CN107290456A - 一种款冬花液相指纹图谱的构建方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种款冬花HPLC指纹图谱的构建方法和应用，涉及指纹图谱的构建技术领域。本发明液相指纹图谱的构建方法包括如下步骤：(1)款冬花经甲醇提取后过滤膜得测试溶液；(2)经高压液相色谱仪检测得化学指纹图谱；(3)经图谱分析确定款冬花液相指纹图谱中包含14个特征峰。本发明样本前处理简洁、方便、重现性好，且能准确反映款冬花药材的整体质量特征，用于款冬花药材的质量控制。
Description
技术领域
本发明涉及柱色谱法，特别涉及一种款冬花液相指纹图谱的构建方法及其在质量检测中的应用。
背景技术
款冬花为我国传统中药材，具有润肺下气，止咳化痰的功效，含有苯丙素类、萜类、黄酮类、甾体类、生物碱、挥发油等成分。现行的《中国药典》对款冬花质量控制方法较为简单，仅以款冬酮含量作为药材质量评价的单一指标，而单一指标的测定难以真正从整体上反映药材质量。
指纹图谱技术作为一种多组分化学成分样品的有效质量控制方法，能够从整体上反映出待测样品的整体性、特征性，目前被广泛应用于中草药的质量控制。王福刚等(蜜炙款冬花HPLC指纹图谱研究，中药材,第35卷第1期,2012)对蜜炙款冬花指纹图谱进行了研究，共确定13个共有峰，但仅指认了芦丁；杨秀伟等(款冬花药材的HPLC化学成分指纹图谱研究，药学学报,第44卷第5期,2009)建立了款冬花药材的化学成分指纹图谱，确定25个共有峰，但是所指认的16个特征峰中酚酸类成分较少，而这类成分与款冬花止咳祛痰作用密切相关。所以，为了准确评价款冬花药材质量，需要建立一种能全面反映包括酚酸类成分在内的指纹图谱。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术存在的问题，提供一种能全面反映酚酸类成分的款冬花液相指纹图谱的构建方法及其在质量检测方面的应用。
本发明的目的通过如下技术方案实现：
一种款冬花液相指纹图谱的构建方法，包括如下步骤：
(1)测试溶液的制备：取款冬花粉末0.8-1.2g，加入75％甲醇20-25mL，超声提取0.5-1h，以75％甲醇补足损失重量，溶液过0.22μm微孔滤膜即可；
(2)吸取测试溶液至高效液相色谱仪测定，得到化学指纹图谱；所述液相色谱条件：
色谱柱：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；柱温：25℃-35℃；进样量：1-20μL；流速：0.8-1.2mL/min；紫外检测波长：0-42min以240-326nm检测；42-80min以210-230nm检测；流动相：A相为0.01％-0.1％甲酸乙腈，B相为0.01％-0.1％甲酸水溶液，梯度洗脱，每1次进样完成后，系统平衡5min后再次进样。
所述步骤(1)中取款冬花粉末1.0g，加入75％甲醇为20mL，超声提取时间为1h。
所述步骤(2)中液相色谱条件为：柱温：25℃；进样量：10μL；流速：1mL/min；流动相：A相：0.03％甲酸乙腈，B相：0.03％甲酸水溶液。
所述步骤(2)中检测波长：254nm/220nm切换检测；所述指纹图谱有14个特征峰，以12号峰为参照峰，相对保留时间：
1号峰：0.22±0.07；2号峰：0.26±0.03；3号峰：0.27±0.10；4号峰：0.41±0.01；5号峰：0.44±0.02；6号峰：0.48±0.16；7号峰：0.50±0.08；8号峰：0.53±0.10；9号峰：0.73±0.03；10号峰：0.74±0.17；11号峰：0.78±0.01；13号峰：1.23±0.13；14号峰：1.40±0.09。
所选的14个特征峰所对应的化合物分别是：
1号峰：新绿原酸；2号峰：绿原酸；3号峰：隐绿原酸；4号峰：芦丁；5号峰：金丝桃苷；6号峰：异绿原酸B；7号峰：异绿原酸A；8号峰：异绿原酸C；9号峰：槲皮素；10号峰：山奈酚；11号峰：色原酮；12号峰：款冬酮；13号峰：1β,8-bisangeloyloxy-3β,4β-epoxybisabola-7(14),10-diene；14号峰：款冬素酯。
所述步骤(2)中梯度洗脱条件：0-2min，5％A相；2-7min，5％-15％A相；7-35min，15％-30％A相；35-38min，30％-55％A相；38-45min，55％-75％A相；45-65min，75％-80％A相；65-80min，80％-95％A相。
本发明的优点如下：
本发明所建立的款冬花指纹图谱与现有技术相比具有如下优点和效果：1.样本前处理简单、重现性好；2.通过双波长切换可以更灵敏的检测款冬花中不同类型的成分；3.本研究所建立的款冬花指纹图谱特征峰均得到结构指认，可同时检测6种酚酸类成分，更准确的评价款冬花的药材质量。
附图说明
图1为不同流动相条件下款冬花指纹图谱对比
