CN108982696A - 六神曲指纹图谱的检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了六神曲指纹图谱的检测方法，六神曲指纹图谱建立包括以下步骤：步骤1、六神曲供试品溶液的制备；步骤2、混合对照品溶液的制备：步骤3、分别精密吸取供试品溶液注入液相色谱仪，记录色谱图；步骤4，将步骤3中获得的六神曲指纹图谱仪器导出，并导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统，选择不同批次六神曲的色谱图中均存在的色谱峰作为共有峰；用平均值计算法生成六神曲的对照指纹图谱；计算各共有峰的相对保留时间、相对峰面积。本发明所提供的六神曲指纹图谱，能全面，客观地表征六神曲的质量。本发明提供的指纹图谱的检测方法具有方法简便、稳定、精密度高、重现性好等优点。

Description

六神曲指纹图谱的检测方法

技术领域

本发明涉及一种中药的检测方法，具体涉及六神曲指纹图谱的检测方法。

背景技术

指纹图谱是指某些复杂物质，比如中药，某种生物体或某种组织或细胞的DNA，蛋白质经适当处理后，采用一定的分析手段，得到的能够标示其化学特征的色谱图或光谱图。中药指纹图谱是一种综合的，可量化的鉴定手段，它是建立在中药化学成分系统研究的基础上，主要用于评价中药材以及中药制剂质量的真实性、优良性和稳定性。中药及其制剂均为多组分复杂体系，因此评价其质量应采用与之相适应的，能提供丰富鉴别信息的检测方法，建立中药指纹图谱将能较为全面地反映中药及其制剂中所含化学成分的种类与数量，进而对药品质量进行整体描述和评价。

六神曲为中药名，也叫神曲、六曲，出自《本草便读》，为《药性论》记载的神曲之处方名^[1]。《中华人民共和国卫生部药品标准》记载有此中成药的部颁标准，由苦杏仁、赤小豆粉碎成粗粉，与面粉、麦麸混匀，另取辣蓼、青蒿、苍耳草加水煎煮1小时，滤过，滤液浓缩成清膏，趁热与上述药粉拌匀，保持适当温度和湿度，自然发酵至表面遍生黄白色或灰白色霉衣，取出，粉碎，干燥，即得此曲剂^[2]。本品含淀粉酶、酵母菌、挥发油、酚酸类及B族维生素^[2]。本品为不规则细小块状或粗颗粒状物，表面灰白色至微黄色，粗糙，质脆易碎，有陈腐气，味微苦。六神曲主要是用于健脾和胃，消食调中，适用于脾胃虚弱，饮食停滞，胸痞腹胀，小儿食积。该药物属于促进脾胃消化功能以及促进肠道蠕动，有可能会造成多食易饥，为医生处方药。本发明采用高效液相色谱法建立六神曲的指纹图谱检测方法，为六神曲的药材鉴别、质量评价以及质量标准的制定具有重要的意义。

发明内容

发明目的：本发明的目的是解决现有技术的不足，提供一种六神曲的指纹图谱检测方法，该检测方法可以客观、全面、准确的评价六神曲的质量，对控制六神曲的质量和保证临床疗效具有重要意义。

技术方案：为了实现上述目的，本发明采取的技术方案为：

一种六神曲指纹图谱的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤1、六神曲供试品溶液的制备：

取不同批次的六神曲，打粉，过筛，分别精密称取六神曲粉末样品，置锥形瓶中，加石油醚，超声处理，过滤，取滤渣加甲醇，回流提取，过滤，浓缩滤液，加甲醇定容，过0.45μm微孔滤膜，得供试品溶液；

步骤2、混合对照品溶液的制备：

精密称定隐绿原酸、没食子酸、异绿原酸A、和厚朴酚对照品，置于容量瓶中，用乙醇定容至刻度，摇匀，制成混合对照品溶液；

步骤3、分别精密吸取供试品溶液和对照品溶液，注入高效液相色谱仪，记录色谱图；

步骤4，将步骤3中获得的六神曲供试品溶液的指纹图谱导出，并导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004A；选择不同批次六神曲的色谱图中均存在的色谱峰作为共有峰；用平均值计算法生成六神曲的对照指纹图谱，计算各共有峰的相对保留时间和相对峰面积；并根据混合对照品溶液色谱图的保留时间标注对照指纹图谱中峰的化学成分。

