的溶液密度为1.1～1.2，得黑果枸杞果实提取物浸膏；
（5）干燥：将步骤（4）中所得黑果枸杞果实提取物浸膏进行冷冻干燥，获得所述黑果枸杞果实提取物。
上述的黑果枸杞果实提取物，含有：矮牵牛单宁（petanin)的重量含量为14%～18%。
结构式见下式：
优选的，是采用包括如下步骤的方法制备的：
（1）提取：将黑果枸杞果实，加入重量浓度为2‰盐酸的水溶液，在温度60℃搅拌提取三次，每次0.5小时，过滤收集提取液；
盐酸的水溶液的重量用量为黑果枸杞果实的8倍；
（2）吸附：将步骤（1）中得到的提取液，通过装有聚苯乙烯—二乙烯苯大孔树脂的层析柱，使黑果枸杞果实提取液得到选择性吸附；
（3）洗脱：先用水洗脱步骤（2）中吸附了黑果枸杞果实提取液的层析柱，直至洗脱液为中性或检测无糖反应，再用洗脱液洗脱，收集层析柱流出的洗脱液；
洗脱液由如下重量百分比的组分组成：
酸 2‰
体积浓度为75%的乙醇水溶液 余量
洗脱液的重量用量为步骤（1）中黑果果实的20倍；
所述的酸为盐酸；
（4）浓缩：将步骤（3）中所得洗脱液于60℃条件下减压浓缩回收乙醇，直至25 ℃时的溶液密度为1.1，得黑果枸杞果实提取物浸膏；
（5）干燥：将步骤（4）中所得黑果枸杞果实提取物浸膏进行冷冻干燥，获得黑果枸杞果实提取物；其中：矮牵牛单宁（petanin）的重量含量为16.33%。
进一步优选的，是采用包括如下步骤的方法制备的：
（1）提取：将黑果枸杞果实，加入重量浓度为1‰柠檬酸的水溶液，在温度10℃搅拌提取三次，每次1小时，过滤收集提取液；
酸的水溶液的重量用量为黑果枸杞果实的12倍；
（2）吸附：将步骤（1）中得到的提取液，通过装有聚苯乙烯—二乙烯苯大孔树脂的层析柱，使黑果枸杞提取液得到选择性吸附；
（3）洗脱：先用水洗脱步骤（2）中吸附了黑果枸杞果实提取液的层析柱，直至洗脱液为中性或检测无糖反应，再用洗脱液洗脱，收集层析柱流出的洗脱液；
洗脱液由如下重量百分比的组分组成：
酸 0.1‰
体积浓度为75%的乙醇水溶液 余量
洗脱液的重量用量为步骤（1）中黑果枸杞果实的15倍；
所述的酸为柠檬酸；
（4）浓缩：将步骤（3）中所得洗脱液于60℃条件下减压浓缩回收乙醇，直至25℃时的溶液密度为1.2，得黑果枸杞果实提取物浸膏；
（5）干燥：将步骤（4）中所得黑果枸杞果实提取物浸膏进行冷冻干燥，获得黑果枸杞果实提取物，其中：矮牵牛单宁的重量含量为：15.5%。
动物试验证明：上述的黑果枸杞果实提取物，对改善细胞毒性药物如环磷酰胺和有毒化学品如苯诱导的小鼠白细胞降低有显著疗效，可以用于制备治疗人体的白细胞降低的药物。
所述白细胞降低可以是继发性，某些感染例如细菌、病毒等，化学或物理因素例如一定剂量的药物（抗肿瘤药物）、有毒化学品(苯)、电离辐射等以及血液病、脾功能亢进，结缔组织疾病等，原发性疾病例如某些少见的原发性疾病、遗传性疾病以及细胞毒性药物，包括环磷酰胺、白消安、氟尿嘧啶等。此外，许多药物都可以偶致某些病人患白细胞减少症，白细胞减少症的最主要合并症是造成感染，感染严重者可以致死。而一般的白细胞减少症患者常致疲乏、无力、易感染等；
本发明还涉及一种药物组合物，包括治疗有效量的所述的黑果枸杞果提取物和医药 学上可接受的载体，所述载体如：稀释剂、赋形剂（比如水）等，填充剂如淀粉、蔗糖、乳糖、微晶纤维素等，粘合剂如纤维素衍生物、明胶和聚乙烯吡咯烷酮等，润湿剂如甘油等，表面活性剂如十六烷醇等，崩解剂如碳酸钙、交聚维酮、羟基乙酸淀粉钠等，润滑剂如滑石粉、硬脂酰富马酸钠、硬脂酸钙和镁等。
