CN109001323A - 一种款冬花液相特征图谱的构建方法 - Google Patents

一种款冬花液相特征图谱的构建方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种款冬花特征图谱的构建方法，涉及中药特征图谱的构建技术领域。本发明液相特征图谱的构建方法，包括如下步骤：(1)款冬花经50％甲醇提取后过滤膜得测试溶液；(2)经高效液相色谱仪检测得化学特征图谱；(3)经图谱分析确定款冬花液相特征图谱中包含9个特征峰。本发明样本前处理简洁、方便、分析时间较短，重现性好，且能准确反映款冬花药材的某些重要的特征信息，其可用于准确鉴别款冬花的质量。

Description

一种款冬花液相特征图谱的构建方法
技术领域
本发明涉及中药特征图谱的构建，特别涉及一种款冬花液相特征图谱的构建方法。
背景技术
款冬花为我国传统中药材，具有润肺下气，止咳化痰的功效，含有苯丙素类、萜类、黄酮类、甾体类、生物碱、挥发油等成分。现行的《中国药典》及部分文献对款冬花质量控制方法较为简单，仅以款冬酮作为药材质量评价的单一指标，而单一指标的测定难以真正准确鉴别药材质量。
特征图谱是选取图谱中某些重要的特征信息，作为控制中药质量的重要鉴别手段。其中，特征图谱改变了以往单一成分或主斑点的鉴别模式，主要用于中药材、饮片、提取物的真伪鉴别与制剂处方多药味的鉴别，以及评价药材的道地性与制剂质量的稳定性。目前2015版《中国药典》中已有羌活、沉香药材和山楂叶、茵陈、连翘提取物建立了特征图谱，而款冬花的特征图谱药典尚未收载，也未见相关文献报道。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术存在的问题，提供一种能全面反映款冬花药材质量的特征图谱的构建方法。
本发明的目的通过如下技术方案实现：
一种款冬花液相特征图谱的构建方法，包括如下步骤：
1、一种款冬花液相特征图谱的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)对照溶液的制备：取款冬花对照药材粉末1g，加入50％甲醇(体积浓度)20mL，超声提取0.5-1h，以50％甲醇补足损失重量，溶液过0.22μm微孔滤膜即可；
(2)供试品溶液的制备：取款冬花粉末1g，加入50％甲醇20mL，超声提取0.5-1h，以50％甲醇补足损失重量，溶液过0.22μm微孔滤膜即可；
(3)分别吸取对照溶液与测试溶液至高效液相色谱仪测定，得到化学特征图谱；所述液相色谱条件如下：
色谱柱：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；柱温：25℃-35℃；紫外检测波长：0-25min以254nm检测，25-45min以220nm检测；流动相：A相为乙腈，B相为0.3％～0.5％磷酸水溶液，梯度洗脱，每1次进样完成后，系统平衡5min后再次进样；
梯度洗脱条件：0-10min，13％A相；10-25min，13％-40％A相；25-30min，40％-90％A相；30-45min，90％-95％A相；
(4)分析供试品特征图谱中是否呈现与对照药材中的9个主要特征峰保留时间相对应的色谱峰；9个特征峰所对应的化合物分别是：1号峰：绿原酸；2号峰：芦丁；3号峰：金丝桃苷；4号峰：异绿原酸B；5号峰：异绿原酸A；6号峰：异绿原酸C；7号峰：款冬酮；8号峰：1β,8-bisangeloyloxy-3β,4β-epoxybisabola-7(14),10-diene；9号峰：款冬素酯。
所述步骤(1)和(2)中超声提取时间为0.5h。
所述步骤(3)中液相色谱条件中的柱温：25℃，流动相B相为0.4％磷酸水溶液。
所述步骤(4)中所述特征图谱的9个特征峰，以2号峰为参照峰，相对保留时间：1号峰：0.575±0.008；3号峰：1.045±0.000；4号峰：1.087±0.001；5号峰：1.132±0.002；6号峰：1.153±0.003；7号峰：1.716±0.002；8号峰：1.855±0.002；9号峰：2.037±0.007。
本发明所建立的款冬花特征图谱具有如下优点和效果：1.样本前处理简单、分析时间较短，重现性好；2.通过双波长切换可以更灵敏的检测款冬花中不同类型的成分；3.本发明所建立的款冬花特征图谱特征峰均得到结构指认，可同时检测4种酚酸类成分，3种倍半萜类成分，2种黄酮类成分，更准确的评价款冬花的药材质量。
附图说明
图1为不同提取条件下款冬花HPLC特征图谱对比
图2为不同流动相条件下款冬花HPLC特征图谱对比
