CN109536632A - 基于转录组测序开发的满山红ssr引物对及筛选方法与应用 - Google Patents
基于转录组测序开发的满山红ssr引物对及筛选方法与应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了基于转录组测序开发的满山红SSR引物对及筛选方法与应用。属于生物技术领域。该引物是基于转录组测序和序列分析得到，在转录组测序的基础上，对大量数据进行筛选，获取富含SSR位点的unigene序列并进行EST‑SSR标记的引物设计，克服了目前满山红SSR分子标记数量少、开发效率低的障碍。利用满山红群体验证EST‑SSR引物的有效性，为满山红遗传多样性研究、遗传连锁图谱构、QTL定位、分子标记辅助育种等遗传学研究奠定了基础。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及基于转录组测序开发的满山红SSR引物对及筛选方法与应用。
背景技术
满山红(Rhododendron mariesii Hemsl.et Wils)为杜鹃花科(Ericaceae)杜鹃花属(Rhododendron)落叶灌木，在中国主要分布在河北、陕西、湖北、江苏、安徽、江西、福建、台湾、河南、浙江、湖南、广东、广西、四川、贵州等地，具有较高的园艺观赏价值。满山红具有止咳、祛痰、平喘的功效，用于治疗急、慢性支气管炎、哮喘等病症。从满山红已分离得到的化学成分主要有黄酮类和挥发油等，如金丝桃苷、杜鹃素、山奈酚、槲皮素杨梅酮、黄梅素等。长期以来，众多育种学者满山红的黄酮类等化学成分的提取和生物学活性进行了深入的研究。然而，对满山红种质资源的收集、分类、鉴定、遗传改良研究较少。分子标记作为材料品种鉴定、遗传图谱构建和基因定位的基础，已经成为花卉研究和应用的重要技术手段，但是目前满山红开发的能够用于育种研究的分子标记十分有限，限制了其在满山红优质品种资源快繁中的应用。
简单重复序列(Simple sequence repeats,SSR)，又名微卫星，是一类在真核生物基因组内广泛分布的序列，是1-6核苷酸基序重复构成的，分为基因组SSR(genomic-SSR)和表达序列SSR(EST-SSR)。微卫星序列重复类型和重复次数在种间、种类变化都非常大，使得微卫星其具有高度的多态性。微卫星标记是共显性遗传，且重复性好、特异性强、操作技术，被广泛用于动植物的遗传多样性和遗传结构研究、遗传连锁谱图构建、基因定位、QTL作图、分子标记辅助育种、遗传改良等研究中。目前满山红的基因组尚未测序或者公布，因此genomic-SSR标记的获得需要文库构建和测序分析，操作繁琐。基于表达序列的EST-SSR标记的开发就显得相对简单。
随着第二代高通量测序技术的不断发展与成熟，通过转录组测序获取大规模EST-SSR分子标记成为了可能，目前尚未有利满山红转录组数据开发SSR的相关报道。
发明内容
本发明针对现有技术的不足，提供基于转录组测序开发的满山红SSR引物对及筛选方法与应用。本发明利用RNA-seq技术对满山红花瓣材料进行转录组测序，将数据组装拼接后挖掘含有SSR标记的序列，并将符合SSR引物设计要求的unigenes进行SSR标记的开发，并随机合成部分SSR引物，进行适用性验证。该引物的开发为满山红的遗传多样性和遗传结构研究、遗传图谱构建、分子标记辅助育种、重要性状基因定位和克隆等研究奠定基础。
为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
第一方面，提供一种基于转录组测序开发的满山红EST-SSR引物对，在检测过程中使用25对引物，所述引物分别为：
表1多态性SSR引物信息
。
第二方面，提供上述满山红EST-SSR引物对的下述A1-A6中的任一种用途：
A1、所述EST-SSR引物对在构建满山红遗传图谱中的应用；
A2、所述EST-SSR引物对在满山红种质鉴定中的应用；
A3、所述EST-SSR引物对在满山红育种中的应用；
A4、所述EST-SSR引物对在满山红遗传多样性分析中的应用；
A5、所述EST-SSR引物对在满山红亲缘关系分析中的应用；
A6、所述EST-SSR引物对在满山红分子标记辅助育种中的应用。
第三方面，提供一种鉴定满山红亲缘关系和遗传特性的试剂盒，包括上述的25对EST-SSR引物。
第四方面，提供基于转录组测序开发满山红EST-SSR引物的方法，包括
(1)选取满山红盛花期新鲜花瓣材料，获取后用锡箔纸包裹置于液氮中速冻并迅速转移至-70度冰箱保存；采用高盐Trizol试剂和RNA结合柱的方法提取总RNA；
(2)利用链特异性转录组文库构建试剂盒对总RNA先进行mRNA磁珠富集；将富集到的mRNA进行双链cDNA合成、末端修复和接头连接；再用USER酶降解cDNA第二链，保留真实转录的mRNA第一链信息；经PCR扩增和2.5％的琼脂糖凝胶电泳，回收300-500bp范围的片段，即得到测序文库；再利用Illumina Hiseq2500PE125进行高通量RNA-seq测序；
