CN115015423B - 芍药甘草汤中17种化学成分的含量测定方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种芍药甘草汤中17种化学成分的含量测定方法，属于药物检测技术领域，所述含量测定方法是取没食子酸、异甘草苷、丹皮酚、芍药内酯苷、芍药苷、芍药内酯B、苯甲酸、柚皮素、苯甲酰芍药苷、芹糖甘草苷、甘草苷、芒柄花黄素、新甘草苷、3'‑去氧苏木酮A、异甘草素、甘草素和甘草酸制备对照品标准溶液；取芍药甘草汤制备供试品溶液；再分别对对照品标准溶液和供试品溶液进行高效液相色谱检测，然后利用外标法，计算得芍药甘草汤中17种化学成分的含量。本发明建立了HPLC检测芍药甘草汤中17种化学成分的含量测定方法，实现对经典名方芍药甘草汤中多个指标成分的控制。

Description

芍药甘草汤中17种化学成分的含量测定方法
技术领域
本发明涉及药物检测技术，尤其涉及一种芍药甘草汤中17种化学成分的含量测定方法。
背景技术
芍药甘草汤是出自于张仲景的《伤寒论》，由芍药和甘草两味药组成，临床应用历史悠久，安全性高，疗效确切。芍药甘草汤主治阴血、津液亏虚，筋脉失养而导致的筋脉、肌肉拘急、痉挛等病症，还可以很好的预防心脏病、治疗静脉曲张等。芍药甘草汤虽只有两味药，但却有酸甘化阴、调和肝脾、柔筋止痛的作用。古代，尤其汉代张仲景时期，芍药无赤芍和白芍之分，而是到宋代以后，才有赤、白芍之分。
根据芍药甘草汤的主治，方中芍药为白芍，白芍味苦酸、微寒，入肝经，酸能收敛、微寒养血滋阴。中医认为肝主筋，所以白芍可以养血柔肝、柔筋，缓解筋脉的拘急、痉挛。甘草味甘，能缓急，被尊称为“国老”，能入脾补养气血，与白芍相配能养血柔肝、缓急止痛，所以本方适合于痉挛性的疼痛类疾病。
目前，关于芍药甘草汤质量控制的文献中，主要是构建指纹图谱和建立了部分化学成分的质量检测，如异甘草苷、异甘草素、甘草酸、芍药苷等，但现有的检测方法需要配置成不同的浓度，多次进样才能对多种物质进行检测，检测过程繁琐，且目前的检测方法仅仅是对几种化学成分进行检测，检测指标较少，难以全面评价芍药甘草汤的质量。
发明内容
针对上述问题，本发明提供一种芍药甘草汤中17种化学成分的含量测定方法。
为实现上述目的，本发明所采用的技术方案为：
一种芍药甘草汤中17种化学成分的含量测定方法，所述含量测定方法包括以下步骤：
取没食子酸、异甘草苷、丹皮酚、芍药内酯苷、芍药苷、芍药内酯B、苯甲酸、柚皮素、苯甲酰芍药苷、芹糖甘草苷、甘草苷、芒柄花黄素、新甘草苷、3'-去氧苏木酮A、异甘草素、甘草素和甘草酸共17种化学成分制备对照品标准溶液；
取芍药甘草汤制备供试品溶液；
分别取对照品标准溶液和供试品溶液进行高效液相色谱检测，再利用外标法，分别计算得芍药甘草汤中没食子酸、异甘草苷、丹皮酚、芍药内酯苷、芍药苷、芍药内酯B、苯甲酸、柚皮素、苯甲酰芍药苷、甘草中芹糖甘草苷、甘草苷、芒柄花黄素、新甘草苷、3'-去氧苏木酮A、异甘草素、甘草素和甘草酸的含量；
其中，高效液相色谱检测过程中，以乙腈为流动相A，以0.1wt％的甲酸水溶液为流动相B。
进一步的，所述高效液相色谱检测的洗脱方式为梯度洗脱，洗脱条件为：
0～5min，5％→13％流动相A，95％→87％流动相B；
5～15min，13％→23％流动相A，87％→77％流动相B；
15～40min，23％→50％流动相A，77％→50％流动相B；
40～55min，50％→100％流动相A，50％→0％流动相B；
55～55.01min，100％→5％流动相A，0％→95％流动相B；
55.01～65min，5％流动相A，95％流动相B。
进一步的，所述供试品溶液是取芍药甘草汤加入0.5wt％的氢氧化钠水溶液，超声溶解，再加入乙醇稀释，制得。
进一步的，所述供试品溶液包括以下步骤：
取0.1重量份芍药甘草汤，加入0.5wt％的氢氧化钠水溶液至10体积份，超声溶解，得溶解液；
取1体积份溶解液，再加入乙醇稀释至10体积份，摇匀，即得所述供试品溶液。
进一步的，所述高效液相色谱检测的色谱条件为：
色谱柱：YMC-Triart C18色谱柱；流速0.6mL/min；柱温35℃；检测波长230nm。
一种芍药甘草汤中17种化学成分的含量测定方法，所述含量测定方法包括以下步骤：
取没食子酸、异甘草苷、丹皮酚、芍药内酯苷、芍药苷、芍药内酯B、苯甲酸、柚皮素、苯甲酰芍药苷、芹糖甘草苷、甘草苷、芒柄花黄素、新甘草苷、3'-去氧苏木酮A、异甘草素、甘草素和甘草酸共17种化学成分制备制备不同浓度的对照品标准系列溶液；