图2为不同检测波长下款冬花指纹图谱对比
图3为款冬花液相指纹图谱，图中1-10号特征峰在紫外254nm下检测；11-14号特征峰在紫外220nm下检测；从左到右分别是特征峰1-14
图4为不同提取溶剂得到的款冬花指纹图谱对比
图5为不同产地款冬花药材指纹图谱对比
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步详细、完整地说明。各实施例中使用到的试剂和器材如下：
1仪器
Agilent 1260高效液相色谱仪(Agilent公司)，G1311C四元梯度泵，G1329B自动进样器，G1316A柱温箱，G1314F紫外检测器，超声波清洗器(KQ5200E，昆山市超声仪器有限公司)，色谱柱Venusil MP C18(250mm×4.6mm，5μm)。
2试剂
乙腈(色谱纯，Fisher公司)，甲醇(色谱纯，Fisher公司)，超纯水，乙酸(色谱纯，Fisher公司)，甲酸(色谱纯，Fisher公司)，其余试剂均为分析纯。
表1不同产地款冬花药材信息及相似度计算结果
实施例1色谱条件的确定及特征峰的指认
1、流动相的选择
实验中共选择五种流动相系统：即甲醇-水、乙腈-水、乙腈-0.03％乙酸水、乙腈-0.03％甲酸水、0.03％甲酸乙腈-0.03％甲酸水对款冬花进行高效液相色谱的测定。如附图1所示，甲醇-水系统与乙腈-水系统均可看到7个较高的色谱峰，但甲醇-水系统下各色谱峰出峰时间较晚，乙腈-水系统下特征色谱峰数目较少；乙腈-0.03％乙酸水系统与乙腈-0.03％甲酸水系统中基线漂移较严重，且乙腈-0.03％乙酸水系统中各峰分离度低，拖尾明显。综上所述，各流动相系统中以0.03％甲酸乙腈-0.03％甲酸水流动相系统为最佳，谱图中各峰分离度较好，峰宽较窄且保留时间适中。
2、检测波长的选择
实验中共选择五个检测波长，即210nm，230nm，254nm，326nm/220nm，254nm/220nm，在这五种检测波长下色谱图均有多个色谱峰，但综合考虑各色谱峰分离程度与吸收度，发现在254nm/220nm各色谱峰明显分离且吸收最强，因此选择254nm/220nm作为检测波长的最优条件(见附图2)，并选择其图谱中的14个色谱峰作为款冬花指纹图谱的特征峰，以12号峰为参照峰，其相对保留时间如下：
1号峰：0.22±0.07；2号峰：0.26±0.03；3号峰：0.27±0.10；4号峰：0.41±0.01；5号峰：0.44±0.02；6号峰：0.48±0.16；7号峰：0.50±0.08；8号峰：0.53±0.10；9号峰：0.73±0.03；10号峰：0.74±0.17；11号峰：0.78±0.01；13号峰：1.23±0.13；14号峰：1.40±0.09(见附图3)。
3、特征峰的指认
经对照品加样比对，确定款冬花指纹图谱中所选的14个特征峰中包括以下化合物：
1号峰：新绿原酸；2号峰：绿原酸；3号峰：隐绿原酸；4号峰：芦丁；5号峰：金丝桃苷；6号峰：异绿原酸B；7号峰：异绿原酸A；8号峰：异绿原酸C；9号峰：槲皮素；10号峰：山奈酚；11号峰：色原酮；12号峰：款冬酮；13号峰：1β,8-bisangeloyloxy-3β,4β-epoxybisabola-7(14),10-diene；14号峰：款冬素酯。
4、供试品溶液制备方法的选择
(1)取款冬花粉末1.0g，加入75％甲醇20mL，超声提取1h，以75％甲醇补足损失重量，溶液过0.22μm微孔滤膜，取续滤液即得待测液。
(2)取款冬花粉末1.0g，加入50％甲醇20mL，超声提取1h，以50％甲醇补足损失重量，溶液过0.22μm微孔滤膜，取续滤液即得待测液。
(3)取款冬花粉末1.0g，加入甲醇20mL，超声提取1h，以甲醇补足损失重量，溶液过0.22μm微孔滤膜，取续滤液即得待测液。
(4)取款冬花粉末1.0g，加入乙醇20mL，超声提取1h，以乙醇补足损失重量，溶液过0.22μm微孔滤膜，取续滤液即得待测液。
结果表明，加入75％甲醇超声1小时，得到的指纹图谱最好，色谱峰含量丰富且保留时间适中。色谱图见附图4。
实施例2指纹图谱方法学考察
下述实验的供试品溶液均采用如下方法制备：
取款冬花粉末1.0g，加入75％甲醇20mL，超声提取1h，以75％甲醇补足损失重量，溶液过0.22μm微孔滤膜即得测试溶液。
精密度实验：
取款冬花药材(SX-9)，连续进样6次，把12号峰作为参照峰，记录其余特征峰的相对保留时间和相对峰面积，结果显示，各色谱峰的相对保留时间的RSD在0.02％～0.66％；相对峰面积的RSD在0.60％～2.05％，表明款冬花的待测溶液通过高效液相色谱分析，整个检测系统的精密度良好。
重复性实验：
取款冬花药材(SX-9)，备样6份，进行高效液相色谱的测定，把12号峰作为参照峰，记录其余特征峰的相对保留时间和相对峰面积，结果显示，各色谱峰的相对保留时间的RSD在0.01％～0.09％；相对峰面积的RSD在0.28％～1.92％，表明该方法重现性良好。
