CN108195949B - 一种鉴别冬虫夏草和冬虫夏草伪品的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于中药材鉴别领域，公开了一种鉴别冬虫夏草和冬虫夏草伪品的方法。具体提供了一种鉴别冬虫夏草和冬虫夏草伪品的方法，包括如下步骤：(a)样品的预处理；(b)固相微萃取；(c)GC‑MS测定；(d)挥发性成分的鉴定；(e)主成分分析。该方法灵敏度高，样品用量少(mg级)，操作简便，信息丰富，实验结果可靠。适于推广。

Description

一种鉴别冬虫夏草和冬虫夏草伪品的方法
技术领域
本发明属于中药材鉴别领域，公开了一种鉴别冬虫夏草和冬虫夏草伪品的方法。
背景技术
冬虫夏草是在高原草甸和高海拔阴山峡谷自然生长环境中生长的，麦角菌科真菌Cordyceps sinensis(BerK.)Sacc.寄生在蝙蝠蛾科昆虫幼虫上的子座和幼虫尸体的复合体。具有补肺益肾、秘精益气等功效，用于久咳虚喘，唠咳咯血，阳痿遗精，腰膝酸软，是我国传统的名贵中药材。现代药理学研究也表明，冬虫夏草对人体的免疫系统、循环系统、心血管系统、呼吸系统等均有裨益。冬虫夏草主要生长于我国青海、四川、西藏、贵州、云南等省3500～-5000m海拔的高寒高原地区，由于自然寄生率低，加之生长环境的限制、生态环境的日益恶化以及掠夺式的采挖，使野生冬虫夏草的产量日益下降，价格持续走高。为了牟取暴利，市场上常常存在以冬虫夏草伪品冒充冬虫夏草进行销售的现象。最为常见的冬虫夏草伪品是其它虫草属真菌或寄生在其它昆虫体上所形成的复合体，如虫草属的亚香棒虫草、古尼虫草、新疆虫草、凉山虫草、戴氏虫草、西藏百草、麻脊背虫草、祁连默勒虫草等，这些伪品在外观上常人难以与冬虫夏草区分开来，在药效上远不及冬虫夏草，给消费者带来巨大的经济损失。
近两年，冬虫夏草的人工培植及产业化研究取得了突破性的进展。采取麦角菌科真菌冬虫夏草菌Cordyceps sinensis(BerK.)Sacc.感染人工培养的蝙蝠蛾幼虫，模拟冬虫夏草的自然生长环境和成长过程得到子座和幼虫尸体的复合体。人工培植的冬虫夏草与野生冬虫夏草的性状基本一致，而重金属含量更低，且不会对高原草甸环境造成破坏，因此冬虫夏草的人工培植及产业化对供不应求的市场意义重大。但这也难以遏制冬虫夏草伪品在市场上出现。
冬虫夏草与虫草属的冬虫夏草伪品在外观上极为相似，仅通过传统肉眼或显微特征难以鉴别，需利用化学成分的差异通过精密的仪器手段和化学计量学策略实现区分。液相色谱和气相色谱指纹图谱常用于中药材的鉴别，但这类方法样品用量大，特别是基于挥发性成分的鉴别方法，通常需要10g以上的样本才能够提取到足够量的挥发油成分用于分析，这种方法对于价格昂贵的药材是不合适的。利用光谱方法结合化学计量学技术也是一类较为常见的中药材鉴别方法，例如红外光谱法、高光谱法、紫外光谱法等，虽然这类方法可以做到无损检测，但其最重要的步骤是利用大量真样本建立训练集和数学模型，方法难以推广。近年来，利用DNA条形码或免疫分析实现中药材的鉴定也常见报道，但这些方法操作繁琐，试剂昂贵。
发明内容
本发明采用固相微萃取-气相色谱-质谱联用(SPME-GC-MS)技术，对冬虫夏草和冬虫夏草伪品进行鉴别。采用固相微萃取针萃取富集冬虫夏草中的挥发性成分，通过质谱谱库匹配鉴定化学成分的结构，结合主成分分析对冬虫夏草和冬虫夏草伪品进行鉴别。该方法灵敏度高，样品用量少(mg级)，操作简便，信息丰富，实验结果可靠。适于推广。
