CN110441439B - 区分密叶红豆杉和云南红豆杉的代谢标志物及其检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种用于区分密叶红豆杉和云南红豆杉的代谢标志物及其检测方法。通过色谱结合UPLC‑MS/MS技术，大规模地对密叶红豆杉和云南红豆杉进行非靶向高通量代谢组学分析。明确了密叶红豆杉和云南红豆杉的代谢谱，筛选得到紫杉叶素乙酸酯(Taxifolin 3‑O‑acetate)为一种显著差异的小分子代谢标志物，其显著积累于密叶红豆杉中。本发明的特点是为区分密叶红豆杉和云南红豆杉提供了一种可靠、快速的鉴别方法，为濒危珍稀植物的保护和人工栽培提供了有效的分子手段。

Description

区分密叶红豆杉和云南红豆杉的代谢标志物及其检测方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种用于区分密叶红豆杉和云南红豆杉的代谢标志物及其检测方法。

背景技术

红豆杉是一种全世界公认的珍稀濒危物种，是经过了第四纪冰川遗留至今的古老孓遗树种。作为植物中的活化石，1994年红豆杉被我国定为国家一级保护植物，是植物界的大熊猫。红豆杉属植物在全世界有至少15种，我国有4种加一个变种。由于红豆杉在天然条件下生长缓慢、种子萌发能力弱、种群数量稀少，当前依然处于灭绝的边缘。

红豆杉的经济价值巨大，其植株体内提取的紫杉醇及其衍生物是当今世界上应用最广泛的抗肿瘤药物之一。紫杉醇最早是从短叶红豆杉的树皮中分离得到的抗肿瘤活性成分，是治疗卵巢癌和乳腺癌的特效药物。随着研究的深入，人们还发现紫杉醇对其他癌症，诸如：肺癌、食道癌等也有明显的疗效。红豆杉的全株豆科入药，可以治疗如糖尿病、月经不调、高血压和其他泌尿系统疾病。此外，红豆杉在园林观赏方面也有着广泛的发展前景。利用红豆杉特有的红色果实，红豆杉林木成为当今高档小区、公园和道路的景观用树。

喜马拉雅密叶红豆杉是我国特有的一种红豆杉植物，生长于海拔2500-3400米的喜马拉雅山山区，是国家一级保护植物。云南红豆杉在我国云南省西北部、四川省西南部和西藏自治区东南部都有着一定的分布，是云南省一级重点保护植物，是我国生产紫杉醇的主要原材料。云南红豆杉主要生长于海拔2000-3500米的高山地带。当前，针对密叶红豆杉和云南红豆杉的研究已经取得了初步的进展，发现它们在形态学上高度相似，且都含有一定量的紫杉醇，且生长环境有部分重叠，这给两者的区分鉴别工作带来了一定的困难。准确、快速的鉴别区分，是我们开展野生红豆杉资源保护和合理开始利用的前提条件。

非靶向代谢组学是最近发展起来的一种研究生物体内小分子代谢物的技术。该技术可以全面地解析特定生物体、特定细胞、或特定生理条件下所有代谢物进行定量和定性分析，寻找出具有特征性差异代谢物。作为一门研究小分子代谢物的新兴学科，代谢组学技术是继转录组和蛋白组学之后发展起来的一门学科。通过色谱、质谱、乃至核磁共振等多个手段，非靶向代谢组学技术精确地检测材料中代谢产物的含量差异，广泛地应用于疾病诊断、医药研发、环境检测和植物学基础理论等研究领域。收集代谢物的核质比信号，分析代谢轮廓（metabolomic profiling），可以推定一条特定的代谢途径，发现具有特征指示作用的代谢物。利用现代代谢组技术，发现不同生物样本之间的代谢标志物是当前的一个研究热点。在植物学领域，利用代谢组学技术筛选代谢标志物，并用于植物种间鉴定的研究尚且不多。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术的不足，提供一种用于鉴别密叶红豆杉和云南红豆杉的代谢组标志物-------紫杉叶素乙酸酯，其在密叶红豆杉中的含量远高于云南红豆杉，这为解决红豆杉育种和造林过程中遇到的树种鉴定问题提供了很好的技术手段。

紫杉叶素乙酸酯作为鉴定密叶红豆杉和云南红豆杉的代谢标志物上的应用，其化学特征如下：其分子式为C₁₇H₁₄O₈，分子量为346.3，化学结构式如下所示：

密叶红豆杉中紫杉叶素乙酸酯的质量含量是云南红豆杉的10-15倍。

作为优选，用于高效区分密叶红豆杉和云南红豆杉幼苗。

本发明的另一个目的是提供上述密叶红豆杉和云南红豆杉的检测方法，具体是

1）研磨后密叶红豆杉或云南红豆杉枝条样品用45%-55%甲醇缓冲液提取代谢物。

将120 μL预冷至-20℃的体积含量50%甲醇加入到25 mg红豆杉样品，轻轻震荡1min，室温孵育10 min，再置于-20℃下过夜，4000 × g离心20 min后，上清液于-80°C保存或干燥保存；

