CN110531002B

CN110531002B - 一种用于区分曼地亚红豆杉和东北红豆杉的代谢标志物及其检测方法

Info

Publication number: CN110531002B
Application number: CN201910891849.5A
Authority: CN
Inventors: 沈晨佳; 俞春娜; 冯尚国; 罗秀俊; 徐昕耘; 章铖超; 黄洁芳; 陈玥玥
Original assignee: Hangzhou Normal University
Current assignee: Hangzhou Normal University
Priority date: 2019-09-20
Filing date: 2019-09-20
Publication date: 2022-03-08
Anticipated expiration: 2039-09-20
Also published as: CN110531002A

Abstract

本发明提供一种用于区分曼地亚红豆杉和东北红豆杉的代谢标志物及其检测方法。紫杉碱A作为鉴定曼地亚红豆杉和东北红豆杉的代谢标志物上的应用。曼地亚红豆杉中紫杉碱A的质量含量是东北红豆杉的20‑25倍。本发明的特点是为区分曼地亚红豆杉和东北红豆杉提供了一种可靠、快速的鉴别方法，为濒危珍稀植物的保护和人工栽培提供了有效的分子手段。

Description

一种用于区分曼地亚红豆杉和东北红豆杉的代谢标志物及其检测方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种用于区分曼地亚红豆杉和东北红豆杉的代谢标志物及其检测方法。

背景技术

红豆杉是为红豆杉科红豆杉属乔本植物。红豆杉是第四纪冰川时期孑遗植物，世界珍稀濒危物种。中国红豆杉是中国特有种，我国将其列为一级重点保护植物。红豆杉属植物在全世界有至少15种，我国有4种加一个变种。红豆杉在地球上已有几百万年的历史，属于史前植物，非常珍贵，是植物界的活化石。同时，红豆杉也是世界上公认的濒临灭绝的天然珍稀抗癌植物。

中国红豆杉含有紫杉醇。据统计的临床实验结果表明，紫杉醇对多种癌症亦有显著疗效，总有效率达以上，主要用于治疗晚期乳腺癌、肺癌、卵巢癌及头颈部癌、软组织癌和消化道癌，被称为“晚期癌症的最后一道防线”，被认为是近十年来发现的一种最有希望的抗癌药物。截至目前，已有英、法、日、意大利、加拿大、瑞典、德国、挪威、瑞士、巴西、中国等多个国家获准紫杉醇用于临床治疗。近来还研究发现紫杉醇对类风湿性关节炎、老年性痴呆症等都有很好的疗效。中国红豆杉树形美观大方，四季常青，果实成熟期红绿相映的颜色搭配令人陶醉，可广泛应用于水土保持、园艺观赏等方面，是新世纪改善生态环境，建设秀美山川的优良树种，现常用于高档的庭院绿化观赏。

曼地亚红豆杉（Taxus × media）是红豆杉科红豆杉属下的天然的杂交品种，其母本为东北红豆杉，父本为欧洲红豆杉，常绿针叶树种，多为灌木型，树冠卵形，树皮灰色或赤褐色，有浅裂纹，枝条平展或斜上直立密生，2-3年生枝呈红褐色或黄褐色。曼地亚红豆杉是红豆杉科红豆杉属的一种常绿药用植物。由于紫杉醇含量高达0.03-0.04%，比国内所产红豆杉树种要高，是当前的主栽品种。东北红豆杉（Taxus cuspidata）是红豆杉科，红豆杉属乔木，高可达20米，胸径达1米，树皮红褐色，有浅裂纹。东北红豆杉分布于中国吉林老爷岭、张广才岭及长白山区，日本、朝鲜、俄罗斯也有分布，是一种濒危珍稀野生植物。当前，针对曼地亚红豆杉和东北红豆杉的研究已经取得了初步的进展，但是它们的幼苗在形态学上高度相似，且都含有一定量的紫杉醇，且生长环境有部分重叠，这给两者的区分鉴别工作带来了一定的困难。准确、快速的鉴别区分，是我们推广高效主栽品种，及开展野生红豆杉资源保护的前提条件。

非靶向代谢组学（Untargeted metabolomics）是指采用 LC-MS、GC-MS、NMR技术，无偏向性的检测细胞、组织、器官或者生物体内受到刺激或扰动前后所有小分子代谢物（主要是相对分子量1000 Da以内的内源性小分子化合物）的动态变化，并通过生信分析筛选差异代谢物，对差异代谢物进行通路分析，揭示其变化的生理机制。收集代谢物的核质比信号，分析代谢轮廓（metabolomic profiling），可以推定一条特定的代谢途径，发现具有特征指示作用的代谢物。利用现代代谢组技术，发现不同生物样本之间的代谢标志物是当前的一个研究热点。在植物学领域，利用代谢组学技术筛选代谢标志物，并用于植物种间鉴定的研究尚且不多。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术的不足，提供一种用于鉴别曼地亚红豆杉和东北红豆杉的代谢组标志物-------紫杉碱A，其在曼地亚红豆杉中的含量远高于东北红豆杉，这为解决红豆杉育种和造林过程中遇到的树种鉴定问题提供了很好的技术手段。