分别取制备不同浓度的对照品标准系列溶液进行高效液相色谱检测，并根据不同化学成分的浓度和相应化学成分对应浓度测定的峰面积，绘制不同化学成分对应的标准曲线；
取芍药甘草汤制备供试品溶液；
分别对供试品溶液进行高效液相色谱检测，所得相应化学成分的峰面积代入相应的标准曲线，经计算，即得所述芍药甘草汤中相应化学成分的含量；
其中，高效液相色谱检测过程中，以乙腈为流动相A，以0.1wt％的甲酸水溶液为流动相B。
进一步的，所述高效液相色谱检测的洗脱方式为梯度洗脱，洗脱条件为：
0～5min，5％→13％流动相A，95％→87％流动相B；
5～15min，13％→23％流动相A，87％→77％流动相B；
15～40min，23％→50％流动相A，77％→50％流动相B；
40～55min，50％→100％流动相A，50％→0％流动相B；
55～55.01min，100％→5％流动相A，0％→95％流动相B；
55.01～65min，5％流动相A，95％流动相B；
所述高效液相色谱检测的色谱条件为：
色谱柱：YMC-Triart C18色谱柱；流速0.6mL/min；柱温35℃；检测波长230nm。
进一步的，所述供试品溶液是取芍药甘草汤加入0.5wt％的氢氧化钠水溶液，超声溶解，再加入乙醇稀释，制得；
所述供试品溶液制备的具体步骤包括：
取0.1重量份芍药甘草汤，加入0.5wt％的氢氧化钠水溶液至10体积份，超声溶解，得溶解液；
取1体积份溶解液，再加入乙醇稀释至10体积份，摇匀，即得所述供试品溶液。
进一步的，所述不同浓度的对照品标准系列溶液中没食子酸的浓度在2.705～135.274μg/mL之间、异甘草苷的浓度在0.8025～40.125μg/mL之间、丹皮酚的浓度在0.0083～0.415μg/mL之间、芍药内酯苷的浓度在1.725～86.249μg/mL之间、芍药苷的浓度在6.372～318.615μg/mL之间、芹糖甘草苷的浓度在8.635～431.743μg/mL之间、甘草苷的浓度在1.918～95.893μg/mL之间、芍药内酯B的浓度在0.122～6.124μg/mL之间、苯甲酸的浓度在0.0864～6.124μg/mL之间、柚皮素的浓度在0.208～10.41μg/mL之间、芒柄花黄素的浓度在0.158～7.92μg/mL之间、新甘草苷的浓度在0.128～6.42μg/mL之间、3’-去氧苏木酮A的浓度在0.167～8.367μg/mL之间、异甘草素的浓度在0.289～14.427μg/mL之间、甘草素的浓度在0.362～18.124μg/mL之间、苯甲酰芍药苷的浓度在3.465～173.24μg/mL之间和甘草酸的浓度在9.802～490.079μg/mL之间。
进一步的，所述不同化学成分对应的标准曲线如下：
没食子酸对应的标准曲线为y＝7893.9x+10.438，R2＝1.000；
异甘草苷对应的标准曲线y＝95117x+8090.5，R2＝0.9999；
丹皮酚对应的标准曲线为y＝874711x-597.18，R2＝1.000；
芍药内酯苷对应的标准曲线为y＝4789x-1561.8，R2＝0.9995；
芍药苷对应的标准曲线为y＝12301x+21868，R2＝0.9996；
芹糖甘草苷对应的标准曲线为y＝8142.2x-3638.1，R2＝0.9993；
甘草苷对应的标准曲线为y＝19786x+11017，R2＝0.9996；
芍药内酯B对应的标准曲线为y＝47442x+629.14，R2＝0.9996；
苯甲酸对应的标准曲线为y＝106956x-899.14，R2＝1.000；
柚皮素对应的标准曲线为y＝40543x-1700.9，R2＝0.9996；
芒柄花黄素对应的标准曲线为y＝40417x-1051.9，R2＝0.9994；
新甘草苷对应的标准曲线为y＝61161x-1294，R2＝0.9998；
3’-去氧苏木酮A对应的标准曲线为y＝49390x+298.4，R2＝0.9999；
异甘草素对应的标准曲线为y＝28818x-272.07，R2＝0.9998；
甘草素对应的标准曲线为y＝16997x+371.77，R2＝0.9998；
苯甲酰芍药苷对应的标准曲线为y＝1684.4x-587.75，R2＝0.9999；
甘草酸对应的标准曲线为y＝5868.1x+14514，R2＝0.9995。
本发明的芍药甘草汤中17种化学成分的含量测定方法的有益效果为：