作为优选方案，以上所述的六神曲指纹图谱的检测方法，步骤1六神曲供试品溶液制备方法为：取12批次的六神曲，打粉，过65目筛，精密称取六神曲粉末样品7.5g置100mL锥形瓶中，加石油醚30mL，超声处理30min，过滤，滤渣加甲醇40mL，回流提取1h，过滤，滤液浓缩至2～3mL，加甲醇定容成5mL，过0.22μm微孔滤膜，得供试品溶液。

作为优选方案，以上所述的六神曲指纹图谱的检测方法，步骤2混合对照品溶液的制备：取精密称定隐绿原酸、没食子酸、异绿原酸A、和厚朴酚对照品，置于容量瓶中，用乙醇定容至刻度，摇匀，制成0.1094mg/mL的没食子酸、0.1092mg/mL隐绿原酸、0.1072mg/mL的异绿原酸A、0.1112mg/mL的和厚朴酚组成的混合对照品溶液。

作为优选方案，以上所述的六神曲指纹图谱的检测方法，步骤3中，液相色谱条件为：色谱柱：YMC-Pack ODS-A，流动相：乙腈和0.05％磷酸水，二极管阵列检测器，检测波长：280nm，柱温30℃，流速1mL/min，进样体积：10μL，梯度洗脱程序如下表：

作为优选方案，以上所述的六神曲指纹图谱的检测方法，其特征在于，检测四种成分含量。

指纹图谱检测条件的优化：

1、在样品溶液的制备优化方面

本发明通过对不同提取方法(超声、回流、渗漉等)及不同提取溶剂(石油醚、正丁醇、甲醇、水、70％乙醇水溶液、85％乙醇水溶液、95％乙醇、无水乙醇)、进行实验比较，结果发现超声提取与回流提取所得的谱图差异较小，故采用超声和回流提取的方法；对提取溶剂的考察中发现单纯用甲醇提取低极性杂质干扰较大，因此先采用石油醚提取去杂然后再采用甲醇提取获得色谱图信息量最多，成分含量最高；所以选用先石油醚超声去杂，再用甲醇回流进行提取。

2、在色谱条件进行优化方面

(1)本发明采用二极管阵列检测器对检测波长进行考察，提取254nm、280nm、286nm、300nm处的色谱图，发现检测波长为280nm时，色谱图所包含的信息量最全面且基线平稳，故选280nm为检测波长；

(2)对流速(1ml/min、0.8ml/min、0.7ml/min、0.6ml/min、0.5ml/min)进行筛选，因六神曲中的成分中多存在同分异构体及其它极性极为相似的成分，故高流速下无法将其分开，故在低流速下分离效果较好，最终在流速为1ml/min多次等梯度条件下将极性相似的物质分开。

(3)由于六神曲中的成分中多存在同分异构体及其它极性极为相似的成分，因此流动相组成对分离度非常重要。本发明比较了甲醇-水，乙腈-水，乙腈-0.1％甲酸，乙腈和0.05％磷酸水，乙腈-0.1％磷酸水5个不同洗脱系统在不同梯度下的洗脱效果。结果发现以乙腈和0.05％磷酸水，为流动相时，六神曲中各成分能达到很好的分离效果，其它流动相不能将隐绿原酸、没食子酸、异绿原酸A、和厚朴酚实现良好的分离。故本发明最终选定以乙腈和0.05％磷酸水为最佳的流动相。

(4)由于六神曲中的成分中多存在同分异构体及其它极性极为相似的成分，因此流动相的梯度洗脱程序对分离度非常重要。本发明考察了在流动相不同梯度下的洗脱情况，发现不同的洗脱梯度指纹图谱分离效果明显不同，经过大量优选实验，采用权利要求1最佳的梯度洗脱程序，可以检测到30种以上的共有峰，且分离度良好。因此本发明选择以下最佳的梯度洗脱程序。

有益效果：

1、本发明根据六神曲中所含的活性成分的结构性质特点，通过大量实验筛选出最佳的流动相组成，梯度洗脱程序、流速，检测波长、色谱柱，柱温等分析条件，经多次实验验证表明，本发明提供的六神曲指纹图谱检测方法，可以全面、客观、准确的检测和评价六神曲的质量，为保证临床六神曲疗效具有重要意义。

