CN111607665B - 一种区分曼地亚红豆杉不同品种的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种区分曼地亚红豆杉不同品种的方法。根据转录组测序数据开发的曼地亚红豆杉SSR引物对如SEQ ID NO.1‑54所示。本发明通过筛选曼地亚红豆杉转录组引物，利用电子PCR技术与退火温度的控制，能有效筛选出多态性高、条带清晰、重复性稳定的分子标记体系，可快速准确鉴定出泰斗、绿星、紫科、绿鹰4个不同品种曼地亚红豆杉。
Description
技术领域
本发明属于SSR引物开发领域，具体涉及一种基于转录组数据开发曼地亚红豆杉SSR引物及区分曼地亚红豆杉不同品种的方法。
背景技术
红豆杉是一种全世界公认的珍稀濒危物种。红豆杉属的植物种群在自然环境下竞争力低、生长速度缓慢，并且因为其自身的地理隔离问题存在一定的局限性，因此自然界中的红豆杉属植物日渐稀少。同时，随着对红豆杉的植物提取物紫杉醇的不断开发利用，对其需求量逐年增大，使其种群资源受到严重破坏，野生种群濒临灭绝。红豆杉科有5个属，分别是穗花杉属、榧树属、澳洲红豆杉属、白豆杉属和红豆杉属，主要分布于寒温带、温带和亚热带地区。红豆杉树木作为紫杉醇、紫杉醇合成前体物和衍生物的天然来源，无论是对于紫杉醇的直接提取，还是紫杉醇的生物合成、化学合成及组学研究而言都有着极高的价值。曼地亚红豆杉Taxus media是东北红豆杉T.cuspidata和欧洲红豆杉T.baccata的天然杂交种，属于红豆杉属，其枝叶中含有较高的紫杉醇，是提取紫杉醇的优质原料。自从发现曼地亚红豆杉中含有较高的紫杉醇后，经过不断地栽培和选育，现在曼地亚红豆杉已经扩充至近20个品系。对当前存在的品种的进行遗传多样性的评价可以为优良品质的选育、后代遗传变异程度及杂种优势水平的预测提供可预见性的指导。有研究表明，不同产地、不同生长年限的曼地亚红豆杉中3种紫杉烷类活性成分量存在着差异。因此，如何对曼地亚红豆杉的种质进行准确的分子鉴定对其优良品质的筛选和培育十分重要。
特异性分子标记具有重现性好，扩增靶序列在基因组中位置确定等优点，因而倍受研究者青睐，最常用的特异标记是微卫星序列或简单重复序列(SSR)。SSR是一类一般由2～6个核苷酸为重复单位组成的核苷酸的串联重复序列，分布在基因组中的不同位置，并且具有良好的重复性和稳定性。SSR标记最大的优点在于其产物进行测序胶电泳分离具有单碱基的高分辨率，能检测很高的多态性，遗传信息量较大。
随着高通量测序技术的不断发展，转录组测序技术相比于基因组测序更易拼接，同时基于转录组建立的SSR标记是根据基因本身的差异而建立。迄今为止，尚未有关于曼地亚红豆杉SSR标记开发及应用的研究报道。因此，基于曼地亚红豆杉转录组数据库大规模开发SSR引物，对于曼地亚红豆杉品种鉴定和遗传多样性分析等研究具有重要作用。
发明内容
本发明的第一个目的是针对目前缺乏曼地亚红豆杉SSR标记引物的不足，提取基于转录组序列开发的SSR标记引物。本发明利用转录组数据有着基因功能注释的特点，开发的分子标记可以有针对性的补充与曼地亚红豆杉品质相关的候选分子标记，为曼地亚红豆杉种质资源多样性分析和性状关联分析提供有效标记，为进行曼地亚红豆杉的遗传多样性研究、重要性状基因定位及分子标记辅助育种等研究起到重要的推动作用，进而制定种质资源的保护策略。同时本发明利用曼地亚红豆杉转录组数据开发的分子标记还可以克服盲目的开发、筛选、使用SSR标记的缺点。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
一种根据转录组测序数据开发的曼地亚红豆杉SSR引物对，具体分别为：
本发明的第二个目的是提供上述基于转录组序列开发的SSR标记引物的筛选方法，通过GMATAv2.2软件，对曼地亚红豆杉的转录组数据进行分析获得；具体如下：
步骤(1)、选取曼地亚红豆杉新鲜叶片材料，液氮研磨转移至-70℃下保存；采用试剂盒的方法提取总RNA并进行转录组测序文库构建。
步骤(2)、对转录组测序文库测序，样本单独进行转录本无参组装，使用Trinity对测序得到的reads进行de novo从头组装，获得转录组数据；
步骤(3)、使用GMATAv2.2软件对获得的转录组数据Unigene进行SSR位点搜索，查找条件设置为最低核苷酸数2个，最大核苷酸数6个，最低重复数5次，筛选出符合SSR引物设计的序列；
步骤(4)、在找到某一各SSR位点后，在其前后各100bp范围内，用Primer3-2.2.3设计合适的引物，主要参数设置为：退火温度(Tm)57-63℃，引物长18～22bp，GC含量40-60％，预期扩增产物长度在120～400bp；