由于芍药甘草汤的品质受药材来源、饮片炮制、配伍比例、制备工艺等影响，且所制芍药甘草汤化学成分复杂，将芍药甘草汤中化学成分量化，有利于保证芍药甘草汤的质量及疗效；
本发明建立了HPLC检测芍药甘草汤中17种化学成分的含量测定方法，实现对经典名方芍药甘草汤中多个指标成分的控制；
本发明的含量测定方法通过调整工艺参数和前处理条件，实现了一次测定17种化学成分，能够快速、简便的获知芍药甘草汤的质量情况，解决了现有技术的检测方法仅能够一次测定一种化学成分，为节省工艺步骤，仅对几种最主要的化学成分进行测定，无法全面控制芍药甘草汤质量的问题，从而实现了通过测定17种化学成分的含量来控制芍药甘草汤质量的目的；
本发明的含量测定方法具有简单快速、稳定可靠、精密度高、易于掌握等优势，可为古代经典名方芍药甘草汤的开发和质量标准制定提供参考；
本发明通过控制高效液相色谱条件，筛选合适的工艺参数，实现了没食子酸、异甘草苷、丹皮酚、芍药内酯苷、芍药苷、芍药内酯B、苯甲酸、柚皮素、苯甲酰芍药苷、甘草中芹糖甘草苷、甘草苷、芒柄花黄素、新甘草苷、3'-去氧苏木酮A、异甘草素、甘草素和甘草酸共17种化学成分的完全分离，且与其它杂质峰有效分离，相互之间无干扰，简化了芍药甘草汤的预处理步骤；
不同溶剂或不同浓度的同种溶剂，对于中药物质中有效成分的提取效率也有所不同，本发明通过选用合适的提取溶剂，从而提高了芍药甘草汤的提取效率，进而精准测定芍药甘草汤中17种化学成分的含量。
附图说明
图1是本发明实施例1中芍药甘草汤的高效液相色谱图；
图2是本发明实施例7中230nm波长下的没食子酸标准曲线图；
图3是本发明实施例7中230nm波长下的异甘草苷标准曲线图；
图4是本发明实施例7中230nm波长下的丹皮酚标准曲线图；
图5是本发明实施例7中230nm波长下的芍药内酯苷标准曲线图；
图6是本发明实施例7中230nm波长下的芍药苷标准曲线图；
图7是本发明实施例7中230nm波长下的芹糖甘草苷标准曲线图；
图8是本发明实施例7中230nm波长下的甘草苷标准曲线图；
图9是本发明实施例7中230nm波长下的芍药内酯B标准曲线图；
图10是本发明实施例7中230nm波长下的苯甲酸标准曲线图；
图11是本发明实施例7中230nm波长下的柚皮素标准曲线图；
图12是本发明实施例7中230nm波长下的芒柄花黄素标准曲线图；
图13是本发明实施例7中230nm波长下的新甘草苷标准曲线图；
图14是本发明实施例7中230nm波长下的3'-去氧苏木酮A标准曲线图；
图15是本发明实施例7中230nm波长下的异甘草素标准曲线图；
图16是本发明实施例7中230nm波长下的甘草素标准曲线图；
图17是本发明实施例7中230nm波长下的苯甲酰芍药苷标准曲线图；
图18是本发明实施例7中230nm波长下的甘草酸标准曲线图；
图19是本发明实验例2中对比例1的高效液相色谱图；
图20是本发明实验例2中对比例2的高效液相色谱图。
具体实施方式
下面对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明，但是本发明还可以采用其他不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似推广，因此本发明不受下面公开的具体实施例的限制。
实施例1一种芍药甘草汤中17种化学成分的含量测定方法
本实施例采用芍药甘草汤冻干粉进行芍药甘草汤中17种化学成分的含量测定，具体芍药甘草汤冻干粉的制备方法如下：
根据《古代经典名方目录(第一批)》要求，按《伤寒论》中芍药甘草汤的处方记载“白芍药、甘草各四两(炙)，以上二味，以水三升，煮取一升五合，去滓，分温再服”制备，将其真空冷冻干燥后，得到芍药甘草汤冻干粉，即为芍药甘草汤物质基准。
本实施例为一种芍药甘草汤中17种化学成分的含量测定方法，包括以下具体步骤：
1)供试品溶液和对照品溶液的配制
11)供试品溶液配制
精密称取芍药甘草汤冻干粉0.1g(即m芍＝0.1g)，置10mL量瓶中，加入0.5wt％的氢氧化钠水溶液溶解并稀释至刻度，在40kHz、300W的条件下超声100min，放冷，得溶解液；
精密移取1mL溶解液，置于5mL量瓶中，用乙醇稀释并定容至刻度，摇匀，即得供试品溶液；此时，0.1g芍药甘草汤冻干相当于能够制成的供试品溶液的体积为V试＝50mL。
12)对照品储备液配制