稳定性实验：
取款冬花药材(SX-9)，分别在0小时、2小时、4小时、6小时、8小时、12小时和24小时进样测定，把12号峰作为参照峰，记录其余特征峰的相对保留时间和相对峰面积，结果表明，样品24h各色谱峰的相对保留时间的RSD在0.01％～0.64％；相对峰面积的RSD在0.63％～2.18％，表明款冬花的待测溶液在24h内通过高效液相色谱分析稳定性良好。
实施例3不同产地款冬花液相指纹图谱比较
利用上述建立的款冬花液相指纹图谱条件对26批不同产地款冬花药材(表1)进行测定。
取款冬花粉末1.0g，加入75％甲醇20mL，超声提取1h，以75％甲醇补足损失重量，溶液过0.22μm微孔滤膜，取续滤液即得待测液。以色谱柱Venusil MP(250mm×4.6mm，5μm)为固定相，按照如下液相条件进行测试：
紫外检测波长为254nm/220nm切换检测；柱温为25℃；进样量为10μL；流速为1mL/min；梯度洗脱条件为0-2min，5％A相；2-7min，5％-15％A相；7-35min，15％-30％A相；35-38min，30％-55％A相；38-45min，55％-75％A相；45-65min，75％-80％A相；65-80min，80％-95％A相(其中A相为0.03％甲酸乙腈，B相为0.03％甲酸水溶液)。每1次测样完成后，系统平衡5min后再次进样。
如附图5所示，不同产地款冬花液相指纹图谱整体较为接近，但个别产地的样本与其他样本存在一定差异：河北产区款冬花的指纹图谱轮廓接近，但2号图谱各色谱峰信号较低；甘肃产区与内蒙产区的款冬花药材液相指纹图谱相似，说明这两个产地款冬花中各成分含量差异较小；山西产区的21号野生样本与同一产地其他样本的图谱差异较大，主要表现为10min-30min内各色谱峰信号响应较低。因此对不同产地栽培款冬花指纹图谱采用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统2008版》进行评价，26批款冬花药材与生成的对照图谱相似度在0.9以上(见表1)。
Claims (6)
1.一种款冬花液相指纹图谱的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)测试溶液的制备：取款冬花粉末0.8-1.2g，加入75％甲醇20-25mL，超声提取0.5-1h，以75％甲醇补足损失重量，溶液过0.22μm微孔滤膜即可；
(2)吸取测试溶液至高效液相色谱仪测定，得到化学指纹图谱；所述液相色谱条件如下：
色谱柱：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；柱温：25℃-35℃；紫外检测波长：0-42min以240-326nm检测；42-80min以210-230nm检测；流动相：A相为0.01％-0.1％甲酸乙腈，B相为0.01％-0.1％甲酸水溶液，梯度洗脱，每1次进样完成后，系统平衡5min后再次进样。
2.如权利要求1所述的一种款冬花液相指纹图谱构建方法，其特征在于，所述步骤(1)中所取款冬花粉末为1g，加入75％甲醇的体积为20mL，超声提取的时间为1h。
3.如权利要求1所述的一种款冬花液相指纹图谱构建方法，其特征在于，所述步骤(2)中液相色谱条件为：柱温：25℃，流动相A相为0.03％甲酸乙腈，流动相B相为0.03％甲酸水溶液。
4.如权利要求1所述的一种款冬花液相指纹图谱构建方法，其特征在于，所述步骤(2)紫外检测波长条件：0-42min以254nm检测，42-80min以220nm检测；所述指纹图谱有14个特征峰，以12号峰为参照峰，相对保留时间如下：
1号峰：0.22±0.07；2号峰：0.26±0.03；3号峰：0.27±0.10；4号峰：0.41±0.01；5号峰：0.44±0.02；6号峰：0.48±0.16；7号峰：0.50±0.08；8号峰：0.53±0.10；9号峰：0.73±0.03；10号峰：0.74±0.17；11号峰：0.78±0.01；13号峰：1.23±0.13；14号峰：1.40±0.09。
5.如权利要求1所述的一种款冬花液相指纹图谱构建方法，其特征在于，所述步骤(2)中梯度洗脱的条件：0-2min，5％A相；2-7min，5％-15％A相；7-35min，15％-30％A相；35-38min，30％-55％A相；38-45min，55％-75％A相；45-65min，75％-80％A相；65-80min，80％-95％A相。
6.如权利要求1所述方法得到的款冬花液相指纹图谱在款冬花质量检测中的应用。
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| GR01 | Patent grant | ||
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