可采用本领域公知的方法，将治疗有效量的黑果枸杞果实提取物与一种或多种药学上可接受的载体相混合，制备成常规的固体制剂如片剂、粉剂、颗粒剂、胶囊、滴丸、软胶囊、口服液、注射液、针剂、乳剂（含微乳、亚微乳）、软膏、栓剂、贴剂、巴布剂等，其中活性成分的含量为0.1%～99.5%（重量比）。
本发明可通过口服途径施加于需要治疗的患者，剂量为50-200mg/kg·体重·天；
毒性试验证明，所述黑果枸杞果实提取物毒性小鼠口服给药5g/kg·体重·天未见明显毒性，即使长期使用，也对人体无害；
本发明与现有技术相比具有下列优点：
找到了一种填料MCIgel（一种聚苯乙烯—二乙烯苯大孔树脂）能对黑果枸杞果实的酸性水提取液进行选择性吸附，不需浓缩其提取液，能有效降低能耗，适合工业化生产。通过动物体内的药效学实验，黑果枸杞果实提取物对改善细胞毒性药物如环磷酰胺和有毒化学品如苯诱导的小鼠白细胞降低有显著疗效，可以用于制备治疗人体的白细胞降低的药物。
附图说明
图1.矮牵牛单宁（petanin）对照品液相图谱
图2.黑果枸杞果实提取物中矮牵牛单宁含量测定液相图谱
图3.空白溶液液相图谱
图4.矮牵牛单宁对照品液相色谱(HPLC)含测标准曲线
具体实施方式
实施例1
黑果枸杞果实提取物的检测方法
1.1黑果枸杞果实提取物中矮牵牛单宁（petanin）的含量测定照高效液相色谱法（中华人民共和国药典附录VID）测定
1.1.1仪器和试药
Waterse2695高效液相色谱仪，配Waters2998PAD二极管阵列紫外检测器，乙腈为 色谱纯，甲酸为分析纯（97%，Alfa Aesar公司），水为纯净水（娃哈哈公司）。对照品矮牵牛单宁（petanin）为从黑果枸杞果实提取物中分离制备，其理化数据如下：
紫红色粉末，1H-NMR(CD3OD+CF3COOD,9:1):矮牵牛花苷元部分8.89(s,H-4),6.97(d,J=1.5Hz,H-6),6.98(d,J=1.5Hz,H-8),7.89(d,J=2.0Hz,H-2′),7.73(d,J=2.0Hz,H-6′),3.95(3H,s,OMe);3-O-β-葡萄糖部分5.51(d,J=7.5Hz,H-1),3.77(dd,J=7.5,9.0Hz,H-2),3.67(t-like,J=9.0Hz,H-3),3.53(dd,J=9.0,9.5Hz,H-4),3.89(m,H-5),4.04(dd,J=11.5,2.0Hz,H-6a),3.77(dd,J=11.5,5.8Hz,H-6b)；鼠李糖部分4.71(brs,H-1),3.85(brs,H-2),3.86(d,J=9.5Hz,H-3),4.89(t-like,J=9.5Hz,H-4),3.78(dd,J=9.5,6.5Hz,H-5),1.09(d,J=6.5Hz,H-6);5-O-β-葡萄糖部分5.18(d,J=8.0Hz,H-1),3.74(m,H-2),3.63(m,H-3),3.57(m,H-4),3.64(m,H-5),3.98(d,J=12.0Hz,H-6a),3.84(dd,J=12.0,6.0Hz,H-6b);反式香豆酰部分7.38(2H,d,J=8.5Hz,H-2andH-6),6.78(2H,d,J=8.5Hz,H-3andH-5),6.19(d,J=16.0Hz,H-7),7.52(d,J=16.0Hz,H-8). 