2）将上述提取液上清液进行LC-MS分析，最后根据紫杉叶素乙酸酯的质量含量判断，若紫杉叶素乙酸酯的质量含量高于0.15 mg/g则为密叶红豆杉，反之则为云南红豆杉；

高效气相色谱条件如下：

色相系统为：SCIEX UPLC系统；

色谱柱温度为：35℃；

色谱柱为：酸性丙烯酰胺柱（100mm*2.1mm，1.7µm, Waters，UK）；

流动相：流动相A为25 mM醋酸铵+25 mM 氨水，流动相B为9:1的IPA:ACN的+0.1%蚁酸；

流动相梯度为：0-0.5 min 为95%的流动相B、0.5-9.5 min为95%到65%的流动相B、9.5-10.5 min为65%-40%的流动相B、10.5-12 min为40%-95%的流动相B、12.2-15 min为95%的流动相B；

质谱条件如下：

高分辨率质谱仪：TripleTOF5600plus型；

遮蔽气设置为30 PSI，离子源Gas1为60 PSI，离子源Gas2为60 PSI；

加热温度为650℃；

对于正离子模式，离子喷射电压分别为5000 V，对于负离子模式，离子喷雾电压浮动分别为-4500 V；

质谱数据采集采用IDA模式，TOF质量范围为60-1200 Da。

本发明的有益效果：

1. 本发明的精确度高，操作程序化，灵敏度高，结果准确可靠。

2. 本发明可用于野外采集的样本，无需冷冻保存，采集的样本室温下简单干燥保存即可用于代谢标志物的提取和检测。本发明所需的检测样本生物量较少，仅为25 mg，对于需鉴定的珍稀红豆杉幼苗的伤害较小。

3.本发明利用高效色谱与质谱联用方法，获得了密叶红豆杉和云南红豆杉的非靶向代谢谱，鉴别了不同树种中的一系列代谢物，并通过定量分析得到了两者之间的差异代谢物。通过P值显著性分析法，筛选得到显著差异代谢物。

附图说明

图1为红豆杉样本所有质谱数据，(a) 质谱数据的总离子流图。（b）核质比宽度。（c）保留时间宽度。

图2为红豆杉样本主成分分析结果。

图3为红豆杉样本的主要代谢物离子浓度比较图。

图4为紫杉叶素乙酸酯标准质谱图。

图5为紫杉叶素乙酸酯在密叶红豆杉和云南红豆杉的UPLC-MS/MS定量检测结果。

具体实施方式

为了使本专利的目的、技术和特点更加清楚，以下通过具体实施例进一步来为本专利进行详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用于解释本专利，并不用于限定本专利。

实施例1：密叶红豆杉和云南红豆杉代谢物的提取与对照控制样本制备

实验样本处理：

准确称取红豆杉的小枝（twig）各25mg用于代谢物的提取。

往研磨后的红豆杉样本中加入120 μL预冷45%-50%甲醇提取液，在离心管中进行混合。轻轻震荡1 min，室温孵育10 min，再置于-20℃下过夜，4000 × g离心20 min后，上清液于-80°C保存或干燥保存；

对照样本处理：

为了更好的分析密叶和云南红豆杉两组样本之间的定量差异，准备一组高质量的对照控制样本。该对照样本的配制如下：取15个独立的密叶红豆杉实验样本和15个独立的云南红豆杉实验样本，将上述30个样本等体积混合后制成对照控制样本。

实施例2：密叶红豆杉和云南红豆杉代谢物的注释

本发明的实施过程中，检测到大量的质谱数据，包括峰值（peak），保留时间（retention time）和注释信息等。得到的质谱原始数据，通过XCMS，CAMERA和metaX等软件转化为XML格式，再进行下一步分析。得到的不同离子数据通过保留时间和核质比来进行鉴定。将产生的离子信息比对其精确的分子量，并通过KEGG和 HMDB在线数据库进行注释。所有质谱数据的总离子流图谱、核质比宽度和保留时间宽度等参数如图1所示。

本发明共得到7432个有效离子特征，并以此产生4893个成功注释的代谢物。注释结果表明，大部分鉴定得到的代谢物都可以归入至少一条代谢途径。上述得到注释的代谢物主要归入卟啉和叶绿素代谢、2-氧羧酸代谢、氨基酸生物合成、ABC转运蛋白、二萜类生物合成和次级代谢物合成等代谢途径中。

