CN108627596B - 一种红豆杉枝条中多种黄酮化合物含量的检测方法及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种红豆杉枝条中多种黄酮化合物含量的检测方法，所述的检测方法为检测芦丁、槲皮素、穗花杉双黄酮、异银杏双黄酮和金松双黄酮的含量，包括以下步骤：供试品溶液的制备；对照品溶液的制备；高效液相色谱法测定，分别将供试品溶液和对照品溶液注入高效液相色谱仪检测，色谱条件如下：用C18作为色谱柱，以甲醇‑水混合溶液为流动相，梯度洗脱，检测波长为330nm，流速为1.0mL/min，柱温30℃，理论塔板数不低于3000。本发明采用高效液相色谱法同时检测红豆杉枝条中芦丁、槲皮素、穗花杉双黄酮、异银杏双黄酮、金松双黄酮的含量，方法简单、重复性好、回收率高，能准确测定红豆杉枝叶中5种黄酮的含量，方便快捷。

Description

一种红豆杉枝条中多种黄酮化合物含量的检测方法及其制备 方法

技术领域

本发明涉及黄酮的提取检测技术领域，尤其涉及一种红豆杉枝条中多种黄酮化合物含量的检测方法。

背景技术

红豆杉是红豆杉科红豆杉属植物，又名紫杉，《中华本草》、《中药大辞典》中记载红豆杉“利水消肿，主治肾炎浮肿，小便不利”；《浙江省中药饮片炮制规范》对南方红豆杉的性味归经及功能主治进行了记载：“其微甘、苦、平，归肾、心经”，具有消肿散结、通经利尿的功效，临床上可用于癥瘕积聚，水肿，小便不利，风湿痹痛等。

生物类黄酮物质具有优良的药理活性，具有提高机体免疫能力、抗炎、护肝、杀菌、抗病毒、抗风湿等作用，红豆杉中黄酮的含量会受品种、季节和树龄等影响，建立一种红豆杉中黄酮含量的检测方法，并对红豆杉中黄酮含量进行分析，能使红豆杉的开发和利用达到最大限度，从而获得更大的经济利益。

对比文件1：申请号为“CN201310031014.5”，名称为“具有降血糖作用的红豆杉提取物及其制备方法与应用”，本发明公开了从红豆杉科植物枝叶中，采用现代分离手段提取红豆杉提取物，该有效部位中精制双黄酮类的含量可达50％～80％，其中主要有效成分为金松双黄酮、银杏黄素、异银杏黄素、穗花双黄酮，但是并未对各黄酮含量进行测定。

目前关于红豆杉中黄酮含量的研究较少，仅有少量文献报道了红豆杉黄酮单体的含量，对比文件2：“HPLC测定南方红豆杉叶中两种双黄酮含量，倪亮，内蒙古中医药，2014，33(34):126-127”测定了红豆杉中金松双黄酮和银杏双黄酮含量；对比文件3：“南方红豆杉针叶紫杉烷类化合物、黄酮和多糖含量测定方法及时节变化，陈芳，新疆农业大学，2016.5”测定了红豆杉中槲皮素、穗花杉双黄酮和金松双黄酮的含量。然而红豆杉中含有的黄酮实际上是一个庞大的家族，现已确认其化学结构的生物黄酮类物质至少有4000-5000种，其中包括广为人知的老产品芦丁、茶多酚(以“儿茶素”为代表)、大豆异黄酮(以黄豆苷、染料木素为代表)、橙皮苷、芦丁、槲皮素、银杏双黄酮、穗花杉双黄酮、金松双黄酮等。从现有的文献资料可知，红豆杉中主要含有穗花杉双黄酮、银杏双黄酮和金松双黄酮，但是发明人经过探索发现，红豆杉中还含有大量的芦丁和异银杏双黄酮，所以如何尽可能多的同时检测多种黄酮化合物，且使得液相色谱峰完全分离，各黄酮化合物互不干扰，且检测方法重复性好，是一个亟待解决的难题。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术之缺陷，提供了一种红豆杉枝条中多种黄酮化合物含量的检测方法，采用高效液相色谱法同时检测红豆杉枝条中芦丁、槲皮素、穗花杉双黄酮、异银杏双黄酮、金松双黄酮的含量，方法简单、重复性好、回收率高，能够同时准确测定红豆杉枝叶中5种黄酮的含量，方便快速。