图3为不同检测波长条件下款冬花HPLC特征图谱对比
图4为52批款冬花药材生成的对照HPLC特征图谱
图5为不同柱温考察结果
图6为不同流速考察结果
图7为不同色谱柱考察结果
图8为52批款冬药材HPLC特征图谱结果
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步详细、完整的说明。
各实施例中使用到的试剂和器材如下：
1仪器
Agilent 1260高效液相色谱仪(Agilent公司)，G1311C四元梯度泵，G1329B自动进样器，G1316A柱温箱，G1314F紫外检测器，超声波清洗器(KQ5200E，昆山市超声仪器有限公司)，色谱柱Venusil MP C18(250mm×4.6mm，5μm)。
2试剂
乙腈(色谱纯，Fisher公司)，甲醇(色谱纯，Fisher公司)，超纯水，磷酸(色谱纯，Fisher公司)，其余试剂均为分析纯。
3不同产地款冬花药材信息(见表1)
表1不同产地款冬花药材信息
实施例1供试品溶液制备条件、色谱条件的确定及特征峰的指认
1、供试品溶液制备方法的选择
六种供试品溶液不同制备方法比较：比较样品为No.14。
方法一：精密称定款冬花粉末1g，置于具塞锥形瓶中，精密加入甲醇20mL，超声提取半小时，放置冷却至室温，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，用0.22μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。
方法二：精密称定款冬花粉末1g，置于具塞锥形瓶中，精密加入乙醇20mL，，超声提取半小时，放置冷却至室温，用乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，用0.22μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。
方法三：精密称定款冬花粉末1g，置于具塞锥形瓶中，精密加入30％甲醇20mL，超声提取半小时，放置冷却至室温，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，用0.22μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。
方法四：精密称定款冬花粉末1g，置于具塞锥形瓶中，精密加入50％甲醇20mL，超声提取半小时，放置冷却至室温，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，用0.22μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。
方法五：精密称定款冬花粉末1g，置于具塞锥形瓶中，精密加入75％甲醇20mL，超声提取半小时，放置冷却至室温，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，用0.22μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。
方法六：精密称定款冬花粉末1g，置于具塞锥形瓶中，精密加入50％甲醇20mL，称定重量，超声提取一小时，放置冷却至室温，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，用0.22μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。
六种供试品溶液不同制备方法比较：通过对不同溶剂(乙醇、甲醇)，不同提取时间(0.5h、1h)、不同体积分数甲醇(30％、50％、75％)对款冬花中绿原酸的提取效率考察，结果显示：50％甲醇，料液比1:20，超声提取0.5h，款冬花中绿原酸的提取效率最高，峰面积最大，分离度较好，作为最终实验方法，色谱图见附图1。
2、流动相系统的考察：
考察不同系统的流动相，比较甲醇-水系统，乙腈-水系统，乙腈-水(0.03％甲酸)系统、乙腈-水(0.03％乙酸)系统、乙腈(0.03％甲酸)-水(0.03％甲酸)系统、乙腈-水(0.4％磷酸)系统下色谱图出峰情况。结果表明：(1)甲醇-水系统与乙腈-水系统均可看到7个较高的色谱峰，但甲醇-水系统下各色谱峰出峰时间较晚,乙腈-水系统下特征色谱峰数目较少；(2)对比乙腈-水(0.03％乙酸)系统与乙腈-水(0.03％甲酸)系统发现，上述两个流动相系统中基线漂移较严重，且乙腈-0.03％乙酸水系统中各峰分离度低，拖尾明显，但甲酸对酚酸类成分的分离效果更好，而对倍半萜类成分的分离影响不大；(3)在乙腈(0.03％甲酸)-水(0.03％甲酸)系统与乙腈-水(0.4％磷酸)系统洗脱条件下，款冬花中各色谱峰能实现较好分离，综合考虑实验简便性以乙腈-水(0.4％磷酸)系统为最佳流动相系统，谱图中各峰分离度较好，峰宽较窄且保留时间适中。具体结果见图2-4。