13C-NMR(CD3OD+CF3COOD,9:1):矮牵牛花苷元部分164.4(s,C-2),146.4(s,C-3),134.5(d,C-4),157.3(s,C-5),105.9(d,C-6),170.1(s,C-7),97.8(d,C-8),157.0(s,C-9),113.4(s,C-10),119.9(s,C-1′),109.9(d,C-2′),150.1(s,C-3′),147.9(s,C-4′),146.5(s,C-5′),114.4(d,C-6′);3-O-β-葡萄糖部分103.0(d,C-1),75.0(d,C-2),78.6(d,C-3),71.6(d,C-4),78.0(d,C-5),67.6(t,C-6);鼠李糖部分102.4(d,C-1),72.4(d,C-2),70.7(d,C-3),75.7(d,C-4),68.2(d,C-5),18.1(q,C-6);5-O-β-葡萄糖部分103.1(d,C-1),75.1(d,C-2),78.2(d,C-3),71.3(d,C-4),79.0(d,C-5),62.4(t,C-6);反式香豆酰部分127.5(s,C-1),131.6(2C,d,C-2andC-6),117.2(2C,d,C-3andC-5),161.6(s,C-4),147.4(d,C-7),115.3(d,C-8),169.4(s,C-9).LC-ESI-MS(positive):933(M+).以上数据与文献（Slimestad R.,AabergA.,Andersen Ф.M.,Acylated anthocyanins from petunia flowers,Phytochemistry,1999,50,1084-1086）的petanin数据一致。
1.1.2色谱条件和系统适应性
色谱柱：AlltimaTMC18 5μ 250*4.6mm；流动相：溶剂A为10%HCOOH–H2O,溶剂B为10%HCOOH–CH3CN，A:B=84:16；柱温：35℃；流速：1.0ml/min；检测波长：525nm；理论塔板数按petanin计不应低于3000，供试品中petanin与相邻峰的分离度符合要求。
1.1.3对照品溶液的制备
精密称取对照品petanin适量，加流动相溶液配制成每1ml中约含800μg的溶液， 摇匀，用0.45μm膜滤过，取续滤液，即得。
1.1.4供试品溶液的制备
精密称取黑果枸杞果实提取物适量，加流动相溶液配制成每1ml中约含5.0mg的溶液，摇匀，用0.45μm膜滤过，取续滤液，即得。
1.1.5测定法
分别精密吸取对照品和供试品溶液20μl，注入高效液相色谱仪（见图1和图2），测定，按外标法以峰面积计算，即得。此方法可用于测定黑果枸杞果实提取物中petanin的含量，对该黑果枸杞果实提取物进行质量控制。
1.2方法学考察
1.2.1色谱条件的考察
分别对Kromasil C18 5μ 250*4.6mm、Dikma C18 5μ 250*4.6mm和AlltimaTMC18 5μ250*4.6mm三种十八烷基键合硅胶为填充剂的色谱柱进行研究，AlltimaTMC18柱的峰型和分离度最好，其次是Kromasil C18柱，Dikma C18柱最差。故选择AlltimaTM C18 5μ250*4.6mm作为含量测定用色谱柱。
1.2.2检测波长的选择
取对照品溶液于190～600nm波长范围进行紫外扫描，其在515～535nm波长范围吸收较强，在530nm附近吸收最强，考虑到供试品中含有大量的花青素类成分，其紫外也都在515～535nm波长范围吸收较强，为了能保证其它干扰成分尽量能检测到，我们选择了525nm作为含量测定的检测波长。
1.2.3流动相选择
实验过程中选择了三组流动相：（1）流动相I：A为1%HCOOH-H2O,溶剂B为1%HCOOH-CH3CN，A:B=80:20.（2）流动相II：A为5%HCOOH-H2O,溶剂B为5%HCOOH-CH3CN,A:B=82:18.（3）流动相III：A为10%HCOOH-H2O,溶剂B为10%HCOOH-CH3CN，A:B=84:16.