本发明是这样实现的：

本发明目的在于提供一种红豆杉枝条中多种黄酮化合物含量的检测方法，包括如下步骤：

步骤1、供试品溶液的制备：新鲜红豆杉枝条洗净、干燥、粉碎，精密称取红豆杉粉末置于离心管中，粉末经溶剂脱脂、提取步骤，浓缩后定容，过滤，作为供试品溶液；

步骤2、标准品溶液的制备：分别称量多种黄酮化合物，溶于甲醇溶液后定容，制成各标准品后，吸取适量各标准品溶液混匀配制混合标准品溶液，所述多种黄酮化合物包括芦丁、槲皮素、异银杏双黄酮、穗花杉双黄酮、金松双黄酮5种；

步骤3、高效液相色谱法测定：分别吸取相同体积的标准品溶液与供试品溶液，注入液相色谱仪，记录图谱，分别计算供试品溶液中总黄酮的峰面积和标准品溶液中总黄酮的峰面积；

步骤4、计算各黄酮化合物的含量：浓度C＝(C_标准品×A_供试品)/A_标准品，其中，A_标准品为混合标准品溶液中各黄酮的峰面积，A_供试品为供试品溶液中对应的各黄酮的峰面积，C_标准品为标准品溶液中各黄酮的浓度，C为供试品溶液中对应的各黄酮的浓度。

与现有技术相比，本发明具有如下优点和效果：

1、本发明采用高效液相色谱峰同时检测红豆杉枝条中主要的黄酮化合物芦丁、槲皮素、穗花杉双黄酮、异银杏双黄酮、金松双黄酮的含量，方法简单、重复性好：芦丁、槲皮素、异银杏双黄酮、穗花杉双黄酮、金松双黄酮RSD值分别为1.08％、1.56％、1.79％、0.90％、1.06％，表明方法重现性良好；

2、本发明同时检测芦丁、槲皮素、穗花杉双黄酮、异银杏双黄酮、金松双黄酮多种黄酮化合物，回收率高：芦丁、槲皮素、异银杏双黄酮、穗花杉双黄酮、金松双黄酮回收率分别为96.91％、100.2％、97.80％、97.00％、98.88％；

3、本发明选用了甲醇-水体系作为流动相；5种黄酮化合极性差异大，以梯度洗脱，经过调整后，各化合物主峰与杂质峰完全分离；选择了330nm作为检测波长，在此波长下5种黄酮化合物都有较高的吸收；选用pH为10.0的乙醇-水(80:20)作为提取溶剂，提取率高；能够同时且准确地测定红豆杉枝叶中5种黄酮的含量，各黄酮化合物互不干扰，方便快速，节约时间。

附图说明

图1为芦丁、槲皮素、穗花杉双黄酮、异银杏双黄酮和金松双黄酮混合对照品溶液的液相色谱图；图1中A峰为芦丁；B峰为槲皮素；C峰为穗花杉双黄酮；D峰为异银杏双黄酮；E峰为金松双黄酮；

图2为红豆杉样品溶液的液相色谱图。

具体实施方式

实施例1一种红豆杉枝条中多种黄酮化合物含量的检测方法

一、仪器与试剂信息

Waters e2695型高效液相色谱仪(美国Waters公司)，万分之一天平(常州市天之平仪器设备有限公司)，miiner超纯水机，电热鼓风干燥箱(武汉金宝华科技有限公司)，超声波清洗机(深圳市精钻诚超声波设备有限公司)，5-5N低速离心机(湖南恒诺仪器设备有限公司)，GZY科研及粉碎机(上海高致精密仪器有限公司)。

芦丁、槲皮素、穗花杉双黄酮、异银杏双黄酮、金松双黄酮对照品(上海源叶生物技术有限公司)，色谱级甲醇，分析级甲醇，分析级乙醇，分析级石油醚，分析级氢氧化钠，水为实验室自制超纯水。

