CN113109469A - 枸杞芽茶的检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了枸杞芽茶的检测方法，它是采用高效液相色谱法进行检测。采用本发明方法，可以对枸杞芽茶进行有效检测，监测枸杞芽茶中主要成分的数据，从而对枸杞芽茶的质量进行综合把控；同时，利用该检测方法，还可以有效将枸杞芽茶与其他类似叶芽茶进行区分。

Description

枸杞芽茶的检测方法
技术领域
本发明涉及天然植物的检测方法。
背景技术
古医著《本草纲目》称枸杞芽为天精草，性味苦甘凉，入心肺脾肾四经。《食疗本草》认为它“坚筋耐老、除风、补益筋骨、益人去虚劳”。《日华子本草》认为它“除烦益智、补五劳七伤、壮心气、去皮肤骨结间风、消热毒、散疮肿”。《生草药性备要》认为它“明目、益肾亏，安胎宽中，退热、治妇人崩漏下血”。《药性论》评价它能“补益精诸不足，易颜色变白、明目、安神，和羊肉做羹，益人、甚除风、明目，若渴可煮做饮，代茶饮之。发热清毒烦焖，可单煮汁解之，能消热面毒，主患眼风障，赤膜昏痛，取叶捣汁注眼中”。
目前，枸杞茶枝顶端的嫩芽或嫩叶区分为“成长期”与“成熟期”。成长期就是茶枝持续成长的时期。成长期间采摘顶端的嫩芽、嫩叶，只摘取心芽，为原料制成的茶制成的茶类称为芽茶类。
发明内容
本发明提供了一种关于枸杞芽茶的检测方法，便于对该类产品进行质量控制。
具体地，本发明提供了枸杞芽茶的检测方法，它是采用高效液相色谱法进行检测，色谱条件如下：
a)色谱柱:Waters Symmetry，250mm×4.6mm,5μm
b)检测波长:270±5nm
c)流动相：A为含0.1％甲酸水溶液，流动相B为甲醇，梯度洗脱条件：
Figure BDA0003003834790000011
本发明研究发现，采用对于茶叶的检测条件，使用乙腈流动相进行检测，无法达到良好的分离效果；若采用甲醇作为有机相，也需要水相保持在特定浓度下的酸水溶液，否则也会使得，峰数、分离度、总峰面积明显下降。因此，本发明需要使用甲醇作为有机相，而酸水溶液也需要是0.1％的甲酸水溶液。
其中，所述流动相流速选自0.6-1.0mL/min。如本发明一个案例中，所述流动相流速可以选自0.7mL/min。
其中，还包括如下供试品溶液制备方法：
取待检样品，以含水甲醇提取，制备得到供试品溶液。
甲醇的含水量可以选自60～90％。另外，供试品的提取，也会对检测结果带来一定的影响，主要是由于某些条件的不足，导致化合物提取量较少，不易被检测出来，从而导致质量鉴定结果的与实际产生偏差。
例如：
(1)以样品0.5g，总溶剂使用量50ml，总提取时间80min，甲醇体积分数 70％为提取条件进行实验，提取率均偏低，色谱图中所出色谱峰少。结果见图1。
(2)以样品0.5g，总溶剂使用量40ml，总提取时间60min，甲醇体积分数 90％为提取条件进行实验，测得芦丁提取率为0.6984％，绿原酸提取率0.3402％。提取率均偏低，称样量小，色谱图中所出色谱峰少。结果见图2。
(3)以称样量1.0g，总溶剂使用量50ml，总提取时间40min，甲醇体积分数90％为提取条件进行实验，提取率均偏低，色谱图中所出色谱峰少，提取率均偏低。结果见图3。
故最终确定的提取条件为总溶剂使用量20mL,总提取时间100min，甲醇体积分数70％，样品量1.5g。
本发明通过对多种色谱柱对比，发现色谱柱的型号为Waters Symmetry， 250mm×4.6mm,5μm时，检测效果最佳。
其中，柱温选自25～40℃，例如可以选自25、26、27、28、29、30、31、32、 33、34、35、36、37、38、39、40℃。
本发明还提供了枸杞芽茶的指纹图谱检测方法，它包括如下内容：
(1)取待检样品，以含水甲醇提取，制备供试品溶液；
(2)取供试品溶液，采用上述方法进行检测，得到供试品指纹图谱；
(3)将供试品指纹图谱与标准指纹图谱进行对照，进行相似度对照。
其中，当相似度在0.9以上时，待检样品为合格的枸杞芽茶。
本发明还提供了区分枸杞芽茶与其他茶产品的方法，它包括如下内容：
(1)待检样品，以含水甲醇提取，制备供试品溶液；
(2)取供试品溶液，采用上述方法进行检测，得到供试品指纹图谱；
(3)在相同色谱条件下，将供试品指纹图谱与标准指纹图谱进行对照，进行相似度对照；相似度在0.9以上时，待检样品为枸杞芽茶；相似度低于0.9时，待检样品不属于枸杞芽茶。
所述标准指纹图谱如图9所示。
采用本发明方法，对市售的多种茶叶与枸杞芽茶进行比较，发现该指纹图谱方法可以将枸杞芽茶与其他茶叶区分开来。
采用本发明方法，可以对枸杞芽茶进行有效检测，监测枸杞芽茶中各种成分的数据，从而对枸杞芽茶的质量进行综合把控。
附图说明
图1：不同提取条件(1)所得色谱图。
图2：不同提取条件(2)所得色谱图。
图3：不同提取条件(3)所得色谱图。
