CN111077244A - 一种同时测定穿山甲中4种水溶性成分的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种同时测定穿山甲中4种水溶性成分的方法，该方法包括以下步骤：（1）供试品溶液的制备；（2）对照品溶液的制备；（3）将上述供试品溶液和对照品溶液分别注入高效液相色谱仪中进行检测。该方法可同时测定穿山甲中的黄嘌呤、L‑丝‑L‑酪环二肽、D‑丝‑L‑酪环二肽、L‑甘‑L‑酪环二肽四种水溶性成分，从而对穿山甲的品质进行监测，为穿山甲的药效学研究奠定基础。同时，该方法所优化的色谱检测条件能够对这四种水溶性成分进行很好的分离，从而提高检测的灵敏度和稳定性。因此，本发明所述方法对穿山甲中四种水溶性成分的检测起到重要的作用。

Description

一种同时测定穿山甲中4种水溶性成分的方法
技术领域
本发明属于穿山甲水溶性成分的分析技术领域，具体涉及一种同时测定穿山甲中黄嘌呤、L-丝-L-酪环二肽、D-丝-L-酪环二肽、L-甘-L-酪环二肽含量的方法。
背景技术
穿山甲来源于鲮鲤科动物中华穿山甲Manis pentadactyla的鳞甲，味咸，性微寒，入肝、胃经，具有通经下乳，活血消癥，消肿排脓，搜风通络的功效[1]。
穿山甲经砂炒炮制后，脂溶性成分无显著变化、多肽显著减少，环二肽等水溶性成分显著增加。环二肽又称之为二酮哌嗪类成分，具有广泛的生物活性，如：抗氧化、保护神经元及改善脑功能、抗凝、镇痛、免疫调节及神经递质类活性等药理活性。从穿山甲中分离得到的L-丝-L-酪环二肽具有镇痛活性，能增加乳蛋白合成相关基因表达和奶牛乳腺上皮细胞增殖率，提高小白鼠常压缺氧的耐受能力，还具有活血化瘀等活性。核苷类物质是动物类中药广泛存在的共有成分，是参与代谢的重要活性物质。
发明内容
本发明的目的在于提供一种同时测定穿山甲中黄嘌呤、L-丝-L-酪环二肽、D-丝-L-酪环二肽、L-甘-L-酪环二肽含量的方法。
为了实现上述目的，本发明提供以下技术方案：
一种同时测定穿山甲中4种水溶性成分的方法，包括以下步骤：
（1）供试品溶液的制备：将穿山甲生品和各炮样品细粉1g，加5-10倍量水，精密称定，回流提取1-2h，放冷至室温，用水补足减失的质量，摇匀，滤过，再将滤液用0.45μm微孔滤膜滤过，即制得供试品溶液；
（2）对照品溶液的制备：分别精密称取L-丝-L-酪环二肽、D-丝-L-酪环二肽、L-甘-L-酪环二肽、黄嘌呤对照品，用0.1%氨水溶解定容，制得对照品溶液；
（3）将上述供试品溶液和对照品溶液分别注入高效液相色谱仪中进行检测；
其中所述的水溶性成分为黄嘌呤、L-丝-L-酪环二肽、D-丝-L-酪环二肽和L-甘-L-酪环二肽。
进一步的，所述穿山甲生品和各炮样品细粉的粒度为80-100目。
进一步的，高效液相色谱检测所用的色谱柱为C18色谱柱，检测波长为200-400nm，流速为0-25mL/min。
进一步的，所述步骤（3）中进行高效液相色谱检测使用的流动相A为甲醇溶液，流动相B为水溶液，流动相A和/或流动相B中添加有三氟乙酸，每种流动相中三氟乙酸的添加浓度为0.01-10%。
进一步的，所述流动相A的洗脱范围为0-20%。
有益效果：本发明提供了一种同时测定穿山甲中4种水溶性成分的方法，该方法可同时测定穿山甲中的黄嘌呤、L-丝-L-酪环二肽、D-丝-L-酪环二肽、L-甘-L-酪环二肽四种水溶性成分，从而对穿山甲的品质进行监测，为穿山甲的药效学研究奠定基础。同时，该方法所优化的色谱检测条件能够对这四种水溶性成分进行很好的分离，从而提高检测的灵敏度和稳定性。因此，本发明所述方法对穿山甲中四种水溶性成分的检测起到重要的作用。
附图说明
图1 为穿山甲（A）和混合对照品（B）的HPLC色谱图，图中：1、黄嘌呤；2、L-丝-L-酪环二肽；3、D-丝-L-酪环二肽；4、L-甘-L-酪环二肽。
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，但实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
1、色谱条件
Sepax Bio-C18色谱柱（250 mm×4.6mm，5μm），柱温 30 ℃，流动相0.1%TFA甲醇（A）-0.1%TFA水（B），A:B(2%-98%)洗脱，流速 0.5 mL/min，检测波长210 nm，进样量10μL。
2、样品制备
2.1 混合对照品溶液
分别精密称取L-丝-L-酪环二肽、D-丝-L-酪环二肽、L-甘-L-酪环二肽、黄嘌呤对照品适量，用0.1%氨水溶解，配制得质量浓度分别为53.45μg/mL、52.50μg/mL 、13.08μg/mL、4.336μg/mL的混合溶液。
2.2 供试品溶液
取生品和各炮样品细粉（80目）1g，加10倍量水，精密称定，回流提取1h，放冷至室温，用水补足减失的质量，摇匀，滤过，取续滤液用0.45μm微孔滤膜滤过，即得。
3、方法学考察
3.1 线性关系考察及检测下限和定量下限的测定
分别精密吸取混合对照品溶液1、2、5、10、15、20μL，按色谱条件，测定峰面积，以峰面积Y对进样量X（μg）进行线性回归计算。
表1 4个成分的回归方程、线性范围、相关系数
Figure 995587DEST_PATH_IMAGE001
3.2 精密度试验
精密吸取混合对照品溶液，按色谱条件，连续进样6次，测得L-丝-L-酪环二肽、D-丝-L-酪环二肽、L-甘-L-酪环二肽、黄嘌呤峰面积RSD分别为：1.89%、1.57%、1.77%、1.65%。表明仪器精密度良好。
3.3 稳定性实验
取同一砂炒炮山甲粉末，按“2.2”项下制备供试品溶液，分别在 0、2、4、8、12、24 h时，测定L-丝-L-酪环二肽、D-丝-L-酪环二肽、L-甘-L-酪环二肽、黄嘌呤峰面积，RSD分别为：1.01%、0.86%、1.13%、1.82%，表明供试品溶液在 24 h内稳定。
3.4 重复性试验
分别取同一批砂炒炮山甲粉末6份，按“2.2”项下方法制备供试品溶液，测得L-丝-L-酪环二肽、D-丝-L-酪环二肽、L-甘-L-酪环二肽、黄嘌呤峰面积RSD 分别为2.41%、1.26%、1.80%、1.91%，表明方法重复性良好。
3.5 加样回收试验
精密称取已知含量的砂炒炮山甲粉末（80目）6份，每0.5g，精密加入与样品中待测成分含有量等量的对照品，按“2.2”项下方法制备供试溶液，测定，计算回收率。L-丝-L-酪环二肽、D-丝-L-酪环二肽、L-甘-L-酪环二肽、黄嘌呤平均加样回收率分别为 99.88%、99.67%、99.81%、90.78%，RSD 分别为2.88%、2.89%、2.79%、2.71%。
3.6 样品含量测定
分别取不同炮制方法的穿山甲样品粉末，分别按“2.2”项下方法制备供试品溶液，测定，外标法计算L-丝-L-酪环二肽、D-丝-L-酪环二肽、L-甘-L-酪环二肽、黄嘌呤含量。结果见表2。
表 2 穿山甲含量测定结果
Figure DEST_PATH_IMAGE003
。