紫杉碱A作为鉴定曼地亚红豆杉和东北红豆杉的代谢标志物上的应用，其化学特征如下：其分子式为C35H47O10，分子量为641.7，化学结构式如下所示：

曼地亚红豆杉中紫杉碱A的质量含量是东北红豆杉的20-25倍。

作为优选，用于高效区分曼地亚红豆杉和东北红豆杉幼苗。

本发明的另一个目的是提供上述曼地亚红豆杉和东北红豆杉的检测方法，具体是

1）研磨后曼地亚红豆杉或东北红豆杉枝条样品用45%-55%甲醇缓冲液提取代谢物。

将120 μL预冷至-20℃的体积含量45%-55%甲醇加入到25 mg红豆杉样品，轻轻震荡1 min，室温孵育10 min，再置于-20℃下过夜，4000 × g离心20 min后，上清液于-80°C保存或干燥保存；

2）将上述提取液上清液进行LC-MS分析，最后根据紫杉碱A的质量含量判断，若紫杉碱A的质量含量高于1.23 mg/g则为曼地亚红豆杉，低于0.06 mg/g则为东北红豆杉；

高效气相色谱条件如下：

色相系统为：SCIEX UPLC系统；

色谱柱温度为：35℃；

色谱柱为：酸性丙烯酰胺柱（100mm*2.1mm，1.7µm, Waters，UK）；

流动相：流动相A为25 mM醋酸铵+25 mM 氨水，流动相B为9:1的IPA:ACN的+0.1%蚁酸；

流动相梯度为：0-0.5 min 为95%的流动相B、0.5-9.5 min为95%到65%的流动相B、9.5-10.5 min为65%-40%的流动相B、10.5-12 min为40%-95%的流动相B、12.2-15 min为95%的流动相B；

质谱条件如下：

高分辨率质谱仪：TripleTOF5600plus型；

遮蔽气设置为30 PSI，离子源Gas1为60 PSI，离子源Gas2为60 PSI；

加热温度为650℃；

对于正离子模式，离子喷射电压分别为5000 V，对于负离子模式，离子喷雾电压浮动分别为-4500 V；

质谱数据采集采用IDA模式，TOF质量范围为60-1200 Da。

本发明的又一个目的是提供上述代谢标记物在鉴别曼地亚红豆杉和东北红豆杉的试剂盒中的应用。该试剂盒包括紫杉碱A的标准品和/或检测紫杉碱A的检测试剂。

本发明能产生的有益效果：

1.本发明的精确度高，操作程序化，灵敏度高，结果准确可靠。

2.本发明可用于野外采集的样本，无需冷冻保存，采集的样本室温下简单干燥保存即可用于代谢标志物的提取和检测。本发明所需的检测样本生物量较少，仅为25 mg，对于需鉴定的珍稀红豆杉幼苗的伤害较小。

3.本发明利用高效色谱与质谱联用方法，获得了曼地亚红豆杉和东北红豆杉的非靶向代谢谱，鉴别了不同树种中的一系列代谢物，并通过定量分析得到了两者之间的差异代谢物。通过P值显著性分析法，筛选得到显著差异代谢物。

附图说明

图1为曼地亚红豆杉和东北红豆杉代谢物的注释图。

图2为曼地亚红豆杉和东北红豆杉代谢物的PCA分析结果。

图3为紫杉碱A标准质谱图。

图4为紫杉碱A在MDY1-10（曼地亚红豆杉）和DB1-10（东北红豆杉）含量结果。

具体实施方式

为了使本专利的目的、技术和特点更加清楚，以下通过具体实施例进一步来为本专利进行详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用于解释本专利，并不用于限定本专利。

实施例1：曼地亚红豆杉和东北红豆杉代谢物的提取与对照控制样本制备

实验样本处理：

准确称取红豆杉的小枝（twig）各25mg用于代谢物的提取。

往研磨后的红豆杉样本中加入120 μL预冷45%-50%甲醇提取液，在离心管中进行混合。轻轻震荡1 min，室温孵育10 min，再置于-20℃下过夜，4000 × g离心20 min后，上清液于-80°C保存或干燥保存；

对照样本处理：

为了更好的分析曼地亚和东北红豆杉两组样本之间的定量差异，准备一组对照控制样本。该对照样本的配制如下：取10个独立的曼地亚红豆杉实验样本和10个独立的东北红豆杉实验样本，将上述20个样本等体积混合。将混合液等分为10份，制成对照控制样本。

实施例2：曼地亚红豆杉和东北红豆杉代谢物的注释

本发明的实施过程中，检测到大量的质谱数据，包括峰值（peak），保留时间（retention time）和注释信息等。得到的质谱原始数据，通过XCMS，CAMERA和metaX等软件转化为XML格式。得到的不同离子数据通过保留时间和核质比来进行鉴定。将产生的离子信息比对其精确的分子量，并通过KEGG和 HMDB在线数据库进行注释。