图4：色谱条件一色谱图。
图5：色谱条件二色谱图。
图6：色谱条件三色谱图。
图7：色谱条件四色谱图。
图8：色谱条件五色谱图。
图9：枸杞芽茶标准指纹图谱。
图10：30批次枸杞芽茶的叠加指纹图谱。
图11：碧螺春色谱图。
图12：正山小种色谱图。
图13：金骏眉色谱图。
图14：安化黑茶色谱图。
具体实施方式
实施例1本发明检测方法
(1)取枸杞芽茶，70％甲醇水溶液提取后，定容，得到供试品溶液；
(2)将供试品溶液注入高效液相色谱仪，采用如下条件进行检测：
a)色谱柱:Waters Symmetry-C18柱；
b)检测波长:270nm
c)流动相：A为含0.1％甲酸水溶液，流动相B为含甲醇溶液，梯度洗脱条件：
Figure BDA0003003834790000031
实施例2本发明检测方法的考察
1.设备及软件
液相色谱系统：waters e2695液相色谱仪；2998PDA检测器；离心机 (Eppendorf,5810R)；TU-1901双光束紫外可见分光光度计(北京普析通用仪器有限责任公司)；ME204/02电子天平(梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司)；超纯水纯化系统(德国默克集团)；KQ-500DA型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；Empower工作站；中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012 版)。
2.试剂
乙腈(默克股份两合公司，色谱纯)；甲醇(默克股份两合公司，色谱纯)；甲酸(默克股份两合公司，分析级)；乙醇(默克股份两合公司，色谱纯)；水为Milli-Q 超纯水。绿原酸(成都康邦生物科技有限公司，CAS No:327-97-9，20mg， Purity>98％)；芦丁(成都康邦生物科技有限公司，CAS No:153-18-4，20mg， Purity>98％)。
3.条件优化
3.1最大吸收波长的选择
称取1.0gNMH7号样品于50mL离心管中，加入10mL80％甲醇提取液，摇匀，超声提取25min，8000r/min转速离心5min，移取上清液于另一离心管中；剩余芽茶残渣中再加入10mL80％甲醇提取液重复上述提取过程，合并两次提取液定容至25mL，摇匀。提取液经0.45um有机滤膜过滤，所得滤液在紫外光谱 190-400nm下扫描最大吸收波长，实验结果表明，样品在270nm处有最大吸收，所以选择270nm为最大吸收波长。
3.2色谱条件优化
取3.1所得滤液按如下色谱条件注入高效液相色谱，筛选出最佳色谱条件
(1)条件一
a)色谱柱，Waters Symmetry-C18柱250mm×4.6mm,5μm；
b)流动相：A为含0.1％甲酸水溶液，流动相B为含甲醇溶液；
c)检测波长:270nm；
d)柱温:30℃；
e)进样量:10μL；
f)梯度洗脱条件，所得图谱见图4。
Figure BDA0003003834790000041
(2)条件二
a)色谱柱:Waters Symmetry-C18柱，250mm×4.6mm,5μm；
b)流动相：A为含0.1％甲酸水溶液，流动相B为含甲醇溶液；
c)检测波长:270nm；
d)柱温:30℃；
e)进样量:10μL；
f)梯度洗脱条件，所得谱图如图5。
Figure BDA0003003834790000042
(3)条件三
其他条件同条件二，A为含0.3％甲酸水溶液，流动相B为含甲醇溶液；所得谱图如图6。
(4)条件四
a)色谱柱:Waters Symmetry-C18柱，250mm×4.6mm,5μm；
b)流动相：A为含0.1％甲酸水溶液，流动相B为含乙腈溶液；
c)检测波长:270nm；
d)柱温:30℃；
e)进样量:10μL；
f)梯度洗脱条件如下：
Figure BDA0003003834790000043
Figure BDA0003003834790000051
色谱图参见图7。
(5)条件五
a)色谱柱:Agilent ZORBAX SB-C18色谱柱，250mm×4.6mm,5μm；
b)流动相：A为含0.1％甲酸水溶液，流动相B为含甲醇溶液；
c)检测波长:270nm；
d)柱温:30℃；
e)进样量:10μL；
f)梯度洗脱条件如下：
Figure BDA0003003834790000052
色谱图参见图8。
小结：
采用对于茶叶的检测条件，使用乙腈流动相进行检测，无法达到良好的分离效果；若采用甲醇作为有机相，也需要水相保持在特定浓度下的酸水溶液，否则也会使得，峰数、分离度、总峰面积明显下降；
3.2.1不同提取溶剂的影响