研究结果表明：采用流动相I时，峰型极差，无分离效果。采用流动相II时，拖尾严重。采用流动相III时，峰型和分离度都很好，符合分析要求，故以流动相体系III为最终条件。
1.2.4空白试验
为了进一步考察实验设计的合理性，按照对照品和供试品溶液一样的制备方法，不加任何样品，配制一份空白溶液，按样品测定方法进行测定，记录色谱图（见图3），结 果表明，在与对照品petanin相应的保留时间处无干扰峰出现，从而证明本方法是合理可行的。
1.2.5标准曲线
精密称取对照品petanin样品16.95mg，置于10ml容量瓶中，加流动相定容至刻度，摇匀，用0.45μm膜滤过，取续滤液，分别精密吸取2,4,6,8,10,15,20μl对照品溶液注入高效液相色谱仪，按照前述色谱条件测定。以峰面积Y为纵坐标，进样量（μg）为横坐标，绘制标准曲线（见图4），得线性方程为：Y=1.51×106X–1.58×106,R2=0.9998,表明在进样量为3.390μg～33.900μg范围内，线性关系良好。
1.2.6稳定性试验
精密称取供试品49.44mg，置于10ml容量瓶中，加流动相溶液溶解并定容至刻度，摇匀，用0.45μm膜滤过，取续滤液，于0,1,2,4,6,8小时，分别精密吸取20μl注入高效液相色谱仪，按照前述色谱条件测定，记录化合物petanin的峰面积，计算含量，测定结果见表1，RSD（%）为0.59，表明供试品溶液在8小时内稳定。
表1.稳定性试验样品含量(μg/ml)测定结果
1.2.7重复性实验
精密称取同一批次的黑果枸杞果实提取物样品6份，按照供试样品溶液的制备方法配制溶液，摇匀，用0.45μm膜滤过，取续滤液，分别精密吸取20μl注入高效液相色谱仪，按照前述色谱条件测定，记录化合物petanin的峰面积，计算含量（%），测定结果见表2，RSD（%）为1.02，表明该实验方法重复良好，符合含量测定要求。
表2.重复性实验样品中化合物petanin含量（%）测定结果
3.2.8回收率试验
精密称取已知含量（16.33%）的黑果枸杞果实提取物样品6份，置于10ml容量瓶 中，分别加入对照品溶液5ml（1.652mg/ml），然后加流动相溶液定容至刻度，摇匀，用0.45μm膜滤过，取续滤液，分别精密吸取20μl注入高效液相色谱仪，按照前述色谱条件测定，计算回收率，结果表明该方法回收率较高(99.61%)，方法准确度高，结果见表3.
表3.加样回收率试验测定结果
1.2.9含量测定
按照研究最后确定的黑果枸杞果实提取物中化合物petanin含量测定方法（色谱柱：AlltimaTM C18 5μ 250*4.6mm；流动相：溶剂A为10%HCOOH-H2O,溶剂B为10%HCOOH-CH3CN，A:B=84:16；柱温：35℃；流速：1.0ml/min；检测波长：525nm）对制备所得样品进行含量测定，其结果见实施例，考虑到黑果枸杞果实批次间的差异，将黑果枸杞果实提取物中矮牵牛单宁（petanin）含量范围定为14%～18%。
实施例2
黑果枸杞果实提取物的提取方法：
（1）提取：将黑果枸杞果实，加入重量浓度为2‰盐酸的水溶液，在温度60℃搅拌提取三次，每次0.5小时，过滤收集提取液；
盐酸的水溶液的重量用量为黑果枸杞果实的8倍；
（2）吸附：将步骤（1）中得到的提取液，通过装有聚苯乙烯—二乙烯苯大孔树脂的层析柱，使黑果枸杞果实提取液得到选择性充分吸附；
（3）洗脱：先用水洗脱步骤（2）中吸附了黑果枸杞果实提取液的层析柱，直至洗脱液为中性或检测无糖反应，再用洗脱液洗脱，收集层析柱流出的洗脱液；
洗脱液由如下重量百分比的组分组成：
酸 2‰
体积浓度为75%的乙醇水溶液 余量
洗脱液的重量用量为步骤（1）中黑果果实的20倍；
所述的酸为盐酸；