3、梯度洗脱条件的选择，分别考察了4种梯度洗脱条件，见表
表2梯度洗脱条件1
表3梯度洗脱条件2
表4梯度洗脱条件3
表5梯度洗脱条件4
结果发现，梯度洗脱条件4下，色谱峰峰形好，分离度高。因此确定梯度条件4为最佳条件。
4、分析时间的选择：
对款冬花进行45min色谱图的测定，从色谱图可知，25min的色谱图主要包含款冬花样品中的酚酸类成分，而款冬花中的低极性成分在45min内被全部检测，因此选择45min内的图谱作为款冬花药材液相特征图谱较合适。
5、检测波长的选择
实验中共选择五个检测波长，即210nm，230nm，254nm，326nm/220nm，254nm/220nm，在这五种检测波长下色谱图均有多个色谱峰，但综合考虑各色谱峰分离程度与吸收度，发现在254nm/220nm各色谱峰明显分离且吸收最强，因此选择254nm/220nm作为检测波长的最优条件(见附图3)，并选择其图谱中的9个色谱峰作为款冬花特征图谱的特征峰，以2号峰为参照峰，其相对保留时间如下：
1号峰：0.575±0.008；3号峰：1.045±0.000；4号峰：1.087±0.001；5号峰：1.132±0.002；6号峰：1.153±0.003；7号峰：1.716±0.002；8号峰：1.855±0.002；9号峰：2.037±0.007。
6、特征峰的指认
经对照品加样比对，确定款冬花特征图谱中所选的9个特征峰中包括以下化合物：(图4)
1号峰：绿原酸；2号峰：芦丁；3号峰：金丝桃苷；4号峰：异绿原酸B；5号峰：异绿原酸A；6号峰：异绿原酸C；7号峰：款冬酮；8号峰：1β,8-bisangeloyloxy-3β,4β-epoxybisabola-7(14),10-diene；9号峰：款冬素酯。
实施例2特征图谱方法学考察
下述实验的供试品溶液均采用如下方法制备：
取款冬花粉末1.0g，加入50％甲醇20mL，超声提取0.5h，以50％甲醇补足损失重量，溶液过0.22μm微孔滤膜即得测试溶液。
1、柱温、流速的考察：
通过对不同柱温(25℃；30℃；35℃)的考察发现各色谱峰在上述温度下可达到较好分离效果，因此选择室温进行特征图谱测定，见图5。在对不同流速考察时分别选取0.8mL/min、1.0mL/min、1.2mL/min考察发现特征图谱色谱峰出峰情况良好，因此，特征图谱测定时以常规流速1.0mL/min进行特征图谱测定，见图6。
2、耐用性试验：
本实验通过考察Agela Venusil MP C18(250mm×4.6mm,5μm)色谱柱、AgelaVenusil XBP C18(250mm×4.6mm,5μm)色谱柱；Agela Venusil Plus C18(250mm×4.6mm,5μm)三根不同填料的色谱柱，以及Waters高效液相色谱仪、Agilent 1200高效液相色谱仪、Agilent 1260高效液相色谱仪三个不同的仪器对同一样品进行测定，结果表明，各色谱峰相对保留时间与相对峰面积无明显变化，具体结果见图7。
3、精密度试验：
取款冬花药材(No.14)制备供试品溶液，在上述色谱条件与测定方法下连续进样6次，把2号峰作为参照峰，同时记录其余特征峰的相对保留时间与相对峰面积，结果表明，各色谱峰的相对保留时间的RSD在0.01％～0.26％；相对峰面积的RSD在0.09％～2.07％，其相似度达0.998，表明款冬花的待测溶液通过高效液相色谱分析，整个检测系统的精密度良好，符合《国家药品标准工作手册》中药标准要求。结果见表6，表7。
表6精密度试验结果(保留时间Rt和相对保留时间Rt′)
表7精密度试验结果(峰面积A和相对峰面积Ar′)
4、重复性试验：
取款冬花药材(No.14)制备供试品溶液，平行备样6份，在上述色谱条件与测定方法下连续进样测定，把2号峰作为参照峰，同时记录其余特征峰的相对保留时间与相对峰面积，结果表明，各色谱峰的相对保留时间的RSD在0.13％～0.87％；相对峰面积的RSD在0.94％～2.83％，其相似度为0.993，结果表明该方法重现性良好，符合《国家药品标准工作手册》中药标准要求。结果见表8、表9。
表8重复性试验结果(保留时间Rt和相对保留时间Rt′)