2、用本发明所提供的方法所建立的六神曲指纹图谱，能有效地表征六神曲的质量，从图3的指纹图谱可以直观的反应出不同厂家产品的风数量及峰高都有很大的差异，注重整体面貌特征，既可避免因测定个别化学成分而判定六神曲质量的片面性，又可减少为质量达标而人为处理的可能性。

3、本发明提供的六神曲指纹图谱的检测方法，具有方法简便、稳定性好、精密度高、重现性好等优点。

附图说明

图1为本发明混合标准品色图谱。

图2为本发明的六神曲样品的色图谱。

图3为本发明六神曲样品的12批次供试品指纹图谱。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

实施例用到的仪器与试剂如下：

实验器材

1.1仪器

日本岛津公司全波段扫描(200-400nm)高液相色谱系统，包括全自动在线脱气系统，全自动进样系统Prominence SIL-20A，二极管阵列检测器SPD-M20A和自动温控柱温箱CTO-20A，KQ3200DB型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)，BP121S电子分析天平(SARTORIUS)。

1.2药品与试剂

六神曲样品：S1-S3(四川辅正药业股份有限公司)购自江苏省中医院药房；S4-S9(四川百胜药业有限公司)购自亳州药材市场；S10-S12(四川千方中药股份有限公司)购自亳州药材市场，均由南京海源中药饮片有限公司中药师丁菲鉴定；没食子酸(批号130711)购自成都瑞芬思生物科技有限公司；隐绿原酸(批号150728)和异绿原酸A(批号151028)均购自于南京森贝伽生物科技有限公司；和厚朴酚(批号730-8803)购自中国药品生物制品检验所；甲醇(分析纯)；石油醚(分析纯)；乙醚(分析纯)；磷酸(分析纯)；乙腈(色谱纯)。

实施例1一种六神曲指纹图谱的检测方法，包括以下步骤：

步骤1、六神曲供试品溶液的制备：

取以上12批六神曲，打粉，过65目筛，精密称取六神曲粉末样品7.5g置100mL锥形瓶中，加石油醚30mL，超声处理30min，过滤，滤渣加甲醇40mL，回流1h，过滤，滤液浓缩至2～3mL，加甲醇定容成5mL，过0.22μm微孔滤膜，即得供试品溶液。

步骤2、混合对照品溶液的制备：

取精密称定隐绿原酸、没食子酸、异绿原酸A、和厚朴酚对照品，置于容量瓶中，用乙醇定容至刻度，摇匀，制成0.1094mg/mL的没食子酸、0.1092mg/mL隐绿原酸、0.1072mg/mL的异绿原酸A、0.1112mg/mL的和厚朴酚组成的混合对照品溶液。色谱图如图1

步骤3、分别精密吸取12批六神曲供试品溶液和对照品溶液，注入高效液相色谱仪，记录色谱图；液相色谱条件为：色谱柱：YMC-Pack ODS-A，流动相：乙腈和0.05％磷酸水，二极管阵列检测器，检测波长：280nm，柱温30℃，流速1mL/min，进样体积：10μL，梯度洗脱程序如下表：

步骤4，将步骤3中获得的12批六神曲供试品溶液的指纹图谱导出，并导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004A；对照指纹图谱见图2，12批次供试品的指纹图谱如图3所示。隐绿原酸保留时间为37.57min，没食子酸保留时间为46.72min，异绿原酸A的保留时间为62.55min，和厚朴酚的保留时间为106.57min。

指纹图谱检测方法的法学研究：

1、精密度研究

按实施例1方法制备的样品编号为S1供试品溶液，按照实施例1的检测方法分析，平行进样6次，进样量为10μL，以没食子酸、隐绿原酸、异绿原酸A、和厚朴酚为参照峰，通过分析样品HPLC指纹图谱的共有峰的峰面积及保留时间并计算RSD(％)值0.12、1.52；2.12、2.64；1.55、2.49；1.04、2.56，采用“中药色谱相似度评价软件2004A”进行指纹图谱比对，结果表明该设备的平行进样精密性良好。