（4）浓缩：将步骤（3）中所得洗脱液于60℃条件下减压浓缩回收乙醇，直至25℃时的溶液密度为1.1，得黑果枸杞果实提取物浸膏；
（5）干燥：将步骤（4）中所得黑果枸杞果实提取物浸膏进行冷冻干燥，获得黑果枸杞果实提取物。
采用上述方法获得的黑果枸杞果实提取物，含有：
矮牵牛单宁（petanin)的重量含量为16.33%。
检测方法：采用实施例1的检测方法，其中：
以黑果枸杞果实提取物中所含化合物矮牵牛单宁（petanin）为指标性成分。
色谱条件：色谱系统,Waterse2695+2998PAD检测器；色谱柱，AlltimaTMC18 5μ250*4.6mm；流动相，溶剂A为10%HCOOH–H2O,溶剂B为10%HCOOH–CH3CN，A:B=84:16；柱温35℃；流速，1.0ml/min；检测波长，525nm。
图1为矮牵牛单宁（petanin）对照品液相图谱，图2为黑果枸杞果实提取物中矮牵牛单宁含量测定液相图谱，图3为空白溶液液相图谱，图4为矮牵牛单宁对照品液相色谱(HPLC)含测标准曲线。
其中：矮牵牛单宁（petanin）对照品为从黑果枸杞果实提取物中分离制备得到。
实施例3
黑果枸杞果实提取物的提取方法：
（1）提取：将黑果枸杞果实，加入重量浓度为1‰柠檬酸的水溶液，在温度10℃搅拌提取三次，每次1小时，过滤收集提取液；
酸的水溶液的重量用量为黑果枸杞果实的12倍；
（2）吸附：将步骤（1）中得到的提取液，通过装有聚苯乙烯—二乙烯苯大孔树脂的层析柱，使黑果枸杞果实提取液得到选择性充分吸附；
（3）洗脱：先用水洗脱步骤（2）中吸附了黑果枸杞果实提取液的层析柱，直至洗脱液为中性或检测无糖反应，再用洗脱液洗脱，收集层析柱流出的洗脱液；
洗脱液由如下重量百分比的组分组成：
酸 0.1‰
体积浓度为75%的乙醇水溶液 余量
洗脱液的重量用量为步骤（1）中黑果枸杞果实的15倍；
所述的酸为柠檬酸；
（4）浓缩：将步骤（3）中所得洗脱液于50℃条件下减压浓缩回收乙醇，直至25℃时的溶液密度为1.2，得黑果枸杞果实提取物浸膏；
（5）干燥：将步骤（4）中所得黑果枸杞果实提取物浸膏进行冷冻干燥，获得黑果枸杞果实提取物。
采用上述方法获得的黑果枸杞果实提取物，含有：
矮牵牛单宁（petanin)的重量含量为：15.5%。
检测方法同实施例1。
实施例4
黑果枸杞果实提取物（HGGQ）对CTX诱导白细胞减少模型小鼠外周血白细胞的影响
1.试验目的
观察黑果枸杞果实提取物（HGGQ）对环磷酰胺CTX诱导白细胞减少模型小鼠外周血白细胞的影响。
1.1试验内容
1.1.1试验样品
样品：HGGQ（实施例2中得到的黑果枸杞果实提取物）
环磷酰胺（CTX）：江苏恒瑞医药股份有限公司，200mg/瓶，批号：10110621。
1.1.2配制方法
样品：HGGQ，配制时用生理盐水溶解。
CTX：用生理盐水配制。
1.1.3动物
BALB/c小鼠60只，雌性，体重18－20g，由中科院上海实验动物中心提供。
1.1.4试验方法
取BALB/c小鼠60只，随机分为6组，分别为空白对照组、HGGQ（100mg/kg）+CTX（预防）、HGGQ（200mg/kg）+CTX（预防）、HGGQ（100mg/kg）+CTX（治疗）、HGGQ（200mg/kg）+CTX（治疗）、CTX模型组，每组10只。空白对照组未做任何处理，其他五组均给予CTX腹腔注射（100mg/kg），每天一次，连续给药3天后于第四天用动物血液分析仪测定各组小鼠的白细胞总数，结果均低于空白对照组(均P<0.01)，提示CTX诱导小鼠造血功能障碍模型建立成功。HGGQ+CTX（预防） 组于造模当天同时给药HGGQ 100mg/kg、200mg/kg（口服给药）每天一次，HGGQ+CTX（治疗）在第四天开始给予HGGQ 100mg/kg、200mg/kg（口服给药）每天一次。模型组和空白对照组小鼠于第四天始灌服等量0.5%CMC－Na溶液。