二、方法步骤

步骤1、供试品溶液的制备：新鲜红豆杉枝条洗净、干燥、粉碎，精密称取红豆杉粉末置于离心管中，加入石油醚30mL，超声脱脂2次，每次30min，脱脂后的残渣60℃烘干，干燥后的残渣加入pH为10的乙醇-水(80:20)作为提取溶剂流动相超声提取，提取3次，每次超声提取条件为：温度60℃，时间30min，频率100KHz，合并提取液经旋转蒸发干燥，残渣用适量甲醇溶液溶解，并定容至10mL。溶液用0.45μm滤膜过滤即得供试品溶液。5种黄酮化合极性差异大，以梯度洗脱，经过调整后，各化合物主峰与杂质峰完全分离。

步骤2、标准品溶液的制备：精密称量芦丁、槲皮素、异银杏双黄酮、穗花杉双黄酮、金松双黄酮对照品各10mg，溶于甲醇溶液后10mL容量瓶定容，其中异银杏双黄酮和金松双黄酮需滴加少量DMSO溶解后，再加甲醇稀释。各标准品定容后，吸取适量单标溶液配制混合标准品溶液，混合标液所配置的浓度为芦丁400μg/mL、槲皮素100μg/mL、穗花杉双黄酮100μg/mL、异银杏双黄酮200μg/mL、金松双黄酮200μg/mL。

步骤3、高效液相色谱法测定：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μL，注入液相色谱仪，记录图谱，分别计算供试品溶液和对照品溶液中芦丁、槲皮素、穗花双黄酮、异银杏双黄酮和金松双黄酮的峰面积。色谱条件：用C18柱作为色谱柱，以甲醇-水混合溶液为流动相，梯度洗脱，检测波长为330nm，流速为1.00mL/min，柱温30℃，理论塔板数不低于3000；所述甲醇-水梯度洗脱的设置如下表1：

表1

取上述配制的混合对照品标准溶液，分别稀释1、2、5、10、20倍后，按上述液相方法进行HPLC分析。以黄酮浓度为横坐标，以峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。

(1)芦丁的线性方程为：y＝29982x-172761(r＝0.9992)，线性范围为20-400μg/mL；

(2)槲皮素的线性方程为：y＝26934x-221630(r＝0.9991)，线性范围为5-100μg/mL；

(3)穗花杉双黄酮的线性方程为：y＝56290x-166451(r＝0.9994)，线性范围为(5-100μg/mL)；

(4)异银杏双黄酮的线性方程为：y＝64001x-145052(r＝0.9999)，线性范围为(10-200μg/mL)；

(5)金松双黄酮的线性方程为：y＝58703x-157619(r＝0.9996)，线性范围为(10-200μg/mL)。

结果表明芦丁在20-400μg/mL范围内与峰面积积分值呈良好的线性关系，槲皮素和穗花杉双黄酮在5-100μg/mL范围内与峰面积积分值呈良好的线性关系，异银杏双黄酮和金松双黄酮在10-200μg/mL范围内与峰面积积分值呈良好的线性关系。

步骤4、计算各黄酮化合物的含量：浓度C＝(C_标准品×A_供试品)/A_标准品，其中，A_标准品为混合标准品溶液中各黄酮的峰面积，A_供试品为供试品溶液中对应的各黄酮的峰面积，C_标准品为标准品溶液中各黄酮的浓度，C为供试品溶液中对应的各黄酮的浓度。

实验例1液相色谱条件的选择

1、流动相的选择中，对甲醇-水和乙腈-水两种流动相体系进行对比，发现以乙腈-水体系作为流动相时异银杏双黄酮和金松双黄酮主峰拖尾较严重，所以选用了甲醇-水体系作为流动相；5种黄酮化合物极性差异大，用等度洗脱无法进行分离，所以采用梯度洗脱，经过调整后，各化合物主峰与杂质峰完全分离。

2、测定波长的选择

取浓度为40μg/mL的各对照品溶液用紫外分光光度计全波长扫描，发现5种黄酮的最大吸收波长都不同，因此选择了330nm作为检测波长，在此波长下5种黄酮化合物都有一定的吸收。