本发明所涉及利用SPME-GC-MS技术对冬虫夏草的挥发性成分进行研究尚未见报道，亦未见利用该技术进行冬虫夏草和冬虫夏草伪品鉴别的相关报道。
本发明的目的是提供一种鉴别冬虫夏草和冬虫夏草伪品的方法。
本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：
一方面，本发明提供了一种鉴别冬虫夏草和冬虫夏草伪品的方法，包括如下步骤：
(a)样品的预处理：取冬虫夏草和冬虫夏草伪品，分别低温粉碎至合适颗粒度得到样品粉末；
(b)固相微萃取：精密称取样品粉末5～100mg，置于低流失样品瓶内，在40～100℃下预平衡20～100min；将固相微萃取的萃取针置于样品瓶上方空间，在40～100℃下静置萃取20～100min；
(c)GC-MS测定：取出萃取针，立即插入GC-MS仪器的进样口加热解吸，解吸时间0.5～5min；启动气相色谱程序升温，开始GC-MS测定；GC-MS测定条件：色谱柱：HP-5MS毛细管柱(30m×0.25mm×0.25μm)；程序升温条件：初始温度40℃，停留5min，以2℃/min的速度升至200℃，停留10min；进样方式：不分流进样；载气流速1mL/min；进样口温度：250℃；离子源温度：230℃；接口温度250℃；四极杆温度：150℃；离子源电压：70ev；质谱扫描范围：(m/z)30～500amu；
(d)挥发性成分的鉴定：以质谱谱库检索，对冬虫夏草和冬虫夏草伪品的挥发性成分进行鉴定；计算各峰的相对含量；
(e)主成分分析：通过化学计量学软件对数据进行主成分分析，直观区分冬虫夏草和冬虫夏草伪品。
一些实施例中，所述的冬虫夏草伪品是在市场上常用来冒充冬虫夏草销售的冬虫夏草近缘种。
一些实施例中，所述的冬虫夏草伪品是亚香棒虫草、古尼虫草、新疆虫草、凉山虫草、戴氏虫草、西藏百草、麻脊背虫草、祁连默勒虫草。
一些实施例中，在所述的步骤(a)中，低温粉碎温度为-20℃～10℃，粉碎颗粒度为150目～10目。
一些实施例中，在所述的步骤(a)中，低温粉碎温度为4℃，粉碎颗粒度为10目。
一些实施例中，在所述的步骤(b)中，所述固相微萃取的操作模式为顶空模式。
一些实施例中，在所述的步骤(b)中，所述固相微萃取针采用的涂层为二乙烯苯基/碳分子筛/聚二甲基硅氧烷(DVB/CAR/PDMS)、聚二甲基硅氧烷(PDMS)、聚二甲基硅氧烷/二乙烯苯基(PDMS/DVB)、二乙烯苯基/碳分子筛(DVB/CAR)、碳分子筛/聚二甲基硅氧烷(CAR/PDMS)、聚丙烯酸酯(PA)中的任意一种。
一些实施例中，在所述的步骤(b)中，样品粉末的取样量为30～50mg，样品的预平衡温度为80～90℃，预平衡时间为40～60min；萃取温度为80～90℃，萃取时间为80min。
一些实施例中，在所述的步骤(c)中，所述固相微萃取的萃取针的热解吸时间2～3min。
一些实施例中，在所述的步骤(d)中，所述质谱谱库采用NIST谱库；所述的相对含量采用面积归一化方法进行计算。
一些实施例中，在所述的步骤(e)中，化学计量学软件为SIMCAP软件。
与现有技术相比，本发明的积极效果是：
(1)本发明首次采用SPME-GC-MS技术对冬虫夏草和冬虫夏草伪品进行鉴定。确定了SPME的萃取条件和GC-MS分析条件的最优参数，灵敏度高、分离效果好，提高了结果的准确性和可靠性。通过分析冬虫夏草的挥发性成分组成和含量，为冬虫夏草药材的质量控制提供新方法。