分别于给药前和给药后的第4、6、8、11、13、15天，按常规方法小鼠眼眶静脉取血，测外周血白细胞总数，分析HGGQ对模型小鼠外周血白细胞的影响情况。
1.1.5结果
HGGQ对CTX诱导的小鼠白细胞减少的影响结果见表4。在HGGQ+CTX（预防）组和HGGQ+CTX（治疗）组两种给药方案上与模型组比较，小鼠白细胞数最低点均要略高，白细胞恢复时间快，提示黑果枸杞果实提取物（HGGQ）有升高小鼠外周血白细胞，从而能缓解CTX诱导的小鼠白细胞减少的作用。
表4：小鼠外周血白细胞数的变化表（单位×109/L）
结果表明：黑果枸杞果实提取物在100mg/kg时，在预防（造模同时给药）和治疗（造模后三天给药）两种给药方案上与模型组比较,小鼠白细胞数最低点均要略高，白细胞恢复时间快，提示黑果枸杞果实提取物有升高小鼠外周血白细胞，从而能缓解CTX诱导的小鼠白细胞减少的作用。以上结果表明，所述黑果枸杞果实提取物可以用于细胞毒性药物引起的白细胞减少的治疗。
实施例5
黑果枸杞果实提取物（HGGQ）对苯中毒小鼠白细胞（WBC）减少的治疗作用。
1.试验目的
观察黑果枸杞果实提取物（HGGQ）对苯中毒白细胞（WBC）减少的治疗作用。
1.1试验内容
样品：HGGQ（实施例2中得到的黑果枸杞果实提取物）
苯（分析纯、批号030701-2）购于广州化学试剂厂。
1.2动物
BALB/c小鼠共60只，雌性，体重18－20g，由中科院上海实验动物中心提供。
2.方法
2.1药品及试剂配制
2.1.1HGGQ，配制时用生理盐水溶解。
2.1.2200mg/ml苯-花生油混悬液：20.0g苯加花生油至100ml。
2.2实验分组及处理
将50只小鼠按WBC水平随机分为5组，每组10只，其中4组作为苯中毒组，给苯剂量为2000mg/kg，按10ml/kg灌胃200mg/ml苯-花生油混悬液，每天1次，6d/w，连续灌胃2周。一组作为正常对照组，灌服生理盐水，灌胃量及时间同苯中毒组。在实验第0、1、2周，分别剪尾采血检测白细胞数（WBC）。染苯2周后，选取白细胞数降至4.0×109/L以下的20只小鼠作为苯中毒致白细胞减少小鼠模型。
模型制备实验结束后，按WBC水平将模型小鼠随机分为3组，每组10只。其中设HGGQ两个处理组，即50mg/kg、100mg/kg（口服给药）剂量组，每天1次，6d/w，连续2周；设模型对照组一组，与未经苯处理的正常对照组一样，口服灌胃生理盐水，每 天1次，6d/w。为防治停止染苯后可能出现的WBC自发恢复，在治疗第2周的最后3d，除正常对照组不予处理外，其余3组均同时予以灌胃染苯，方法同复模阶段。
2.3检测指标
在实验第0、1、2、3、4周（后3周是给药治疗的第0、1、2周），分别用剪尾采血法取血20μl加入到血球稀释液中，在血球分析仪上测定白细胞（WBC）。
3.结果
3.1苯2000mg/kg灌胃对小鼠白细胞的影响
染苯前，两组小鼠白细胞数无显著性差异（P>0.05）。染苯1周后，造模小鼠白细胞数下降，明显低于正常对照组（P<0.01）。染苯2周后，造模小鼠白细胞数继续下降，其中30只小鼠WBC降至4.0×109/L以下，而正常对照组小鼠WBC的变化经检验无显著性差异（P>0.05）。以上结果表明，以2000mg/kg苯灌胃2周可使多数小鼠WBC<4.0×109/L而达到造模要求。见表5。
表5 苯灌胃对小鼠白细胞（WBC）数的影响
| 组别 | 剂量（mg/kg） | n | 0w(109/L) | 1w(109/L) | 2w(109/L) |