分别取没食子酸、异甘草苷、丹皮酚、芍药内酯苷、芍药苷、芍药内酯B、苯甲酸、柚皮素、苯甲酰芍药苷、芹糖甘草苷、甘草苷、芒柄花黄素、新甘草苷、3'-去氧苏木酮A、异甘草素、甘草素和甘草酸对照品适量，精密称定，用70wt％的乙醇水溶液溶解并稀释制成浓度分别为135.274μg/mL(没食子酸的浓度)、40.125μg/mL(异甘草苷的浓度)、0.415μg/mL(丹皮酚的浓度)、86.249μg/mL(芍药内酯苷的浓度)、318.615μg/mL(芍药苷的浓度)、431.743μg/mL(芹糖甘草苷的浓度)、95.893μg/mL(甘草苷的浓度)、6.124μg/mL(芍药内酯B的浓度)、4.320μg/mL(苯甲酸的浓度)、10.410μg/mL(柚皮素的浓度)、7.920μg/mL(芒柄花黄素的浓度)、6.420μg/mL(新甘草苷的浓度)、8.367μg/mL(3’-去氧苏木酮A的浓度)、7.427μg/mL(异甘草素的浓度)、18.124μg/mL(甘草素的浓度)、173.24μg/mL(苯甲酰芍药苷的浓度)和490.079μg/mL(甘草酸的浓度)的对照品储备液。
13)对照品标准溶液配制
精密量取8mL对照品储备液置于10mL量瓶中，用甲醇定容，作为对照品标准溶液，浓度为C对-相应化学成分；其中，C对-没食子酸＝108.219μg/mL、C对-异甘草苷＝32.100μg/mL、C对-丹皮酚＝0.332μg/mL、C对-芍药内酯苷＝68.999μg/mL、C对-芍药苷＝254.892μg/mL、C对-芹糖甘草苷＝345.394μg/mL、C对-甘草苷＝76.7144μg/mL、C对-芍药内酯B＝4.8992μg/mL、C对-苯甲酸＝3.456μg/mL、C对-柚皮素＝8.328μg/mL、C对-芒柄花黄素＝6.336μg/mL、C对-新甘草苷＝5.136μg/mL、C对-3’-去氧苏木酮A＝6.694μg/mL、C对-异甘草素＝11.5416μg/mL、C对-甘草素＝14.499μg/mL、C对-苯甲酰芍药苷＝138.592μg/mL和C对-甘草酸＝392.063μg/mL。
2)高效液相色谱检测
21)取对照品标准溶液进行高效液相色谱检测，得不同化学成分对应浓度下的峰面积A对-相应化学成分；其中，A对-没食子酸＝854287、A对-异甘草苷＝3054224、A对-丹皮酚＝289195、A对-芍药内酯苷＝324583、A对-芍药苷＝3145486、A对-芹糖甘草苷＝2873881、A对-甘草苷＝1523796、A对-芍药内酯B＝236869、A对-苯甲酸＝368747、A对-柚皮素＝337154、A对-芒柄花黄素＝254268、A对-新甘草苷＝313542、A对-3’-去氧苏木酮A＝330547、A对-异甘草素＝335468、A对-甘草素＝249153、A对-苯甲酰芍药苷＝233656和A对-甘草酸＝2309104。
其中，检测对照品标准溶液的高效液相色谱条件为：
色谱柱：YMC-Triart C18(5μm，4.6×250mm)；
流动相：乙腈(A)-0.1wt％甲酸水溶液(B)；
洗脱方式为梯度洗脱；
洗脱程序：0～5min，5％→13％流动相A，95％→87％流动相B；
5～15min，13％→23％流动相A，87％→77％流动相B；
15～40min，23％→50％流动相A，77％→50％流动相B；
40～55min，50％→100％流动相A，50％→0％流动相B；
55～55.01min，100％→5％流动相A，0％→95％流动相B；
55.01～65min，5％流动相A，95％流动相B。
流速：0.60mL/min；
柱温：35℃；
检测波长：230nm；
进样量：5μL。
22)取供试品溶液在上述色谱条件下进行高效液相色谱检测，所得色谱图见图1，其中，1号峰为没食子酸、2号峰为异甘草苷、3号峰为丹皮酚、4号峰为芍药内酯苷、5号峰为芍药苷、6号峰为芹糖甘草苷、7号峰为甘草苷、8号峰为芍药内酯B、9号峰为苯甲酸、10号峰为柚皮素、11号峰为芒柄花黄素、12号峰为新甘草苷、13号峰为3’-去氧苏木酮A、14号峰为异甘草素、15号峰为甘草素、16号峰为苯甲酰芍药苷、17号峰为甘草酸；
从所得色谱峰中可获知供试品溶液中所含相应化学成分的峰面积为A试-相应化学成分；其中，A试-没食子酸＝25492、A试-异甘草苷＝164862、A试-丹皮酚＝7275、A试-芍药内酯苷＝6706、A试-芍药苷＝1041375、A试-芹糖甘草苷＝389142、A试-甘草苷＝790190、A试-芍药内酯B＝7062、A试-苯甲酸＝8919、A试-柚皮素＝6748、A试-芒柄花黄素＝5399、A试-新甘草苷＝6743、A试-3’-去氧苏木酮A＝8873、A试-异甘草素＝8569、A试-甘草素＝6681、A试-苯甲酰芍药苷＝11244和A试-甘草酸＝362258。