称取两份1.0gNMH7号样品于50mL离心管中，分别加入10mL80％甲醇提取液和80％乙醇提取液，按3.1所述方法提取，所得提取液按3.2所述色谱条件注入高效液相色谱，所得色谱图按峰宽30、阈值50。最小峰面积100000处理，将符合条件的所有峰面积相加得到总峰面积，比较甲醇与乙醇提取液对总峰面积的影响，结果见表1。
表1.不同溶剂对峰面积的影响
Figure BDA0003003834790000053
结果表明，甲醇提取液提取芽茶时总峰面积较高，故选取甲醇为提取溶剂。
3.2.2不同流动相的影响
称取两份1.0gNMH7号样品于50mL离心管中，加入10mL80％甲醇提取液，按3.1所述方法提取，所得提取液按3.2所述色谱条件，以甲醇与乙腈不同有机相条件注入高效液相色谱，所得色谱图按峰宽30，阈值50，最小峰面积100000 处理，将符合条件的所有峰面积相加得到总峰面积，比较甲醇与乙腈流动相对总峰面积的影响，结果见表2。
表2.不同有机流动对峰面积的影响
Figure BDA0003003834790000061
3.2.3.水相中甲酸含量的影响
称取两份1.0gNMH7号样品于50mL离心管中，加入10mL80％甲醇提取液，按3.1所述方法提取，所得提取液按3.2所述色谱条件，以0.1％甲酸、0.2％甲酸、 0.3％甲酸不同条件注入高效液相色谱，所得色谱图按峰宽30，阈值50，最小峰面积100000处理，将符合条件的所有峰面积相加得到总峰面积，比较水相中甲酸含量对总峰面积的影响，结果见表3。
表3.水相中甲酸含量对总峰面积的影响
Figure BDA0003003834790000062
4.提取条件选择
按正交实验表4.对称样量、甲醇体积分数、总超声时间及总提取溶剂使用量采用L16(44)正交试验进行正交分析优化提取条件，正交试验因素水平表如下：
表4.正交试验因素水平表
Figure BDA0003003834790000063
按表5.所述实验方案，3.2所述色谱条件测定绿原酸与芦丁的提取率，得结果如下：
表5.正交实验因素、水平组合及结果
Figure BDA0003003834790000064
对表5所得结果分析如下：
表6.各因素对芦丁提取率显著性F检验
Figure BDA0003003834790000071
表7.各因素对绿原酸提取率显著性F检验
Figure BDA0003003834790000072
由上表可知，各因素对芦丁提取率显著性影响为总溶剂使用量<称样量<甲醇体积分数<总提取时间；因素对绿原酸提取率显著性影响为总溶剂使用量<称样量 <总提取时间<甲醇体积分数。总溶剂使用量对芦丁与绿原酸提取率没影响(显著性>0.05)。芦丁提取率最佳提取条件为总溶剂使用量30mL,总提取时间100min，甲醇体积分数80％，称样量0.5g；绿原酸提取率最佳提取条件为甲醇体积分数。在甲醇体积分数为60％-80％范围内，对芦丁提取率与绿原酸提取率的影响相反，故选取70％为最佳甲醇体积分数，考虑称样量越大，总溶剂使用量越小，得到的峰数与峰面积越大，故最终确定的提取条件为总溶剂使用量20mL,总提取时间 100min，甲醇体积分数70％，称样量1.5g。
5.方法学考察
5.1稳定性考察
称取1.5g S14号样品于50mL离心管中，加入10mL70％甲醇提取液，摇匀，超声提取50min，8000r/min转速离心5min，移取上清液于另一离心管中；剩余芽茶残渣中再加入10mL70％甲醇提取液重复上述提取过程，合并两次提取液定容至20mL，摇匀。提取液经0.45um有机滤膜过滤，所得滤液按3.2所述色谱条件分别于0、2、4、6、8、10、12、24h进样检测，以芦丁的保留时间和峰面积为参考，计算其相对保留时间及相对峰面积，主要共有峰相对保留时间的相对标准偏差(RSD)均小于3.0％；峰面积的RSD均小于3.0％，表明样品在24h内相对稳定(表8-表9)
表8稳定性实验结果-相对保留时间
Figure BDA0003003834790000073
Figure BDA0003003834790000081
表9.稳定性实验结果-相对峰面积
Figure BDA0003003834790000082
5.2精密度考察
称取1.5g S14号样品于50mL离心管中，按照上述提取方法提取，3.2所述色谱条件连续进样9次，以芦丁的保留时间和峰面积为参考，计算其相对保留时间及相对面积，主要共有峰保留时间的RSD均小于3.0％；峰面积的RSD均小于3.0％，表明仪器的精密度良好(表10-表11)
表10.精密度实验结果-相对保留时间
Figure BDA0003003834790000083
表11.精密度实验结果-相对峰时间
Figure BDA0003003834790000091
5.3重现性考察
称取S14号样品7份，按照上述提取方法提取，3.2所述色谱条件分别进样，以芦丁的保留时间和峰面积为参考，计算其相对保留时间及相对面积，见表 12-13.