| 正常对照组 | 0 | 10 | 7.62±0.81 | 8.15±1.98 | 7.29±1.00 |
| 染苯组 | 2000 | 30 | 8.54±1.33 | 4.32±1.05** | 2.38±1.25** |
与正常对照组比较，**P<0.01。
3.2HGGQ对苯中毒小鼠白细胞的影响
给药前，各组造模小鼠白细胞数均明显低于正常对照组（P<0.01）,造模小鼠各组间无显著性差异（P>0.05）。给药1周后，各组造模小鼠白细胞数均有所回升，但仍明显低于正常对照组（P<0.01）。给药2周后，HGGQ（50mg/kg、100mg/kg）组小鼠白细胞数明显高于模型对照组（P<0.01），与正常对照组差异无显著性（P>0.05）。而正常对照组WBC的变化经检验无显著性差异。以上结果表明，HGGQ（50mg/kg、100mg/kg）灌胃治疗2周可对抗苯中毒引起的白细胞减少。见表6。
表6 HGGQ灌胃对苯中毒小鼠白细胞（WBC）的影响
与模型对照组比较，**：P<0.01；与正常对照组比较，▲▲：P<0.01。
4.结论
苯2000mg/kg灌胃小鼠2周后可使WBC降至4.0×109/L以下而复制出苯中毒白细胞减少小鼠模型，而黑果枸杞果实提取物（HGGQ）灌胃50mg/kg、100mg/kg对苯中毒小鼠有明显的升高白细胞的作用。以上结果表明：所述黑果枸杞果实提取物可以用于有毒化学品引起的白细胞减少的治疗。
Claims (16)
1.黑果枸杞果实提取物，其特征在于，是采用包括如下步骤的方法制备的：
（1）提取：将黑果枸杞果实，加入酸的水溶液提取，过滤收集提取液；
（2）吸附：将步骤（1）中得到的提取液，通过装有大孔树脂的层析柱吸附；
（3）洗脱：先用水洗脱步骤（2）中吸附了黑果枸杞果实提取液的层析柱，再用洗脱液洗脱，收集层析柱流出的洗脱液；
（4）浓缩：将步骤（3）所得的洗脱液减压浓缩，得黑果枸杞果实提取物浸膏；
（5）干燥：将步骤（4）中所得黑果枸杞果实提取物浸膏干燥，获得所述黑果枸杞果实提取物。
2.根据权利要求1所述的黑果枸杞果实提取物，其特征在于，步骤（1）中，提取温度10～60℃，提取时间为0.5～3小时。
3.根据权利要求2所述的黑果枸杞果实提取物，其特征在于，步骤（1）中，酸的水溶液的重量用量为黑果枸杞果实的8～12倍。
4.据权利要求3所述的黑果枸杞果实提取物，其特征在于，步骤（1）中，所述的酸选自盐酸、醋酸、甲酸、柠檬酸、草酸或磷酸。
5.根据权利要求1所述的黑果枸杞果实提取物，其特征在于，步骤（2）中，将步骤（1）中得到的提取液，通过装有聚苯乙烯—二乙烯苯大孔树脂的层析柱吸附。
6.根据权利要求1所述的黑果枸杞果实提取物，其特征在于，步骤（3）中，先用水洗脱步骤（2）中吸附了黑果枸杞果实提取液的层析柱，直至洗脱液为中性或检测无糖反应，再用洗脱液洗脱。
7.根据权利要求1所述的黑果枸杞果实提取物，其特征在于，步骤（3）中，所述洗脱液由如下重量百分比的组分组成：
酸 0.1～2‰
体积浓度为75%的乙醇水溶液 余量
洗脱液的重量用量为步骤（1）中黑果枸杞果实重量的15～20倍；
所述的酸为盐酸、醋酸或柠檬酸。
8.根据权利要求1所述的黑果枸杞果实提取物，其特征在于，步骤（5）中，将步骤（4）中所得黑果枸杞果实提取物浸膏进行冷冻干燥。
9.黑果枸杞果实提取物，其特征在于，是采用包括如下步骤的方法制备的：
（1）提取：将黑果枸杞果实，加入重量浓度为1～2‰酸的水溶液，温度10～60℃搅拌提取，提取1～3次，每次0.5～1小时，过滤收集提取液；
酸的水溶液的重量用量为黑果枸杞果实的8～12倍；
所述的酸选自盐酸或柠檬酸；
（2）吸附：将步骤（1）中得到的提取液，通过装有聚苯乙烯—二乙烯苯大孔树脂的层析柱，使黑果枸杞果实提取液得到选择性吸附；