步骤(5)、为避免出现发夹结构和引物二聚体。所有引物都要预先做一次电子PCR(ePCR)，根据电子PCR的结果，排除其中专一性差的引物对，选择那些有且只有一个产物的位点为候选的SSR标记，以确保标记的唯一性；
(6)挑选合成步骤(5)设计的SSR引物对，对4个曼地亚红豆杉品种进行PCR扩增和8％PAGE凝胶电泳检测，验证SSR引物对的有效性和多样性。
本发明的又一个目的是提供一种区分不同品种曼地亚红豆杉的方法。
步骤(1)、采取改良CTAB方法对4种不同品种的曼地亚红豆杉的基因组DNA进行提取，具体如下：
1-1：将曼地亚红豆杉叶片置于研钵中，用液氮研磨至粉末；
1-2：将100mg粉末加入600μL 2×CTAB试剂，轻轻摇动混匀；
1-3：置于65℃水浴槽中，每隔10min轻轻摇动，40min后取出；
1-4：常温冷却1min后加入600μL氯仿剧烈振荡混匀；
1-5：12000rpm离心5min；
1-6：取400μL上清液加入上述上清液3/4体积的异丙醇，缓慢颠倒混匀，出现的白色絮状沉淀物即为基因组DNA；
1-7：12000rpm离心5min，去上清；
1-8：加入300μL 75％乙醇轻轻洗涤管壁；
1-9：12000rpm离心2min，去上清；
1-10：倒立置于铺开的纸巾上，风干去乙醇；
1-11：用20μL双蒸水溶解沉淀的DNA，1％琼脂糖检测，余下的保存于-20℃。
步骤(2)、SSR-PCR体系
总反应体积为20μL，具体包括10μL 2×Taq Plus PCR MasterMix，如SEQ IDNO.1-54所示上、下游引物各0.5μL，1μL模板DNA(50ng/μL)，8μL的ddH2O。扩增产物在Eppendorf AG22331 Hamburg型PCR扩增仪上进行PCR扩增反应。
SSR-PCR条件如下：94℃预变性5min；32个循环(94℃变性30s；不同引物Tm值复性30s；72℃延伸1min)；最后72℃延伸10min。
(3)电泳检测
采用8％的非变性聚丙烯酰胺凝胶垂直电泳(PAGE)对步骤二获得PCR产物进行电泳检测，电泳缓冲液为0.5×TBE，200V稳压电泳1.5～2.0小时。
本发明采用GMATAv2.2软件通过映射和图形化的方式为快速SSR分析、标记开发和多态性筛选提供了新的策略和全面的解决方案。此外GMATAv2.2软件只使用侧翼序列作为设计PCR引物的模板，减少了计算内存，加快了大数据序列的设计过程。
本发明通过筛选曼地亚红豆杉转录组引物，利用电子PCR技术与退火温度的控制，能有效筛选出多态性高、条带清晰、重复性稳定的分子标记体系，可快速准确鉴定出泰斗、绿星、紫科、绿鹰4个不同品种曼地亚红豆杉。
附图说明
图1为SSR引物26对曼地亚红豆杉样品PCR扩增后1％琼脂糖电泳结果。通道M：Trans 2k标准分子量；通道1～27分别为表1序号1～27号引物。
图2为SSR引物对4个不同曼地亚品种的8样品的PCR扩增后的丙烯酰胺凝胶电泳结果。通道M：20bp DNA ladder标准分子量；TD为曼地亚品种泰斗，LX为曼地亚品种绿星，ZK为曼地亚品种紫科，LY为曼地亚品种绿鹰。
具体实施方式
为了使本专利的目的、技术和特点更加清楚，以下通过具体实施例进一步来为本专利进行详细说明。此处所描述的具体实施例仅用于解释本专利，并不用于限定本专利。本发明所使用的实验方法均为常规方法，所用实验器材、材料、试剂等均可从商业途径获得。所有试剂盒操作按照说明书进行，转录组建库流程未作说明处按照标准流程进行。
实施例1：总的RNA提取与转录组文库构建
将采集的红豆杉叶片用液氮研磨之后，采用TianGen RNAprep Pure多糖多酚植物RNA提取试剂盒提取其总RNA，用30μL无RNA酶的处理水溶解RNA。并对RNA进行浓度、完整性等质量检验后，保存于-80℃。样本提取的总RNA经过质检合格后，使用连接有Oligo(dT)的磁珠富集真核生物mRNA。经抽提的mRNA被片段化试剂(Fragmentation Buffer)随机打断成短片段，以片段化的mRNA为模板，用六碱基随机引物(Random hexamers)合成一链cDNA，随后加入缓冲液、dNTPs、RNaseH和DNA Polymerase I进行二链cDNA合成。AMPure XP beads纯化双链产物，利用T4 DNA聚合酶和Klenow DNA聚合酶活性将DNA的粘性末端修复为平末端，3’末端加碱基A并加接头，AMPureXP beads进行片段选择，之后用USER酶降解含有U的cDNA第二链进行PCR扩增获得最终测序文库。
实施例2：转录组测序以及数据过滤