实施例3：密叶红豆杉和云南红豆杉标志性差异代谢物筛选

为了筛选密叶红豆杉和云南红豆杉标志性差异代谢物，本发明检测了包括变异系数（Coefficient of Variation）和主成分分析（PCA）两种主要的质量控制参数。其中，变异系数值低于30%，显示了较高的可重复性。主成分分析结果显示，PC1和PC2的变异值分别为59.75%和5.43%，这说明两个红豆杉种的区分度较高，具体结果见图2。剔除低质量代谢物之后，一共筛选得到了4567种高质量代谢物用于筛选显著差异积累代谢物。统计结果显示，一共筛选得到345个显著差异积累的代谢物，其中145个显著积累于密叶红豆杉，另200个显著积累于云南红豆杉。上述差异代谢物可分为多个主要代谢物类别，包括生物碱、氨基酸、黄酮、激素、脂类、萜类、苯丙素类和糖类等。上述主要代谢物在密叶红豆杉和云南红豆杉之间存在较大差异。通过计算归一化的离子浓度，将主要代谢物在密叶红豆杉和云南红豆杉之间的差异显示于图3中。本发明通过分析显著差异积累代谢物，鉴定得到一种紫杉叶素乙酸酯（Taxifolin 3-O-acetate）为密叶红豆杉和云南红豆杉标志性差异代谢物。

实施例4：紫杉叶素乙酸酯（Taxifolin 3-O-acetate）标准品及其液质图谱

于化源网购买紫杉叶素乙酸酯（Taxifolin 3-O-acetate）标准品，其特征如下：CAS号为78834-97-6；分子量为346.288；分子式为C₁₇H₁₄O₈；PSA值为133.52；LogP值为1.7571。紫杉叶素乙酸酯标准质谱图如图4所示。利用上述标准品，精确测定红豆杉样本中的紫杉叶素乙酸酯含量。

实施例:5：区分密叶红豆杉和云南红豆杉标志性差异代谢物可靠性验证实例

于西藏自治区喜马拉雅山海拔4000米的吉隆县境内（北纬29度22分，东经95度26分）采集密叶红豆杉样本。于西藏自治区喜马拉雅山海拔1200米的墨脱县境内（北纬28度28分，东经85度13分）采集云南红豆杉样本。采集得到的样本分别编号为：MY1-10（密叶红豆杉）和YN1-10（云南红豆杉）。

将采集得到的红豆杉小枝在在40度烘箱中充分干燥，经过一个孔径为0.42 mm的筛子过滤，每个样本精确称量0.5g干粉，加入15 mL100%的甲醇，混合均匀。混合液在150 W，40 kHz超声波下处理30 min。裂解液4000 × g离心20 min后，上清液转入新离心管。真空干燥后，再次溶解于50%的甲醇中，备用。将所得样本进行10倍体积稀释后，进行UPLC-MS/MS定量检测。检测结果表明，紫杉叶素乙酸酯在密叶红豆杉中的平均含量显著高于云南红豆杉。具体结果如图5所示。上述结果验证了紫杉叶素乙酸酯作为一种区分密叶红豆杉和云南红豆杉的标志性代谢物的可靠性。本发明基于代谢组学技术，筛选得到一种可用于区分密叶红豆杉和云南红豆杉的标志性代谢物，所需样本仅为0.5g，准确率为100%。

上述实施例并非是对于本发明的限制，本发明并非仅限于上述实施例，只要符合本发明要求，均属于本发明的保护范围。

Claims (4)

1.紫杉叶素乙酸酯作为鉴定密叶红豆杉和云南红豆杉的代谢标志物上的应用，其化学特征如下：其分子式为C₁₇H₁₄O₈，分子量为346.3，化学结构式如下所示：

。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于密叶红豆杉中紫杉叶素乙酸酯的质量含量是云南红豆杉的10-15倍。

3.如权利要求1所述的应用，其特征在于密叶红豆杉和云南红豆杉为幼苗。

4.一种区分密叶红豆杉和云南红豆杉的检测方法，其特征在于该方法包括以下步骤：

1）研磨后密叶红豆杉或云南红豆杉枝条样品用甲醇提取代谢物：

将120 μL预冷至-20℃的体积含量50%甲醇加入到25 mg红豆杉样品，轻轻震荡1 min，室温孵育10 min，再置于-20℃下过夜，4000 × g离心20 min后，上清液于-80°C保存或干燥保存；

2）将上述提取液上清液进行LC-MS分析，最后根据紫杉叶素乙酸酯的质量含量判断，若紫杉叶素乙酸酯的质量含量高于0.15 mg/g则为密叶红豆杉，反之则为云南红豆杉；

所述紫杉叶素乙酸酯分子式为C₁₇H₁₄O₈，分子量为346.3，化学结构式如下所示：

。

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