Claims (5)

1.一种同时测定穿山甲中4种水溶性成分的方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）供试品溶液的制备：将穿山甲生品和各炮样品细粉1g，加5-10倍量水，精密称定，回流提取1-2h，放冷至室温，用水补足减失的质量，摇匀，滤过，再将滤液用0.45μm微孔滤膜滤过，即制得供试品溶液；
（2）对照品溶液的制备：分别精密称取L-丝-L-酪环二肽、D-丝-L-酪环二肽、L-甘-L-酪环二肽、黄嘌呤对照品，用0.1%氨水溶解定容，制得对照品溶液；
（3）将上述供试品溶液和对照品溶液分别注入高效液相色谱仪中进行检测；
其中所述的水溶性成分为黄嘌呤、L-丝-L-酪环二肽、D-丝-L-酪环二肽和L-甘-L-酪环二肽。
2.根据权利要求1所述的一种同时测定穿山甲中4种水溶性成分的方法，其特征在于，所述穿山甲生品和各炮样品细粉的粒度为80-100目。
3.根据权利要求1所述的一种同时测定穿山甲中4种水溶性成分的方法，其特征在于，高效液相色谱检测所用的色谱柱为C18色谱柱，检测波长为200-400nm，流速为0-25mL/min。
4.根据权利要求1所述的一种同时测定穿山甲中4种水溶性成分的方法，其特征在于，所述步骤（3）中进行高效液相色谱检测使用的流动相A为甲醇溶液，流动相B为水溶液，流动相A和/或流动相B中添加有三氟乙酸，每种流动相中三氟乙酸的添加浓度为0.01-10%。
5.根据权利要求1所述的一种同时测定穿山甲中4种水溶性成分的方法，其特征在于，所述流动相A的洗脱范围为0-20%。
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