本发明共得到6567个有效离子特征，并以此产生4651个成功注释的代谢物。注释结果表明，大部分鉴定得到的代谢物都可以归入至少一条代谢途径。上述得到注释的代谢物主要归入卟啉和叶绿素代谢、2-氧羧酸代谢、氨基酸生物合成、ABC转运蛋白、二萜类生物合成和次级代谢物合成等代谢途径中，具体结果见图1。

实施例3：曼地亚红豆杉和东北红豆杉标志性差异代谢物筛选

为了筛选曼地亚红豆杉和东北红豆杉标志性差异代谢物，本发明检测了包括变异系数（Coefficient of Variation）和主成分分析（PCA）两种主要的质量控制参数。其中，变异系数值低于25%，显示了较高的可重复性。主成分分析结果显示，PC1和PC2的变异值分别为43.21%和12.32%，这说明两个红豆杉种的区分度较高，具体PCA分析结果见图2。统计结果显示，一共筛选得到245个显著差异积累的代谢物，其中135个显著积累于曼地亚红豆杉，另110个显著积累于东北红豆杉。上述差异代谢物可分为多个主要代谢物类别，包括生物碱、氨基酸、黄酮、激素、脂类、萜类、苯丙素类和糖类等。上述主要代谢物在曼地亚红豆杉和东北红豆杉之间存在较大差异。本发明通过分析显著差异积累代谢物，鉴定得到一种紫杉碱A为曼地亚红豆杉和东北红豆杉标志性差异代谢物。

实施例4：紫杉碱A（Taxine A）标准品及其液质图谱

于化源网购买紫杉碱A（Taxine A）标准品，其特征如下：CAS号为1361-49-5；分子量为641.7；分子式为C₃₅H₄₇NO₁₀；纯度为98%。其标准质谱图如图3所示。利用上述标准品，精确测定红豆杉样本中的紫杉碱A含量。

实施例:5：区分曼地亚红豆杉和东北红豆杉标志性差异代谢物可靠性验证实例

五年生曼地亚红豆杉栽培苗及五年生东北红豆杉栽培苗均种植于杭州师范大学实验苗圃。采集得到的样本分别编号为：MDY1-10（曼地亚红豆杉）和DB1-10（东北红豆杉）。

将采集得到的红豆杉小枝在在40度烘箱中充分干燥，经过一个孔径为0.42 mm的筛子过滤，每个样本精确称量0.5g干粉，加入15 mL100%的甲醇，混合均匀。混合液在150 W，40 kHz超声波下处理30 min。裂解液4000 × g离心20 min后，上清液转入新离心管。真空干燥后，再次溶解于50%的甲醇中，备用。将所得样本进行10倍体积稀释后，进行UPLC-MS/MS定量检测。检测结果表明，紫杉碱A在曼地亚红豆杉中的平均含量显著高于东北红豆杉。具体结果如图4所示。上述结果验证了紫杉碱A作为一种区分曼地亚红豆杉和东北红豆杉的标志性代谢物的可靠性。本发明基于代谢组学技术，筛选得到一种可用于区分曼地亚红豆杉和东北红豆杉的标志性代谢物，所需样本仅为25mg，准确率为100%。

上述实施例并非是对于本发明的限制，本发明并非仅限于上述实施例，只要符合本发明要求，均属于本发明的保护范围。

Claims

1.紫杉碱A作为鉴定曼地亚红豆杉和东北红豆杉的代谢标志物上的应用，其化学特征如下：其分子式为C₃₅H₄₇NO₁₀，分子量为641.7，化学结构式如下所示：

。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于曼地亚红豆杉中紫杉碱A的质量含量是东北红豆杉的20-25倍。

3.如权利要求1所述的应用，其特征在于曼地亚红豆杉和东北红豆杉为幼苗。

4.一种区分曼地亚红豆杉和东北红豆杉的检测方法，其特征在于该方法包括以下步骤：

1）研磨后两种红豆杉枝条样品用甲醇溶液提取代谢物：

将120 μL预冷至-20℃的体积含量45%-55%甲醇加入到25 mg红豆杉样品，轻轻震荡1min，室温孵育10 min，再置于-20℃下过夜，4000 × g离心20 min后，上清液于-80°C保存或干燥保存；

紫杉碱A的分子式为C₃₅H₄₇NO₁₀，分子量为641.7，化学结构式如下所示：

。

5.紫杉碱A在鉴别曼地亚红豆杉和东北红豆杉的试剂盒中的应用，其特征在于紫杉碱A的分子式为C₃₅H₄₇NO₁₀，分子量为641.7，化学结构式如下所示：

。

6.如权利要求5所述的应用，其特征在于该试剂盒包括紫杉碱A的标准品和/或检测紫杉碱A的检测试剂。