根据C试-相应化学成分＝(A试-相应化学成分×C对-相应化学成分)/A对-相应化学成分，计算供试品溶液中的各化学成分的浓度C试-相应化学成分；
再根据芍药甘草汤冻干粉与供试品溶液的重量体积比，利用芍药甘草汤中各化学成分含量＝(C对-相应化学成分×V试)/m芍，计算得芍药甘草汤中各化学成分含量；
或者，利用芍药甘草汤中各化学成分的含量＝A试-相应化学成分×C对-相应化学成分×V试/(m芍×A对-相应化学成分)，计算得芍药甘草汤中各化学成分含量；
以甘草酸为例：
计算方法一，首先，计算供试品溶液中甘草酸的浓度C试-甘草酸＝(A试-甘草酸×C对-甘草酸)/A对-甘草酸＝(×392.063μg/mL)/2309102；
然后，计算芍药甘草汤中甘草酸的含量＝(C对-甘草酸×V试)/m芍＝(×100mL)/0.1g。
其它化学成分以此类推。
计算方法二，芍药甘草汤中甘草酸的含量＝A试-甘草酸×C对-甘草酸×V试/(m芍×A对-甘草酸)＝×392.063μg/mL×100mL/(0.1g×362258)＝30.75mg/g。
芍药甘草汤中甘草苷的含量A试-甘草苷×C对-甘草苷×VI-甘草苷/(m芍×A对-甘草苷)。
其它化学成分以此类推。
本实施例中，芍药甘草汤中含有没食子酸1.615mg/g、异甘草苷0.8664mg/g、丹皮酚0.0042mg/g、芍药内酯苷0.7128mg/g、芍药苷42.19mg/g、芍药内酯B 0.0730mg/g、苯甲酸0.0418mg/g、柚皮素0.0833mg/g、苯甲酰芍药苷3.33mg/g、芹糖甘草苷23.38mg/g、甘草苷19.89mg/g、芒柄花黄素0.0673mg/g、新甘草苷0.0552mg/g、3'-去氧苏木酮A 0.0898mg/g、异甘草素0.1474mg/g、甘草素0.1944mg/g和甘草酸30.75mg/g。
实施例2一种芍药甘草汤中17种化学成分的含量测定方法
b1)供试品溶液和对照品溶液的配制
b11)供试品溶液配制
按照实施例1中步骤11)的方法配制供试品溶液，其中步骤和用量与实施例1相同。
b12)对照品储备液配制
按照实施例1中步骤12)的方法配制对照品储备液，其中步骤和用量与实施例1相同。
b13)不同浓度的对照品标准系列溶液配制
分别精密量取1、2、4、5、8、10mL对照品储备液分别置于50、20、20、20、10、10mL量瓶中，用70wt％乙醇水溶液定容，作为不同浓度的对照品标准系列溶液，其中，不同化学成分的浓度见表1。
b2)高效液相色谱检测
b21)取不同浓度的对照品标准系列溶液在上述色谱条件下进行高效液相色谱检测，得相应化学成分对应浓度测定的峰面积，具体峰面积见表1，再根据不同化学成分的浓度和相应化学成分对应浓度测定的峰面积，绘制不同化学成分对应的标准曲线，并以不同化学成分的浓度作为横坐标(即x，单位为μg/mL)，以相应化学成分对应浓度测定的峰面积作为纵坐标(即y)。具体不同浓度的对照品标准系列溶液中各化学成分的浓度及峰面积见下表：
表1不同浓度的对照品标准系列溶液实验结果一览表
利用不同浓度的对照品标准系列溶液绘制的标准曲线如下：
没食子酸对应的标准曲线为y＝7893.9x+10.438，R2＝1.000，标准曲线见图2；
异甘草苷对应的标准曲线为y＝95117x+8090.5，R2＝0.9999，标准曲线见图3；
丹皮酚对应的标准曲线为y＝874711x-597.18，R2＝1.000，标准曲线见图4；
芍药内酯苷对应的标准曲线为y＝4789x-1561.8，R2＝0.9995，标准曲线见图5；
芍药苷对应的标准曲线为y＝12301x+21868，R2＝0.9996，标准曲线见图6；
芹糖甘草苷对应的标准曲线为y＝8142.2x-3638.1，R2＝0.9993，标准曲线见图7；
甘草苷对应的标准曲线为y＝19786x+11017，R2＝0.9996，标准曲线见图8；
芍药内酯B对应的标准曲线为y＝47442x+629.14，R2＝0.9996，标准曲线见图9；
苯甲酸对应的标准曲线为y＝106956x-899.14，R2＝1.000，标准曲线见图10；
柚皮素对应的标准曲线为y＝40543x-1700.9，R2＝0.9996，标准曲线见图11；