表12.重现性实验结果-相对保留时间
Figure BDA0003003834790000092
表13.重现性实验结果-相对峰面积
Figure BDA0003003834790000093
Figure BDA0003003834790000101
6结果与分析
6.1供试品测定
在上述同一条件下，连续测定30批次枸杞芽茶样品的HPLC指纹图谱。样品信息如下：
表14.样品信息表
Figure BDA0003003834790000102
6.2指纹图谱
根据以上30批样品测定结果所给出的峰数和峰位等相关参数，得到标准指纹图谱见图9。
6.3指纹图谱建立与相似度评价
将所得的30批次枸杞芽茶HPLC图谱依次导入国家药典委员会研制的《中药色谱指纹图谱相似度评价系统软件》(2012版)，以S1批样品谱图作为参照谱进行指纹匹配，确定了13个共有峰，建立了枸杞芽茶特征指纹图谱的共有模式，并进行了相似度计算，30批次药材的叠加指纹图谱，见图10，共有峰匹配结果见表15，13个指纹峰相对保留时间如表16所示，共有指纹峰相对峰面积如表17(所示，枸杞芽茶与对照指纹图谱的相似度见表18。相似度在0.9以上时，待检样品为合格的枸杞芽茶。
表15.共有峰匹配结果
Figure BDA0003003834790000111
表16.枸杞芽茶HPLC指纹图谱共有峰保留时间
Figure BDA0003003834790000121
表16.枸杞芽茶HPLC指纹图谱共有峰保留时间(续)
Figure BDA0003003834790000122
Figure BDA0003003834790000131
表17.枸杞芽茶HPLC指纹图谱共有峰峰面积
Figure BDA0003003834790000132
表17.枸杞芽茶HPLC指纹图谱共有峰峰面积(续1)
Figure BDA0003003834790000133

Claims (10)

1.枸杞芽茶的检测方法，其特征在于：它是采用高效液相色谱法进行检测，色谱条件如下：
a)色谱柱:C18；
b)检测波长:270±5nm
c)流动相：A为含0.1％甲酸水溶液，流动相B为甲醇，梯度洗脱条件：
Figure FDA0003003834780000011
2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：所述流动相流速选自0.6-1.0mL/min。
3.根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于：所述流动相流速选自0.7mL/min。
4.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：还包括如下供试品溶液制备方法：
取待检样品，以含水甲醇提取，制备得到供试品溶液；进一步地，样品量1.5g，总溶剂使用量20mL,总提取时间100min，甲醇体积分数70％。
5.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：所述色谱柱的型号为WatersSymmetry，250mm×4.6mm,5μm。
6.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：柱温选自25～40℃；进一步地，选自30±2℃。
7.枸杞芽茶的指纹图谱检测方法，它包括如下内容：
(1)取待检样品，以含水甲醇提取，制备供试品溶液；
(2)取供试品溶液，采用权利要求1-4任意一项所述方法进行检测，得到供试品指纹图谱；
(3)将供试品指纹图谱与标准指纹图谱进行对照，进行相似度对照。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：相似度在0.9以上时，待检样品为合格的枸杞芽茶。
9.区分枸杞芽茶与其他茶产品的方法，其特征在于：它包括如下内容：
(1)待检样品，以含水甲醇提取，制备供试品溶液；
(2)取供试品溶液，采用权利要求1-4任意一项所述方法进行检测，得到供试品指纹图谱；
(3)将供试品指纹图谱与标准指纹图谱进行对照，进行相似度对照；相似度在0.9以上时，待检样品为枸杞芽茶；相似度低于0.9时，待检样品不属于枸杞芽茶。
10.根据权利要求7～9所述的方法，其特征在于：所述标准指纹图谱如下图9所示。
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