实验例2供试品处理方法的选择

1、供试品提取溶剂的选择

精密称取红豆杉枝条粉末1.00g四份，置于离心管中，加入石油醚30mL，超声脱脂2次，每次30min，脱脂后的残渣60℃烘干，干燥后的残渣分别加入乙醇、乙醇-水(80:20)、pH为10的乙醇-水(80:20)、甲醇30mL超声提取，提取3次，每次30min，合并提取液经旋转蒸发干燥，残渣用适量甲醇溶液溶解，并定容至10mL。溶液用0.45μm滤膜过滤即得，测定各黄酮的含量结果，结果见表2。

表2不同提取溶剂提取效果比较

由表2可知，碱醇溶液的提取效率最好，故选用pH为10.0的乙醇-水(80:20)作为提取溶剂。

2、提取方法的选择

精密称取红豆杉枝条粉末10.00g三份，置于锥形瓶中，加入石油醚300mL，超声脱脂2次，每次30min，脱脂后的残渣60℃烘干，干燥后的残渣用pH为10.0的乙醇-水(80:20)作为提取溶剂，一份采用超声提取(温度60℃)，提取30min，提取3次，料液比为1:30；第二份采用浸渍提取24h，提取3次，料液比为1:30；第三份，采用回流提取，料液比为1:30，提取温度为80℃，以第一滴冷凝液回流计提取30min，提取三次。三份提取液调至中性后经旋转蒸发干燥，残渣用适量甲醇溶液溶解，并定容至10mL。溶液用0.45μm滤膜过滤即得，测定各黄酮的含量结果，结果见表3。

表3不同提取方法提取效果比较

由表3可知，回流提取法和超声提取法，所测得的黄酮含量略高于浸渍提取，考虑到实验操作的简单性，所以优选超声提取法。

实验例3：稳定性试验

在制备供试样品溶液后的0、1、3、6、9、12h，分别进样，记录峰面积，计算出芦丁、槲皮素、异银杏双黄酮、穗花杉双黄酮、金松双黄酮RSD值分别为1.23％、1.78％、1.43％、0.71％、1.28％，表明供试样品溶液在12h内稳定。

取对照品溶液，按实施例1所述色谱条件连续进样6次，分别记录五种黄酮的峰面积，计算出芦丁、槲皮素、异银杏双黄酮、穗花杉双黄酮、金松双黄酮RSD值分别为1.26％、1.04％、1.09％、0.77％、1.01％，表明仪器精密度良好。

实验例4重复性试验

取红豆杉枝叶样品6份，每份5.0g，精密称定，按实施例1所述方法制备供试样品溶液，按2.1所述液相检测方法测定，记录峰面积，结果显示芦丁、槲皮素、异银杏双黄酮、穗花杉双黄酮、金松双黄酮RSD值分别为1.08％、1.56％、1.79％、0.90％、1.06％，表明方法重现性良好。

实验例5加样回收试验

取已知含量的红豆杉枝条粉末5份，各1.0g，精密称定，分别精密加入芦丁2mg、槲皮素0.1mg、异银杏双黄酮1.0mg、穗花杉双黄酮0.1mg、金松双黄酮0.5mg，按实施例1所述方法制备供试品溶液，检测5种黄酮含量，计算样品含量及加样回收率。结果见表4所示。

表4加样回收率试验结果

回收试验，英文称作recoverytest，是“对照试验”的一种。当所分析的试样组分复杂，不完全清楚时，向试样中加入已知量的被测组分，然后进行测定，检查被加入的组分能否定量回收，以判断分析过程是否存在系统误差的方法。所得结果常用百分数表示，称为“百分回收率”，简称“回收率”，加样回收试验是在已知浓度样品中加入药物，来和标准曲线比，得出相对回收率以及准确度(RSD)，一定的准确度为定量测定的必要条件，因此涉及到定量测定的检测项目均需要验证准确度，如含量测定、杂质定量试验等。准确度应在规定的范围内建立，对于制剂一般以回收率试验来进行验证。试验设计需考虑在规定范围内，制备3个不同浓度的试样，各测定3次，即测定9次，报告已知加入量的回收率(％)或测定结果平均值与真实值之差及其可信限。一般平行测定几个样品的时候，测定这个RSD，然后判断这几个数值的准确性。RSD越小，准确度越高。如重复性、精密度、回收率等试验都需要计算RSD，一般要求RSD不超过2.0％，代表这个实验的重复性(精密度、回收率)良好。