文库质检合格后采用Illumina Hiseq4000进行测序，测序读长为双端2*150bp(PE150)。测序产生的原始数据(raw data)需要进行预处理，使用cutadapt去除测序接头后，使用fqtrim过滤掉不合格的序列后得到有效数据(clean data)，再进行下一步分析，具体处理步骤如下：
(1)去除测序reads中的接头序列。
(2)对测序reads进行窗口法质量扫描，扫描窗口默认为6bp，当窗口内平均质量值低于20时，将read从窗口起始到3’终止的部分截掉。
(3)去除poly-A/T。
(4)去除截短后长度小于100bp的序列。
(5)去除截短后N的含量在5％以上的序列。
(6)统计原始测序量，有效测序量，Q20，Q30，GC含量，并进行综合评价。
(7)将所有样本最后进行归一化得到Unigene(Unigene就是各个样本所有基因进行去冗余去重复后得到的唯一)。
实施例3：SSR位点搜索及扩增引物设计
采用GMATAv2.2软件对Unigene进行SSR位点搜索，查找条件设置为2-6个核苷酸重复单元，重复次数大于等于5次。根据查找条件共查得2824个SSR位点，得到的SSR位点中，二核苷酸和三核苷酸为主要的重复基序，分别占总数的43.96％和55.71％。2824个SSR位点由67种不同基序构成，主要以5个重复为主。AG/CT是二核苷酸中最多的重复类型，占全部基序的22.89％。使用软件内嵌的primer3-2.2.3程序进行引物设计，设置参数为：扩增产物长度为120-400bp之间，产物侧翼序列长度为400bp，最佳退火温度为60℃，最大模板长度为2000bp。
实施例4：SSR标记的筛选
为避免出现发夹结构和引物二聚体，所有引物都要预先做一次电子PCR，利用GMATAv2.2软件内嵌的ePCR程序，对上一步得到的SSR引物进行电子PCR验证。根据电子PCR的结果，排除其中专一性差的引物对，选择那些有且只有一个产物的位点为候选的SSR标记，以确保标记的唯一性。对所获得的2824个SSR位点设计引物，其中无法设计出引物的有303个。在剩余的2521个SSR位点中，有2437个SSR位点通过ePCR检测，可以扩增出条带的位点有1018个。排除候选引物中扩增到多个条带的不合格引物以及共用同一对引物的位点，防止干扰后续多态性验证。然后将具有多条扩增条带的引物过滤掉，得到957对引物。在其中随机挑选50个位点设计引物进行后续实验。引物序列由生工生物工程(上海)股份有限公司生工合成。
实施例5：一种区分不同品种曼地亚红豆杉的方法，包括以下步骤：
为了评价开发的SSR引物在曼地亚红豆杉群体中的适用性，同时为了客观、准确的评价曼地亚红豆杉的遗传多样性，本研究利用开发的SSR引物对4种不同品种的曼地亚红豆杉进行分析。
(1)采取改良CTAB方法对4种不同品种的曼地亚红豆杉的基因组DNA进行提取。具体处理步骤如下：
1-1：将曼地亚红豆杉叶片置于研钵中，用液氮研磨至粉末；
1-2：取100mg粉末至1.5ml离心管中，加入600μL 2×CTAB试剂，轻轻摇动混匀；
1-3：将离心管置于65℃水浴槽中，每隔10min轻轻摇动，40min后取出；
1-4：将取出的离心管常温冷却1min后加入600μL氯仿剧烈振荡混匀；
1-5：12000rpm离心5min；
1-6：取400μL上清液移入新的离心管中，加入3/4体积的异丙醇，缓慢颠倒混匀，出现的白色絮状沉淀物即为基因组DNA；
1-7：12000rpm离心5min，去上清；
1-8：加入300μL 75％乙醇轻轻洗涤管壁；
1-9：12000rpm离心2min，去上清；
1-10：将离心管倒立置于铺开的纸巾上，风干去乙醇；
1-11：用20μL双蒸水溶解沉淀的DNA，1％琼脂糖检测，余下的保存于-20℃。
(2)SSR-PCR体系
总反应体积为20μL，具体包括10μL的BIOGENE公司生产的2×Taq Plus PCRMasterMix，上、下游引物各0.5μL，,1μL模板DNA(50ng/μL)，8μL的ddH2O。扩增产物在Eppendorf AG22331 Hamburg型PCR扩增仪上进行PCR扩增反应。
SSR-PCR程序为：94℃预变性5min；32个循环(94℃变性30s；不同引物Tm值复性30s；72℃延伸1min)；最后72℃延伸10min。
(3)电泳检测
本发明通过对50对SSR引物筛选，可在曼地亚红豆杉群体中扩增出稳定性好、清晰度高的特异性条带电泳条带的引物共有27对，扩增率为54％，见图1。
每个SSR引物进行了3次重复扩增，无法重复出来的条带，统计时忽略不计。
(4)SSR引物多态性验证