芒柄花黄素对应的标准曲线为y＝40417x-1051.9，R2＝0.9994，标准曲线见图12；
新甘草苷对应的标准曲线为y＝61161x-1294，R2＝0.9998，标准曲线见图13；
3’-去氧苏木酮A对应的标准曲线为y＝49390x+298.4，R2＝0.9999，标准曲线见图14；
异甘草素对应的标准曲线为y＝28818x-272.07，R2＝0.9998，标准曲线见图15；
甘草素对应的标准曲线为y＝16997x+371.77，R2＝0.9998，标准曲线见图16；
苯甲酰芍药苷对应的标准曲线为y＝1684.4x-587.75，R2＝0.9999，标准曲线见图17；
甘草酸对应的标准曲线为y＝5868.1x+14514，R2＝0.9995，标准曲线见图18。
b23)取供试品溶液在上述色谱条件下进行高效液相色谱检测，分别得供试品溶液中所含不同化学成分对应的峰面积，将相应化学成分的峰面积代入相应的标准曲线，即得供试品溶液中相应化学成分的浓度(C试-相应化学成分)。
再将供试品溶液中相应化学成分的浓度(C试-相应化学成分)乘以制备的供试品溶液总体积(V试＝50mL)除以制备供试品溶液所用芍药甘草汤冻干粉的用量(m芍＝0.1g)，即得芍药甘草汤中相应化学成分的含量，也就是说芍药甘草汤中相应化学成分的含量＝(C对-相应化学成分×V试)/m芍。
以甘草酸为例，即将甘草酸在上述色谱条件下测定的峰面积(A对-甘草酸＝362258)代入甘草酸对应的标准曲线，计算得供试品溶液I中甘草酸的浓度(C试-甘草酸＝59.26μg/mL)；
芍药甘草汤中甘草酸的含量＝(C对-甘草酸×VI-甘草酸)/m芍＝59.26μg/mL×50mL/0.1g＝29630μg/g＝29.63mg/g。
本实施例中，芍药甘草汤中含有没食子酸1.614mg/g、异甘草苷0.8241mg/g、丹皮酚0.0045mg/g、芍药内酯苷0.8632mg/g、芍药苷41.44mg/g、芍药内酯B 0.0678mg/g、苯甲酸0.0459mg/g、柚皮素0.1042mg/g、苯甲酰芍药苷3.512mg/g、芹糖甘草苷24.12mg/g、甘草苷19.69mg/g、芒柄花黄素0.0798mg/g、新甘草苷0.0657mg/g、3'-去氧苏木酮A 0.0869mg/g、异甘草素0.1534mg/g、甘草素0.1856mg/g和甘草酸29.63mg/g。
需要说明的是，由于标准曲线存在标准偏差，采用外标法计算的含量会与采用标准曲线计算的含量有所差距，这属于本领域公知常识。
另外，在实际应用过程中，在已知标准曲线的情况下，可以直接配制供试品溶液进行高效液相色谱检测后，直接代入标准曲线进行计算。无需重复配制不同浓度的对照品标准系列溶液进行测定并绘制标准曲线这个过程。
实验例1方法学考察
本实验例芍药甘草汤中17种化学成分的含量测定方法进行考察，主要考察该含量测定方法的系统适用性、准确度、精密度、稳定性。
一、系统适用性
按照实施例1中步骤13)中制备的对照品标准溶液，连续检测6次，计算各化学成分峰面积的RSD值。
表2系统适用性结果一览表
由表2可以看出，本发明的含量测定方法，各化学成分的峰面积RSD值均小于2％，系统适用性良好。
二、准确度
取已知含量的芍药甘草汤冻干粉0.1g(本实验采用实施例2同一批的芍药甘草汤，以实施例2中测定的芍药甘草汤中各化学成分的含量作为各化学成分的已知含量)，精密称定，分别按各化学成分已知含量的50％、100％、150％加入各化学成分对照品，按实施例2中供试品溶液的配制方法，制备低、中、高三种浓度的准确度供试品溶液，每一种浓度平行制备3份。分别按照上述色谱条件进行相应的高效液相色谱检测，并计算各成分的平均回收率及其RSD值，具体结果如下：
表3准确度实验结果一览表
由表3可以看出，各化学成分的回收率均在98.26％～101.45％内，方法准确度良好。
三、精密度
取同一批芍药甘草汤冻干粉，分别精密称取0.05g、0.1g、0.15g，按照实施例2中供试品溶液的配制方法，制备低、中、高三种浓度的精密度供试品溶液(除芍药甘草汤冻干粉用量不同外，其它溶剂用量及方法均与实施例1相同)，每一种浓度平行制备3份；在同一日内分别按照上述色谱条件进行相应的高效液相色谱检测，测定各化学成分的含量，并计算各化学成分含量的RSD值，作为重复性实验(即日内精密度实验)。
分别取同一批芍药甘草汤冻干粉0.1g，按照重复性实验中的方法制备相同浓度的日间精密度供试品溶液各3份，分别按照上述色谱条件进行相应的高效液相色谱检测，每天平行制备3份，连续三天进样检测，计算各待测成分含量的RSD值，为日间精密度实验。