表4的结果表明本发明采用高效液相色谱峰同时检测红豆杉枝条中芦丁、槲皮素、穗花杉双黄酮、异银杏双黄酮、金松双黄酮的含量，能够准确测定红豆杉枝叶中5种黄酮的含量，回收率高：芦丁、槲皮素、异银杏双黄酮、穗花杉双黄酮、金松双黄酮回收率分别为96.91％、100.2％、97.80％、97.00％、98.88％。

所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包括在本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.一种红豆杉枝条中多种黄酮化合物含量的检测方法，其特征在于，包括如下步骤：

步骤1、供试品溶液的制备：新鲜红豆杉枝条洗净、干燥、粉碎，精密称取红豆杉粉末置于离心管中，粉末经溶剂脱脂、提取步骤，浓缩后定容，过滤后作为供试品溶液；

步骤2、标准品溶液的制备：分别称量多种黄酮化合物，溶于甲醇溶液后定容，制成各标准品后，吸取适量各标准品溶液混匀配制混合标准品溶液，所述多种黄酮化合物包括芦丁、槲皮素、异银杏双黄酮、穗花杉双黄酮、金松双黄酮5种；所述多种黄酮化合物包括异银杏双黄酮或金松双黄酮时，需滴加少量DMSO溶解后，再加甲醇稀释后定容；

步骤3、高效液相色谱法测定：分别吸取相同体积的标准品溶液与供试品溶液，注入液相色谱仪，记录图谱，分别计算供试品溶液中总黄酮的峰面积和标准品溶液中总黄酮的峰面积；高效液相色谱条件为：用C18柱作为色谱柱，以甲醇-水混合溶液为流动相，梯度洗脱，洗脱条件为：

检测波长为330nm，流速为1.00mL/min，柱温30℃，色谱柱理论塔板数不低于3000；

步骤4、计算各黄酮化合物的含量：浓度C＝(C_标准品×A_供试品)/A_标准品，其中，A_标准品为混合标准品溶液中各黄酮的峰面积，A_供试品为供试品溶液中对应的各黄酮的峰面积，C_标准品为标准品溶液中各黄酮的浓度，C为供试品溶液中对应的各黄酮的浓度。

2.如权利要求1所述的红豆杉枝条中多种黄酮化合物含量的检测方法，其特征在于，所述步骤1中，精密称取红豆杉粉末1.00g置于离心管中，粉末经溶剂脱脂、提取步骤，浓缩至干用甲醇溶解定容后，用0.45μm微孔滤膜过滤，作为供试品溶液。

3.如权利要求1所述的红豆杉枝条中多种黄酮化合物含量的检测方法，其特征在于，所述步骤1中的脱脂溶剂为石油醚，溶剂体积为30mL，重复2次。

4.如权利要求1所述的红豆杉枝条中多种黄酮化合物含量的检测方法，其特征在于，所述步骤1中的提取溶剂为乙醇、乙醇-水混合溶液、碱醇溶液、甲醇中的一种。

5.如权利要求1所述的红豆杉枝条中多种黄酮化合物含量的检测方法，其特征在于，所述步骤1中的提取方法为回流提取、超声提取、浸渍提取中的一种。

6.如权利要求5所述的红豆杉枝条中多种黄酮化合物含量的检测方法，其特征在于，所述超声提取条件为：温度60℃，时间30min，频率100KHz。

7.如权利要求1所述的红豆杉枝条中多种黄酮化合物含量的检测方法，其特征在于，所述步骤2中，所述混合标准品溶液中，包括400μg/mL芦丁、100μg/mL槲皮素、100μg/mL穗花杉双黄酮、200μg/mL异银杏双黄酮、200μg/mL金松双黄酮。

8.如权利要求1所述的红豆杉枝条中多种黄酮化合物含量的检测方法，其特征在于，所述C18色谱柱为4.6×250mm×5μm的Eclipse plus C18液相色谱柱。

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