为筛选出的区分度较好的SSR引物，对供试材料进行PCR扩增及PAGE凝胶电泳、银染，采用8％的非变性聚丙烯酰胺凝胶垂直电泳(PAGE)对步骤二获得PCR产物进行电泳检测，电泳缓冲液为0.5×TBE，200V稳压电泳1.5～2.0小时，并且对电泳结果进行拍照记录。有6个引物编号分别为MDY61、MDY100、MDY101、MDY125、MDY328和MDY416有着较好的区分度,见图2。
若MDY61为扩增引物时，电泳结果出现160bp附近的DNA条带，且MDY328为扩增引物时，电泳结果出现400bp附近的DNA条带，则判定为曼地亚品种泰斗；
若MDY125为扩增引物时，电泳结果350bp附近没出现DNA条带，且MDY328为扩增引物时，电泳结果400bp附近没出现DNA条带，则判定为曼地亚品种绿星；
若MDY61为扩增引物时，电泳结果出现160bp附近的DNA条带，且MDY328为扩增引物时，电泳结果300和400bp附近出现DNA条带，则判定为曼地亚品种紫科；
若MDY61为扩增引物时，电泳结果160bp附近没出现DNA条带，且MDY328为扩增引物时，电泳结果400bp附近出现DNA条带，则判定为曼地亚品种绿鹰。
该电泳图说明本发明提供的基于转录组数据筛选SSR标记的方法准确有效，引物能够运用于曼地亚红豆杉的遗传多样性检测和品种鉴定中。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 杭州师范大学
<120> 一种区分曼地亚红豆杉不同品种的方法
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<170> SIPOSequenceListing 1.0
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Unknown)
<400> 27
attgcttgga attcggtcag 20
<210> 28
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Unknown)
<400> 28
tgctcgcatt ttctttgttg 20
<210> 29
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Unknown)
<400> 29
gccttcttga atttcccaca 20
<210> 30
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Unknown)
<400> 30
ggaaggctcg tattccacaa 20
<210> 31
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Unknown)
<400> 31
atctcagcca aagcagatgg 20
<210> 32
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Unknown)
<400> 32
gcacgcggtc tgagtaaaat 20
<210> 33
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Unknown)
<400> 33
gcctcgttaa agtgcaaacc 20
<210> 34
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Unknown)
<400> 34
cagatgggca tattggttcc 20
<210> 35
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Unknown)
<400> 35
gcaagcctgt tcgaattgat 20
<210> 36
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Unknown)
<400> 36
gaagctcgtt tgcattttcc 20
<210> 37
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Unknown)
<400> 37
cagaagccac attcagcaaa 20
<210> 38
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Unknown)
<400> 38
caccagactg aagcctctcc 20
<210> 39
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Unknown)
<400> 39
aggaggaaac acaggcagaa 20
<210> 40