具体结果如下：
表4精密度实验结果一览表
由表4可以看出，17种化学成分在同一日内的RSD值分别为0.56％～1.64％，结果表明方法重复性良好。甲基麦冬二氢高异黄烷酮A、甲基麦冬二氢高异黄烷酮B、甘草苷、芹糖甘草苷、芦丁、异槲皮苷、甘草素和甘草酸日间精密度的RSD值分别为0.69％～1.73％，结果表明方法日间精密度良好。
四、稳定性
按照实施例2的方法制备供试品溶液，于室温下分别放置0、1、2、4、8、12、24h后，进行高效液相色谱检测，并计算各化学成分的RSD，具体如下：
表5稳定性实验结果一览表
由表5可以看出，17种化学成分在24h内分别为1.27％～3.84％，结果表明本发明制备的供试品溶液稳定性良好。
实验例2各工艺参数考察
对比例1～2为实施例1中芍药甘草汤中17种化学成分的含量测定的对比试验，区别仅在于：
对比例1中仅将流动相B更换为0.1wt％磷酸水溶液，所得色谱图见图19，其中芹糖甘草苷和甘草苷无法很好分离，且22～40min基线不稳，因此无法一次性进行含量测定。
对比例2中仅将洗脱程序更换为：
0～10min，10％→20％流动相A，90％→80％流动相B；
10～18min，20％流动相A，80％流动相B；
18～19min，20％→23％流动相A，80％→77％流动相B；
19～35min，23％→38％流动相A，77％→62％流动相B；
35～40min，38％→41％流动相A，62％→59％流动相B；
40～45min，41％→45％流动相A，59％→55％流动相B；
45～48min，45％→100％流动相A，55％→0％流动相B；
48～50min，100％→10％流动相A，0％→90％流动相B；
50～64min，10％流动相A，90％流动相B；
对比例2所得色谱图见图20，其中，甘草苷和芍药内酯B无法很好分离，甘草素和苯甲酰芍药苷无法很好分离，尾线不稳，拖尾明显，因此无法一次性进行含量测定。
显然，所描述的实施例仅仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

Claims (5)

1.一种芍药甘草汤中17种化学成分的含量测定方法，其特征在于，所述含量测定方法包括以下步骤：
取没食子酸、异甘草苷、丹皮酚、芍药内酯苷、芍药苷、芍药内酯B、苯甲酸、柚皮素、苯甲酰芍药苷、芹糖甘草苷、甘草苷、芒柄花黄素、新甘草苷、3'-去氧苏木酮A、异甘草素、甘草素和甘草酸共17种化学成分制备对照品标准溶液；
取芍药甘草汤制备供试品溶液；
所述供试品溶液是取芍药甘草汤加入0.5wt％的氢氧化钠水溶液，超声溶解，再加入乙醇稀释，制得；
分别取对照品标准溶液和供试品溶液进行高效液相色谱检测，再利用外标法，分别计算得芍药甘草汤中没食子酸、异甘草苷、丹皮酚、芍药内酯苷、芍药苷、芍药内酯B、苯甲酸、柚皮素、苯甲酰芍药苷、甘草中芹糖甘草苷、甘草苷、芒柄花黄素、新甘草苷、3'-去氧苏木酮A、异甘草素、甘草素和甘草酸的含量；
其中，所述高效液相色谱检测的色谱条件为：
色谱柱：YMC-Triart C18色谱柱；流速0.6mL/min；柱温35℃；检测波长230nm；高效液相色谱检测过程中，以乙腈为流动相A，以0.1wt％的甲酸水溶液为流动相B；
所述高效液相色谱检测的洗脱方式为梯度洗脱，洗脱条件为：
0～5min，5％→13％流动相A，95％→87％流动相B；
5～15min，13％→23％流动相A，87％→77％流动相B；
15～40min，23％→50％流动相A，77％→50％流动相B；
40～55min，50％→100％流动相A，50％→0％流动相B；
55～55.01min，100％→5％流动相A，0％→95％流动相B；
55.01～65min，5％流动相A，95％流动相B。
2.根据权利要求1所述的芍药甘草汤中17种化学成分的含量测定方法，其特征在于，所述供试品溶液包括以下步骤：
取0.1重量份芍药甘草汤，加入0.5wt％的氢氧化钠水溶液至10体积份，超声溶解，得溶解液；
取1体积份溶解液，再加入乙醇稀释至10体积份，摇匀，即得所述供试品溶液。
3.一种芍药甘草汤中17种化学成分的含量测定方法，其特征在于，所述含量测定方法包括以下步骤：
取没食子酸、异甘草苷、丹皮酚、芍药内酯苷、芍药苷、芍药内酯B、苯甲酸、柚皮素、苯甲酰芍药苷、芹糖甘草苷、甘草苷、芒柄花黄素、新甘草苷、3'-去氧苏木酮A、异甘草素、甘草素和甘草酸共17种化学成分制备制备不同浓度的对照品标准系列溶液；