2、稳定性研究

按实施例1方法制备的样品编号为S1供试品溶液，按照实施例1的检测方法分析，采用0、2、6、12、18、24小时不同时间进样分析，进样量为10μL，以没食子酸、隐绿原酸、异绿原酸A、和厚朴酚为参照峰，通过分析样品HPLC指纹图谱的共有峰的峰面积及保留时间并计算RSD(％)值2.14、2.72；2.15、1.67；0.83、0.63；2.24、1.63，表明六神曲供试品溶液在24h之内的色谱峰几乎没有变化，稳定性非常好。

3、重复性研究

平行精密称取编号为S1样品六份，每份六神曲中药的重量为7.5g，按照2.3项的方法制成6份同样的供试品溶液，参照实施例1的色谱条件，进样量为10μL，以没食子酸、隐绿原酸、异绿原酸A、和厚朴酚为参照峰，通过分析样品HPLC指纹图谱的共有峰的峰面积及保留时间并计算RSD(％)值1.46、2.15；1.45、3.05；0.82、2.12；1.52、2.89，结果表明样品色谱峰重现性好，该方法的重复性良好。

以上实验结果表明，本发明提供的六神曲指纹图谱检测方法，稳定性好，精密度高，重复性好，能全面客观评价六神曲的质量，为保证临床疗效具有重要的意义。

以上实施例仅为本发明的示例性实施例，不用于限制本发明，本发明的保护范围由权利要求书限定。本领域技术人员可以在本发明的实质和保护范围内，对本发明做出各种修改或等同替换，这种修改或等同替换也应视为落在本发明的保护范围内。

Claims (6)

1.一种六神曲指纹图谱的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤1、六神曲供试品溶液的制备：

取不同批次的六神曲，打粉，过筛，分别精密称取六神曲粉末样品，置锥形瓶中，加有机溶剂，提取，过滤，取滤渣加甲醇，回流提取，过滤，浓缩滤液，加甲醇定容，过0.22μm微孔滤膜，得供试品溶液；

步骤2、混合对照品溶液的制备：

精密称定隐绿原酸、没食子酸、异绿原酸A、和厚朴酚对照品，置于容量瓶中，用乙醇定容至刻度，摇匀，制成混合对照品溶液；

步骤3、分别精密吸取供试品溶液和对照品溶液，注入高效液相色谱仪，记录色谱图；

步骤4，将步骤3中获得的六神曲供试品溶液的指纹图谱导出，并导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004A；选择不同批次六神曲的色谱图中均存在的色谱峰作为共有峰；用平均值计算法生成六神曲的对照指纹图谱，计算各共有峰的相对保留时间和相对峰面积；并根据混合对照品溶液色谱图的保留时间标注对照指纹图谱中峰的化学成分。

2.根据权利要求1所述的六神曲指纹图谱的检测方法，其特征在于，步骤1六神曲供试品溶液制备方法为：取12批次的六神曲，打粉，过65目筛，精密称取六神曲粉末样品7.5g置100mL锥形瓶中，加石油醚30mL，超声处理30min，过滤，滤渣加甲醇40mL，回流提取1h，过滤，滤液浓缩至2～3mL，加甲醇定容成5mL，过0.22μm微孔滤膜，得供试品溶液。

3.根据权利要求1所述的六神曲指纹图谱的检测方法，其特征在于，步骤2混合对照品溶液的制备：取精密称定隐绿原酸、没食子酸、异绿原酸A、和厚朴酚对照品，置于容量瓶中，用乙醇定容至刻度，摇匀，制成0.1094mg/mL的没食子酸、0.1092mg/mL隐绿原酸、0.1072mg/mL的异绿原酸A、0.1112mg/mL的和厚朴酚组成的混合对照品溶液。

4.根据权利要求1至3任一项所述的六神曲指纹图谱的检测方法，其特征在于，步骤3中，液相色谱条件为：色谱柱：YMC-Pack ODS-A，流动相：乙腈和0.05％磷酸水，梯度洗脱，二极管阵列检测器，检测波长：280nm，柱温30℃，流速1mL/min，进样体积：10μL。

5.根据权利要求4所述的六神曲指纹图谱的检测方法，其特征在于，梯度洗脱程序如下表：

6.根据权利要求1所述的六神曲指纹图谱的检测方法，其特征在于，可可检测30种以上的共有色谱峰。