(2)本发明将冬虫夏草的SPME-GC-MS总离子流色谱图和主成分分析相结合，可以定量、直观地区别冬虫夏草和冬虫夏草伪品，为鉴别提供了简便、有效的方法。
附图说明
图1中(A)为实施例1中冬虫夏草的外观，(B)为实施例1中冬虫夏草伪品的外观；
图2为实施例1中冬虫夏草的SPME-GC-MS总离子流图；
图3为实施例1中冬虫夏草伪品的SPME-GC-MS总离子流图；
图4实施例2中冬虫夏草和冬虫夏草伪品的主成分分析鉴别结果图；1-17：冬虫夏草；18-23：冬虫夏草伪品。
具体实施方式
以下提供本发明的具体实施方式，结合附图和实施例对本发明做进一步说明。
实施例1
本实施例以冬虫夏草的检测为例说明其SPME-GC-MS的提取、分析和鉴定过程，但本发明的保护范围不局限于该实验，具体步骤如下：
1、仪器与试药
岛津GC-MS QP2010PLUS气相色谱质谱联用仪；DVB/CAR/PDMS固相微萃取针；野生冬虫夏草(产地：青海玉树)，亚香棒虫草。(附图1)
2、样品的SPME顶空萃取
取野生冬虫夏草或冬虫夏草伪品的全草一支，用置于4℃冰箱内预冷的玛瑙研钵研碎，使粉末全部过10目筛网，混匀。精密称取样品粉末50mg，置于8mL的带有低流失硅橡胶垫的玻璃样品瓶内，在80℃水浴下预平衡60min。将固相微萃取针插入玻璃样品瓶内，置于样品瓶上方空间，在80℃下顶空萃取80min。
3、气相色谱-质谱分析
取出萃取针，立即插入GC-MS仪器的进样口加热解吸3min。启动气相色谱程序升温，开始GC-MS测定。色谱柱：HP-5MS毛细管柱(30m×0.25mm×0.25μm)；程序升温条件：初始温度40℃，停留5min，以2℃/min的速度升至200℃，停留10min；进样方式：不分流进样；载气流速1mL/min；进样口温度：250℃；离子源温度：230℃；接口温度250℃；四极杆温度：150℃；离子源电压：70ev；质谱扫描范围：(m/z)30～500amu。
4、数据处理和分析
总离子流图中各色谱图(附图2、3)的保留时间和积分面积由工作站自动完成，利用NIST11谱库检索鉴定色谱峰。各挥发性成分的相对含量通过面积归一化法得到。鉴定结果见表1。
表1挥发性成分的鉴定表
Figure BDA0001486111120000041
Figure BDA0001486111120000051
Figure BDA0001486111120000061
Figure BDA0001486111120000071
Figure BDA0001486111120000081
Figure BDA0001486111120000091
实施例2
本实施例以17批冬虫夏草以及6批冬虫夏草伪品，采用SPME-GC-MS测定数据的主成分分析为例说明鉴别方法，但本发明的保护范围不局限于该实验，具体步骤如下：
1、仪器与试药
岛津GC-MS QP2010PLUS气相色谱质谱联用仪；野生冬虫夏草17批(产地分别为青海、西藏、四川、云南，湖北，1-17号)，冬虫夏草伪品(凉山虫草、亚香棒虫草、古尼虫草、西藏百草、麻脊背虫草、祁连默勒虫草，18-23号)。
2、冬虫夏草的SPME顶空萃取
取冬虫夏草或冬虫夏草伪品，用置于4℃冰箱内预冷的玛瑙研钵研碎，使粉末全部过10目筛网，混匀。精密称取样品粉末30mg，置于8mL的带有低流失硅橡胶垫的玻璃样品瓶内，在90℃水浴下预平衡40min。将固相微萃取针插入玻璃样品瓶内，置于样品瓶上方空间，在90℃下顶空萃取80min。
3、气相色谱-质谱分析