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Unknown)
<400> 40
tcttcgtcgc tttgaaggtt 20
<210> 41
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Unknown)
<400> 41
tcgctgtcta actccctcgt 20
<210> 42
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Unknown)
<400> 42
tcacgcttct aagcctctcc 20
<210> 43
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Unknown)
<400> 43
acaaaatttc cccgaaaacc 20
<210> 44
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Unknown)
<400> 44
atcagcctct ccatctccaa 20
<210> 45
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Unknown)
<400> 45
agcagagttg cttgccagat 20
<210> 46
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Unknown)
<400> 46
cagtgattcc cgttgttcct 20
<210> 47
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Unknown)
<400> 47
tgtggcgtat cagtctcagc 20
<210> 48
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Unknown)
<400> 48
acgagaagcc caatttcctt 20
<210> 49
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Unknown)
<400> 49
aatggtattg gcagggttga 20
<210> 50
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Unknown)
<400> 50
ctcctccaca accacctgtt 20
<210> 51
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Unknown)
<400> 51
ggatggtaat tccactgatc g 21
<210> 52
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Unknown)
<400> 52
tttcggcctt gattttcttg 20
<210> 53
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Unknown)
<400> 53
ggagggcaaa caaagcataa 20
<210> 54
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Unknown)
<400> 54
aaatcacagc accctgaacc 20
Claims (2)
1.一种根据转录组测序数据开发的曼地亚红豆杉SSR引物对组，其特征在于包括MDY61、MDY100、MDY101、MDY125、MDY328和MDY416；
2.一种区分不同品种曼地亚红豆杉的方法，其特征在于包括以下步骤：
步骤(1)、采取改良CTAB方法对曼地亚红豆杉的基因组DNA进行提取，具体如下：
1-1：将曼地亚红豆杉叶片置于研钵中，用液氮研磨至粉末；
1-2：将100mg粉末加入600μL 2×CTAB试剂，轻轻摇动混匀；
1-3：置于65℃水浴槽中，每隔10min轻轻摇动，40min后取出；
1-4：常温冷却1min后加入600μL氯仿剧烈振荡混匀；
1-5：12000rpm离心5min；
1-6：取400μL上清液加入上述上清液3/4体积的异丙醇，缓慢颠倒混匀，出现的白色絮状沉淀物即为基因组DNA；
1-7：12000rpm离心5min，去上清；
1-8：加入300μL 75％乙醇轻轻洗涤管壁；
1-9：12000rpm离心2min，去上清；