分别取制备不同浓度的对照品标准系列溶液进行高效液相色谱检测，并根据不同化学成分的浓度和相应化学成分对应浓度测定的峰面积，绘制不同化学成分对应的标准曲线；
取芍药甘草汤制备供试品溶液；
所述供试品溶液是取芍药甘草汤加入0.5wt％的氢氧化钠水溶液，超声溶解，再加入乙醇稀释，制得；
分别对供试品溶液进行高效液相色谱检测，所得相应化学成分的峰面积代入相应的标准曲线，经计算，即得所述芍药甘草汤中相应化学成分的含量；
其中，所述高效液相色谱检测的色谱条件为：
色谱柱：YMC-Triart C18色谱柱；流速0.6mL/min；柱温35℃；检测波长230nm；高效液相色谱检测过程中，以乙腈为流动相A，以0.1wt％的甲酸水溶液为流动相B；
所述高效液相色谱检测的洗脱方式为梯度洗脱，洗脱条件为：
0～5min，5％→13％流动相A，95％→87％流动相B；
5～15min，13％→23％流动相A，87％→77％流动相B；
15～40min，23％→50％流动相A，77％→50％流动相B；
40～55min，50％→100％流动相A，50％→0％流动相B；
55～55.01min，100％→5％流动相A，0％→95％流动相B；
55.01～65min，5％流动相A，95％流动相B。
4.根据权利要求3所述的芍药甘草汤中17种化学成分的含量测定方法，其特征在于，所述不同浓度的对照品标准系列溶液中没食子酸的浓度在2.705～135.274μg/mL之间、异甘草苷的浓度在0.8025～40.125μg/mL之间、丹皮酚的浓度在0.0083～0.415μg/mL之间、芍药内酯苷的浓度在1.725～86.249μg/mL之间、芍药苷的浓度在6.372～318.615μg/mL之间、芹糖甘草苷的浓度在8.635～431.743μg/mL之间、甘草苷的浓度在1.918～95.893μg/mL之间、芍药内酯B的浓度在0.122～6.124μg/mL之间、苯甲酸的浓度在0.0864～6.124μg/mL之间、柚皮素的浓度在0.208～10.41μg/mL之间、芒柄花黄素的浓度在0.158～7.92μg/mL之间、新甘草苷的浓度在0.128～6.42μg/mL之间、3’-去氧苏木酮A的浓度在0.167～8.367μg/mL之间、异甘草素的浓度在0.289～14.427μg/mL之间、甘草素的浓度在0.362～18.124μg/mL之间、苯甲酰芍药苷的浓度在3.465～173.24μg/mL之间和甘草酸的浓度在9.802～490.079μg/mL之间。
5.根据权利要求3所述的芍药甘草汤中17种化学成分的含量测定方法，其特征在于，所述不同化学成分对应的标准曲线如下：
没食子酸对应的标准曲线为y＝7893.9x+10.438，R2＝1.000；
异甘草苷对应的标准曲线y＝95117x+8090.5，R2＝0.9999；
丹皮酚对应的标准曲线为y＝874711x-597.18，R2＝1.000；
芍药内酯苷对应的标准曲线为y＝4789x-1561.8，R2＝0.9995；
芍药苷对应的标准曲线为y＝12301x+21868，R2＝0.9996；
芹糖甘草苷对应的标准曲线为y＝8142.2x-3638.1，R2＝0.9993；
甘草苷对应的标准曲线为y＝19786x+11017，R2＝0.9996；
芍药内酯B对应的标准曲线为y＝47442x+629.14，R2＝0.9996；
苯甲酸对应的标准曲线为y＝106956x-899.14，R2＝1.000；
柚皮素对应的标准曲线为y＝40543x-1700.9，R2＝0.9996；
芒柄花黄素对应的标准曲线为y＝40417x-1051.9，R2＝0.9994；
新甘草苷对应的标准曲线为y＝61161x-1294，R2＝0.9998；
3’-去氧苏木酮A对应的标准曲线为y＝49390x+298.4，R2＝0.9999；
异甘草素对应的标准曲线为y＝28818x-272.07，R2＝0.9998；
甘草素对应的标准曲线为y＝16997x+371.77，R2＝0.9998；
苯甲酰芍药苷对应的标准曲线为y＝1684.4x-587.75，R2＝0.9999；
甘草酸对应的标准曲线为y＝5868.1x+14514，R2＝0.9995。
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