取出萃取针，立即插入GC-MS仪器的进样口加热解吸2min。启动气相色谱程序升温，开始GC-MS测定。程序升温条件：初始温度40℃，停留5min，以2℃/min的速度升至200℃，停留10min；进样方式：不分流进样；载气流速1mL/min；进样口温度：250℃；离子源温度：230℃；接口温度250℃；四极杆温度：150℃；离子源电压：70ev；质谱扫描范围：(m/z)30～500amu。
4、挥发主成分分析
将各样品的GC-MS数据进行积分处理后，生成了PCA图(附图4)。由附图4的PCA图可以直观地鉴别冬虫夏草和冬虫夏草伪品。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干改进和修饰，这些改进和修饰也应视为本发明的保护范围内。

Claims (6)

1.一种鉴别冬虫夏草和冬虫夏草伪品的方法，包括如下步骤：
(a)样品的预处理：取冬虫夏草和冬虫夏草伪品，分别低温粉碎至合适颗粒度得到样品粉末，其中，所述低温粉碎温度为-20℃～10℃，粉碎颗粒度为150目～10目；
(b)固相微萃取：精密称取样品粉末30～50mg，置于低流失样品瓶内，在80～90℃下预平衡40～60min；将固相微萃取的萃取针置于样品瓶上方空间，在80～90℃下静置萃取80min，所述固相微萃取的操作模式为顶空模式；
(c)GC-MS测定：取出萃取针，立即插入GC-MS仪器的进样口加热解吸，解吸时间2～3min；启动气相色谱程序升温，开始GC-MS测定；GC-MS测定条件：色谱柱：HP-5MS毛细管柱，30m×0.25mm×0.25μm；程序升温条件：初始温度40℃，停留5min，以2℃/min的速度升至200℃，停留10min；进样方式：不分流进样；载气流速1mL/min；进样口温度：250℃；离子源温度：230℃；接口温度250℃；四极杆温度：150℃；离子源电压：70ev；质谱扫描范围：m/z 30～500amu；
(d)挥发性成分的鉴定：以质谱谱库检索，对冬虫夏草和冬虫夏草伪品的挥发性成分进行鉴定；计算各峰的相对含量；
(e)主成分分析：通过化学计量学软件对数据进行主成分分析，直观区分冬虫夏草和冬虫夏草伪品。
2.如权利要求1所述的一种鉴别冬虫夏草和冬虫夏草伪品的方法，其特征在于，所述的冬虫夏草伪品是在市场上常用来冒充冬虫夏草销售的冬虫夏草近缘种。
3.如权利要求1所述的一种鉴别冬虫夏草和冬虫夏草伪品的方法，其特征在于，所述的冬虫夏草伪品是亚香棒虫草、古尼虫草、新疆虫草、凉山虫草、戴氏虫草、西藏百草、麻脊背虫草、祁连默勒虫草。
4.如权利要求1所述的一种鉴别冬虫夏草和冬虫夏草伪品的方法，其特征在于，在所述的步骤(a)中，低温粉碎温度为4℃，粉碎颗粒度为10目。
5.如权利要求1所述的一种鉴别冬虫夏草和冬虫夏草伪品的方法，其特征在于，在所述的步骤(b)中，所述固相微萃取针采用的涂层为二乙烯苯基/碳分子筛/聚二甲基硅氧烷(DVB/CAR/PDMS)、聚二甲基硅氧烷(PDMS)、聚二甲基硅氧烷/二乙烯苯基(PDMS/DVB)、二乙烯苯基/碳分子筛(DVB/CAR)、碳分子筛/聚二甲基硅氧烷(CAR/PDMS)、聚丙烯酸酯(PA)中的任意一种。
6.如权利要求1所述的一种鉴别冬虫夏草和冬虫夏草伪品的方法，其特征在于，在所述的步骤(d)中，所述质谱谱库采用NIST谱库；所述的相对含量采用面积归一化方法进行计算。
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