(3)采用FASTX和CUTADAPT软件过滤数据，并采用Cufflinks软件进行数据组装得到Unigene，将其作为后续SSR引物开发的背景数据；
(4)使用MISA软件对Unigene进行SSR位点搜索，搜索标准为：二核苷酸、三核苷酸、四核苷酸、五核苷酸、六核苷酸最少重复次数分别为10次、7次、6次、5次、5次，筛选出符合SSR引物设计的序列；
(5)利用primer 3.0软件对含有EST-SSR位点且侧翼序列大于50bp的Unigene序列进行引物设计，引物退火温度50-65℃之间，PCR产物大小80-300bp，引物长度18-25nt之间，CG含量40％-60％，避免引物产生二聚体结构、发夹结构和错配情况；
(6)挑选合成步骤(5)设计的EST-SSR引物对，对满山红种群进行PCR扩增和6％PAGE凝胶电泳检测，验证EST-SSR引物对的有效性和通用性。
第五方面，提供获取满山红EST-SSR分子标记的方法，包括：
(1)以满山红的基因组DNA为模板，用上述满山红的成套EST-SSR引物进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；
(2)将(1)中得到的所述PCR扩增产物进行电泳，得到满山红EST-SSR分子标记。
上述方法中，所述PCR扩增采用的引物退火条件可为50-65℃，30s。
上述方法中，所述PCR扩增中采用的PCR反应温度程序可为：94℃预变性10min；然后进入35个循环：94℃变性30s，50-65℃下退火30s，72℃延伸30s，最后72℃延伸7min。
实验证明，本发明基于转录组测序开发满山红EST-SSR引物的方法拼接得到的59,887个Unigene，含SSR序列的Unigene有9,108个，从中统计出10,224个SSR，见表2。挑选合成的25对SSR引物对满山红群体(40个个体)进行PCR扩增验证其有效性，引物序列见表1。采用POPGENE 32.0软件统计大别山满山红种群的遗传多样性，各项遗传多样性结果见表3，大别山满山红种群遗传多样性处于较高的水平。
本发明的有益效果在于：
1、本发明通过花转录组数据获取满山红EST-SSR标记开发的背景数据，方法快捷、准确，比基因组数据获取的gSSR具有更高的通用性和实用性。
2、本发明的25个EST-SSR标记能够很好地用于满山红种群的多样性研究，可将本发明提供的EST-SSR标记应用于满山红近缘属种种质资源遗传多样性研究、遗传图谱构建、目标性状基因定位、分子标记辅助育种等研究。
附图说明
图1是基于RNA-seq数据的SSR引物开发和应用的流程示意图。
图2是实施例中RfE-1引物在40个满山红个体内的PCR扩增电泳检测结果。
具体实施方式
通过以下详细说明结合附图可以进一步理解本发明的特点和优点。所提供的实施例仅是对本发明方法的说明，而不以任何方式限制本发明揭示的其余内容。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
【实施例1】多态性高的满山红的EST-SSR引物的开发
本发明提供的基于转录组高通量测序，并结合生物信息学方法进行SSR序列查找和SSR标记引物设计和验证，其具体实施方式如下：
(1)富含SSR位点的Unigene序列筛选：选取满山红盛花期花瓣材料提取总RNA，构建转录组测序文库，采用Illumina二代测序仪进行高通量测序。严格过滤测序数据，并对转录组数据进行组装，得到Unigene，将其作为SSR标记开发的背景数据。采用MISA软件对Unigene序列进行SSR位点的搜索，搜索标准为：二核苷酸、三核苷酸、四核苷酸、五核苷酸、六核苷酸重复次数最小为10、7、6、5和5次。
其中，拼接得到的81,710个Unigene，含SSR序列的Unigene有11,813个，从中统计出10,224个SSR，见表2。
表2Unigene中SSR重复序列和重复次数统计
(2)采用在线软件primer 3.0软件对富含(AG)n基序的SSR位点且侧翼序列大于50bp的Unigene序列进行引物设计，引物退火温度50-65℃之间，PCR产物大小80-300bp，引物长度18-25bp之间，CG含量40％-60％，引物避免产生二聚体结构，筛选出符合SSR引物设计要求的序列。
(3)采用8个满山红个体，PCR扩增后3％琼脂糖凝胶电泳筛选多态性的SSR引物对。SSR引物序列见表1。引物合成由南京金斯瑞生物科技有限公司合成并采用RPC的方式进行纯化。
【实施例2】25对EST-SSR引物在满山红种群遗传多样性研究中的应用
检测ESR-SSR标记检测黄杜鹃遗传多样性包括以下步骤：