（3）洗脱：先用水洗脱步骤（2）中吸附了黑果枸杞果实提取液的层析柱，直至洗脱液为中性或检测无糖反应，再用洗脱液洗脱，收集层析柱流出的洗脱液；
所述洗脱液由如下重量百分比的组分组成：
酸 0.1～2‰
体积浓度为75%的乙醇水溶液 余量
洗脱液的重量用量为步骤（1）中黑果枸杞果实重量的15～20倍；
所述的酸为盐酸或柠檬酸；
（4）浓缩：将步骤（3）中所得洗脱液于50～60℃条件下减压浓缩回收乙醇，直至25℃时的溶液密度为1.1～1.2，得黑果枸杞果实提取物浸膏；
（5）干燥：将步骤（4）中所得黑果枸杞果实提取物浸膏进行冷冻干燥，获得所述黑果枸杞果果实提取物。
10.黑果枸杞果实提取物，其特征在于，是采用包括如下步骤的方法制备的：
（1）提取：将黑果枸杞果实，加入重量浓度为2‰盐酸的水溶液，在温度60℃搅拌提取三次，每次0.5小时，过滤收集提取液；
盐酸的水溶液的重量用量为黑果枸杞果实的8倍；
（2）吸附：将步骤（1）中得到的提取液，通过装有聚苯乙烯—二乙烯苯大孔树脂的层析柱，使黑果枸杞果实提取液得到选择性吸附；
（3）洗脱：先用水洗脱步骤（2）中吸附了黑果枸杞果实提取液的层析柱，直至洗脱液为中性或检测无糖反应，再用洗脱液洗脱，收集层析柱流出的洗脱液；
洗脱液由如下重量百分比的组分组成：
酸 2‰
体积浓度为75%的乙醇水溶液 余量
洗脱液的重量用量为步骤（1）中黑果果实的20倍；
所述的酸为盐酸；
（4）浓缩：将步骤（3）中所得洗脱液于60℃条件下减压浓缩回收乙醇，直至25℃时的溶液密度为1.1，得黑果枸杞果实提取物浸膏；
（5）干燥：将步骤（4）中所得黑果枸杞果实提取物浸膏进行冷冻干燥，获得黑果枸杞果实提取物；其中：矮牵牛单宁（petanin）的重量含量为16.33%。
11.黑果枸杞果实提取物，其特征在于，是采用包括如下步骤的方法制备的：
（1）提取：将黑果枸杞果实，加入重量浓度为1‰柠檬酸的水溶液，在温度10℃搅拌提取三次，每次1小时，过滤收集提取液；
酸的水溶液的重量用量为黑果枸杞果实的12倍；
（2）吸附：将步骤（1）中得到的提取液，通过装有聚苯乙烯—二乙烯苯大孔树脂的层析柱，使黑果枸杞提取液得到选择性吸附；
（3）洗脱：先用水洗脱步骤（2）中吸附了黑果枸杞果实提取液的层析柱，直至洗脱液为中性或检测无糖反应，再用洗脱液洗脱，收集层析柱流出的洗脱液；
洗脱液由如下重量百分比的组分组成：
酸 0.1‰
体积浓度为75%的乙醇水溶液 余量
洗脱液的重量用量为步骤（1）中黑果枸杞果实的15倍；
所述的酸为柠檬酸；
（4）浓缩：将步骤（3）中所得洗脱液于60℃条件下减压浓缩回收乙醇，直至25℃时的溶液密度为1.2，得黑果枸杞果实提取物浸膏；
（5）干燥：将步骤（4）中所得黑果枸杞果实提取物浸膏进行冷冻干燥，获得黑果枸杞果实提取物，其中：矮牵牛单宁的重量含量为：15.5%。
12.根据权利要求1～9任一项所述的黑果枸杞果实提取物，其特征在于，含有矮牵牛单宁，重量含量为14%～18%。
13.一种药物组合物，其特征在于，包括治疗有效量的权利要求1～12任一项所述的黑果枸杞果实提取物和医药学上可接受的载体。
14.权利要求1～12任一项所述的黑果枸杞果实提取物在制备治疗人体白细胞降低疾病药物中的应用。
15.根据权利要求14所述的应用，其特征在于，所述白细胞降低疾病，是继发性白细胞降低疾病或原发性白细胞降低疾病。
16.根据权利要求15所述的应用，其特征在于，所述继发性白细胞降低疾病为细菌感染、病毒感染、化学药品、抗肿瘤药物或电离辐射引起的白细胞降低，或者是血液病、脾功能亢进或结缔组织疾病；所述原发性疾病为遗传性疾病以及细胞毒类药物引起的白细胞降低。
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