1-10：倒立置于铺开的纸巾上，风干去乙醇；
1-11：用20μL双蒸水溶解沉淀的DNA，1％琼脂糖检测，余下的保存于-20℃；
步骤(2)、SSR-PCR体系
总反应体积为20μL，具体包括10μL 2×Taq Plus PCR MasterMix，权要求利1所述SSR引物对组的上、下游引物各0.5μL，1μL 50ng/μL模板DNA，8μL的ddH2O；
SSR-PCR条件如下：94℃预变性5min；32个循环，其中每个循环包括94℃变性30s，不同引物Tm值复性30s，72℃延伸1min；最后72℃延伸10min；
(3)电泳检测
采用非变性聚丙烯酰胺凝胶垂直电泳对步骤二获得PCR产物进行电泳检测，通过区分度较好的SSR引物进行综合分析。
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Citations (3)
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|---|---|---|---|---|
| CN104480210A (zh) * | 2014-12-22 | 2015-04-01 | 杭州师范大学 | 鉴别曼地亚红豆杉幼苗的核苷酸序列、分子探针和方法 |
| CN109486980A (zh) * | 2017-09-11 | 2019-03-19 | 杭州百迈生物股份有限公司 | 欧洲红豆杉或曼地亚红豆杉的snp分子标记及应用 |
| CN110531002A (zh) * | 2019-09-20 | 2019-12-03 | 杭州师范大学 | 一种用于区分曼地亚红豆杉和东北红豆杉的代谢标志物及其检测方法 |
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2020
- 2020-07-17 CN CN202010691679.9A patent/CN111607665B/zh active Active
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN104480210A (zh) * | 2014-12-22 | 2015-04-01 | 杭州师范大学 | 鉴别曼地亚红豆杉幼苗的核苷酸序列、分子探针和方法 |
| CN109486980A (zh) * | 2017-09-11 | 2019-03-19 | 杭州百迈生物股份有限公司 | 欧洲红豆杉或曼地亚红豆杉的snp分子标记及应用 |
| CN110531002A (zh) * | 2019-09-20 | 2019-12-03 | 杭州师范大学 | 一种用于区分曼地亚红豆杉和东北红豆杉的代谢标志物及其检测方法 |
Non-Patent Citations (5)
| Title |
|---|
| Characterization and application of EST-SSR markers developed from the transcriptome of Amentotaxus argotaenia(taxaceae),a relict vulnerable conifer;xiaoxian ruan等;《frontiers in genetics》;20191018;第1-10页 * |
| Development and characterization of EST-SSR markers for taxus mairei（Taxaceae）and their transferability across species;X.WU等;《Silvae genetics》;20161231;第2016卷;第67-70页 * |
| Development of EST-SSR markers for taxus cuspidata from publicly available transcriptome sequences;Saneyoshi U等;《Biochemical systematics and ecology》;20151231;第63卷;第20-26页 * |
| 南方红豆杉EST-SSR标记的开发及其在父本分析中的应用;武星彤;《中国优秀硕士学位论文农业科技辑》;20180115;第2018卷;第D049-208页 * |
| 红豆杉分子生物学研究进展;周华等;《植物生理学报》;20141231;第50卷(第4期);第373-381页 * |
Also Published As
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