(1)DNA提取：在湖北大别山区采集满山红种群，共40个个体(采集地分布于东经114.56°-115.043°E、北纬31.03°-31.68°N、海拔470-1230m)，编号为MSH1-MSH40。利用3×CTAB法提取40个满山红叶片基因组DNA，并经1％琼脂糖凝胶电泳检测质量和紫外分光光度测定浓度，保证DNA的纯度OD260/
OD280大于1.8。叶片经液氮研磨、酚/氯仿(体积比1:1)抽提、无水乙醇沉淀、75％乙醇洗涤、RNA酶消化等步骤后，将DNA溶于50μL TE溶液中，稀释至
100ng/μl后置于-20℃冰箱保存备用。
(2)PCR扩增：10μl反应体系包含：ddH2O 7.2μl，10×Buffer(Mg2+离子)1μl，dNTPs(2.5mM each)0.2μl，10μM正反引物各0.2μl，Taq DNA聚合酶0.2μl，DNA模板(100ng/μl)0.5μl。反应程序为：94℃预变性10min；94℃变性30sec，最适合退火温度(见表1)下退火30sec，72℃延伸30sec，共扩增35个循环；72℃额外延伸7min。所选引物序列见表1。
(3)6％的PAGE胶检测：将PCR扩增产物取3μl，加1μl 6×DNA loading buffer，进行6％PAGE胶电泳，PAGE胶经硝酸银染色和氢氧化钠溶液显色。结果代表图见图2。
(4)根据引物扩增条带的有无和大小，统计开发的SSR标记在30个满山红个体内的基因型，采用Popgene 32软件统计大别山满山红种群的遗传多样性，各项遗传多样性结果见表3，大别山满山红种群遗传多样性处于较高的水平。
表3基于转录组数据开发的SSR标记检测到的满山红种群遗传多样性
申请人开发的EST-SSR引物检测结果表明本发明利用转录组数据开发了大量的多态性SSR引物，并用这些引物进行种群遗传多样性检测。据此，本发明适用于满山红EST-SSR引物的开发，可将本发明提供的EST-SSR分子标记应用于更多的杜鹃花植物研究中，为后续的满山红及近缘物种种质资源遗传多样性检测、遗传图谱构建、重要性状定位、分子标记辅助育种等研究提供依据。
序列表
<110> 黄冈师范学院
<120> 基于转录组测序开发的满山红SSR引物对及筛选方法与应用
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Claims (5)
1.一种基于转录组测序开发的满山红EST-SSR引物对，在检测过程中使用25对引物，所述引物分别为：
。
2.根据权利要求1所述的满山红EST-SSR引物对，其特征在于，所述引物对退火温度为：
。
3.权利要求1或2所述的满山红EST-SSR引物对的下述A1-A6中的任一种用途：
A1、所述EST-SSR引物对在构建满山红遗传图谱中的应用；
A2、所述EST-SSR引物对在满山红种质鉴定中的应用；
A3、所述EST-SSR引物对在满山红育种中的应用；
A4、所述EST-SSR引物对在满山红遗传多样性分析中的应用；
A5、所述EST-SSR引物对在满山红亲缘关系分析中的应用；
A6、所述EST-SSR引物对在满山红分子标记辅助育种中的应用。
4.一种鉴定满山红亲缘关系和遗传特性的试剂盒，包括权利要求1或2所述的25对EST-SSR引物。
5.一种基于转录组测序开发满山红EST-SSR引物的方法，其特征在于，包括：
(1)选取满山红盛花期新鲜花瓣材料，获取后用锡箔纸包裹置于液氮中速冻并迅速转移至-70度冰箱保存；采用高盐Trizol试剂和RNA结合柱的方法提取总RNA；
(2)利用链特异性转录组文库构建试剂盒对总RNA先进行mRNA磁珠富集；将富集到的mRNA进行双链cDNA合成、末端修复和接头连接；再用USER酶降解cDNA第二链，保留真实转录的mRNA第一链信息；经PCR扩增和2.5％的琼脂糖凝胶电泳，回收300-500bp范围的片段，即得到测序文库；再利用Illumina Hiseq2500PE125进行高通量RNA-seq测序；
(3)采用FASTX和CUTADAPT软件过滤数据，并采用Cufflinks软件进行数据组装得到Unigene，将其作为后续SSR引物开发的背景数据；
(4)使用MISA软件对Unigene进行SSR位点搜索，搜索标准为：二核苷酸、三核苷酸、四核苷酸、五核苷酸、六核苷酸最少重复次数分别为10次、7次、6次、5次、5次，筛选出符合SSR引物设计的序列；
(5)利用primer 3.0软件对含有EST-SSR位点且侧翼序列大于50bp的Unigene序列进行引物设计，引物退火温度50-65℃之间，PCR产物大小80-300bp，引物长度18-25nt之间，CG含量40％-60％，避免引物产生二聚体结构、发夹结构和错配情况；
(6)挑选合成步骤(5)设计的EST-SSR引物对，对满山红种群进行PCR扩增和6％PAGE凝胶电泳检测，验证EST-SSR引物对的有效性和通用性。
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