表9重复性试验结果(峰面积A和相对峰面积Ar′)
5、稳定性试验：
取款冬花药材(No.14)制备供试品溶液，分别在0小时、2小时、4小时、8小时、12小时、24小时测定特征图谱，以共有峰峰面积计算，RSD值分别为0.15％，1.26％，0.85％，0.47％，1.12％，0.30％，0.86％，1.00％，2.51％；其相似度为0.987，表明款冬花的待测溶液在12h内通过高效液相色谱分析稳定性良好，符合《国家药品标准工作手册》中药标准要求。结果见表10，表11。
表10稳定性试验结果(保留时间Rt和相对保留时间Rt′)
表11稳定性试验结果(峰面积A和相对峰面积Ar′)
实施例3不同产地款冬花液相特征图谱比较
利用上述建立的款冬花液相特征图谱条件对52批不同产地款冬花药材进行测定。
取款冬花粉末1.0g，加入50％甲醇20mL，超声提取0.5h，以50％甲醇补足损失重量，溶液过0.22μm微孔滤膜，取续滤液即得待测液。以色谱柱Venusil MP(250mm×4.6mm，5μm)为固定相，按照如下液相条件进行测试：
紫外检测波长为254nm/220nm切换检测；柱温为25℃；进样量为10μL；流速为1mL/min；梯度洗脱条件为(0-10min，13％A相；10-25min，13％-40％A相；25-30min，40％-90％A相；30-45min，90％95％A相。其中A相为乙腈，B相为0.4％磷酸水溶液)。每1次测样完成后，系统平衡5min后再次进样。
如附图8所示，不同产地款冬花液相特征图谱整体较为接近，52批供试品特征图谱均呈现与款冬花对照药材中的9个主要特征峰保留时间相对应的色谱峰，且通过与芦丁参照峰计算其他8个特征峰的相对保留时间，均在规定值(1号峰：0.575；3号峰：1.045；4号峰：1.087；5号峰：1.132；6号峰：1.153；7号峰：1.716；8号峰：1.855；9号峰：2.037)的±5％以内，说明不同产地、不同采收期款冬花质量较稳定。

Claims (4)

1.一种款冬花液相特征图谱的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)对照溶液的制备：取款冬花对照药材粉末1g，加入50％甲醇20mL，超声提取0.5-1h，以50％甲醇补足损失重量，溶液过0.22μm微孔滤膜即可；
(2)供试品溶液的制备：取款冬花粉末1g，加入50％甲醇20mL，超声提取0.5-1h，以50％甲醇补足损失重量，溶液过0.22μm微孔滤膜即可；
(3)分别吸取对照溶液与测试溶液至高效液相色谱仪测定，得到化学特征图谱；所述液相色谱条件如下：
色谱柱：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；柱温：25℃-35℃；紫外检测波长：0-25min以254nm检测，25-45min以220nm检测；流动相：A相为乙腈，B相为0.3％～0.5％磷酸水溶液，梯度洗脱，每1次进样完成后，系统平衡5min后再次进样；
所述梯度洗脱条件：0-10min，13％A相；10-25min，13％-40％A相；25-30min，40％-90％A相；30-45min，90％-95％A相；
(4)分析供试品特征图谱中是否呈现与对照药材中的9个主要特征峰保留时间相对应的色谱峰；9个特征峰所对应的化合物分别是：1号峰：绿原酸；2号峰：芦丁；3号峰：金丝桃苷；4号峰：异绿原酸B；5号峰：异绿原酸A；6号峰：异绿原酸C；7号峰：款冬酮；8号峰：1β,8-bisangeloyloxy-3β,4β-epoxybisabola-7(14),10-diene；9号峰：款冬素酯。
2.如权利要求书1所述的一种款冬花液相特征图谱的构建方法，其特征在于，所述步骤(1)和(2)中超声提取时间为0.5h。
3.如权利要求书1所述的一种款冬花液相特征图谱的构建方法，其特征在于，所述步骤(3)中液相色谱条件中的柱温：25℃，流动相B相为0.4％磷酸水溶液。
4.如权利要求书1所述的一种款冬花液相特征图谱的构建方法，其特征在于，所述特征图谱的9个特征峰，以2号峰为参照峰，相对保留时间：1号峰：0.575±0.008；3号峰：1.045±0.000；4号峰：1.087±0.001；5号峰：1.132±0.002；6号峰：1.153±0.003；7号峰：1.716±0.002；8号峰：1.855±0.002；9号峰：2.037±0.007。
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