CN110144418B - 一种普通油茶ssr分子标记引物及标记方法和应用 - Google Patents
一种普通油茶ssr分子标记引物及标记方法和应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及分子标记技术领域,特别涉及一种普通油茶SSR分子标记引物及标记方法和应用,本发明通过对普通油茶根系进行RNA提取,测序和组装,利用MISA搜索SSR位点,并设计相应引物,以油茶基因组DNA为材料,对设计的SSR引物进行验证,从设计的6738对引物中得到相应的引物,该引物表现出多态性并可以成功区分不同品种来源的油茶材料;为油茶分子标记辅助育种提供新的分子标记,可为今后开展遗传育种、基因组作图、基因定位和物种亲缘关系鉴别等研究提供新的思路。
Description
【技术领域】
本发明涉及分子标记技术领域,特别涉及一种普通油茶SSR分子标记引物及标记方法和应用。
【背景技术】
普通油茶是油茶类物种中种植面积最广,总产量最高的木本油料植物,常用于榨取高质量的食用茶油;此外,榨油剩余物可进一步加工,用作化工、纺织和农药等行业的原材料。由于其不饱和脂肪酸含量高达90%以上,茶油是一种优质食用油,已被联合国粮农组织作为健康型高级食用油进行重点推广。随着生活水平的提高,人民对食用油的要求也随之提高。茶油变得供不应求,难以满足人民的需求。增加茶油的产量的关键是提高油茶的产量。油茶数量虽多,然而低产林占绝大多数,因此,培育普通油茶高产新品种十分紧迫。分子育种技术相对于常规育种周期短,准确度高等优点。然分子育种需要大量的优质分子标记。SSR就是其中之一。
虽然目前已有关于利用油茶叶片,芽,花和种子等转录组开发了大量的SSR标记,但这些SSR分子标记是叶,芽,花和种子性状相关基因的功能标记。而还尚未有关于普通油茶根的转录组及SSR标记的开发,油茶根生长发育快,细胞分裂快,开展了普通油茶根发育转录组测序和SSR分子标记的开发和转移,将能为今后开展遗传育种、基因组作图、基因定位和物种亲缘关系鉴别等研究提供新的思路。
【发明内容】
鉴于上述内容,有必要提供一种普通油茶根的转录组及SSR标记的开发方法,该方法能为今后开展遗传育种、基因组作图、基因定位和物种亲缘关系鉴别等研究提供新的思路。
为达到上述目的,本发明所采用的技术方案是:
一种普通油茶SSR分子标记引物,所述SSR引物的序列如SEQ ID NO.1~90所示。
进一步的,所述SSR引物的序列如SEQ ID NO.1~12、SEQ ID NO.19~24、SEQ IDNO.27~28、SEQ ID NO.31~32、SEQ ID NO.39~40、SEQ ID NO.43~44、SEQ ID NO.47~56、SEQ ID NO.59~60、SEQ ID NO.63~64、SEQ ID NO.69~80、SEQ ID NO.83~86、SEQ IDNO.89~90所示。
本发明还提供了一种应用所述SSR分子标记引物进行分子标记的方法,该方法包括如下步骤:
(1)样品油茶根RNA提取:以组织培养过程中的油茶生根过程的油茶根部为材料,利用RNA提取试剂盒提取RNA,构建cDNA文库、测序;
(2)设计样品油茶的SSR引物:利用FastQC对步骤(1)测序出的RNA数据进行质量控制,构建油茶根的Unigene序列;利用MISA对Unigene进行SSR位点检索,获得并设计一系列SSR位点的引物;
(3)从步骤(2)的SSR引物中选择SSR引物用于对油茶样品进行分子标记;
(4)转移的样品油茶DNA提取:取不同品种的油茶样品嫩叶存于-20°冰箱中,用改良的CTAB法提取其基因组DNA,存于-20℃待用;
(5)SSR引物扩增:根据步骤(3)筛选的SSR引物,针对步骤(4)的样品油茶基因组DNA进行PCR扩增;反应结束后,在PCR管中加入6×Loading buffer 2μL,混合均匀,吸取2μL在8.0%聚丙烯酰胺凝胶上200V电压下电泳1.5h,再进行快速银染,显影,照相;
(6)油茶SSR引物遗传多样性分析:统计在普通油茶中无扩增产物、无多态和有多态三种情况的数量;进一步分析有扩增产物引物在不同油茶物种的转移情况;利用GenAlEx6.5估算多个油茶品种的等位基因数(Na)、有效等位基因数(Ne)、观测杂合度(Ho)、期望杂合度(He)、Shannon信息指数(I)。
进一步的,所述步骤(1)(2)的样品油茶为:岑软3号。
进一步的,所述步骤(4)转移的样品油茶为:金花茶3小叶、大叶金2、博白大果油茶、日本红山茶、小果油茶、南荣油茶、普通油茶、长林23号、长林4号、香花油茶、义安-2、宛田红花油茶、弄章实生、弄章01、官山01、鸿鸪01、那荡06、陆川大果油茶、鸿鸪08、鸿鸪23。
进一步的,所述步骤(5)的PCR扩增体系为:
用ddH2O补至总体积10μL;
PCR反应程序为:预变性94℃ 4min;变性94℃ 30sec,退火59℃ 30sec(Δ℃=1℃),延伸72℃ 45sec,9个循环;变性94℃ 30sec,退火55℃ 30sec,延伸72℃ 30sec,21个循环,72℃延伸10min,4℃保存。
本发明还提供一种所述的普通油茶SSR分子标记引物的应用,该引物用于检测不同油茶品种遗传多样性。
本发明具有如下有益效果:
本发明以油茶根系为材料,提取油茶根系的RNA并进行逆转录、测序、分析得到相应的SSR引物,油茶根生长发育快,细胞分裂快,对油茶根发育转录组测序和SSR分子标记的开发和转移,将能为今后开展遗传育种、基因组作图、基因定位和物种亲缘关系鉴别等研究提供新的引物和思路。
【附图说明】
图1是本发明实施例油茶生根过程转录组中SSR基序类型分布图;
图2是本发明实施例SSR重复单元占比最多基序的百分比图。
【具体实施方式】
为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂,下面结合附图对本发明的具体实施方式做详细的说明。在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明。但是本发明能够以很多不同于在此描述的其它方式来实施,本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似改进,因此本发明不受下面公开的具体实施的限制。
实施例:
一、实验方法:
1、样品油茶RNA提取方法:
1)转录组测序实验材料:实验油茶品种为由普通油茶良种“岑软3号”。
2)样本处理:以组织培养过程中“岑软3号”生根过程中的三个关键时间节点:插生根前为(CK组)、插生根后1天(T1组)、插生根后14天即[出现根点](T2组)、插生根后50天[根生长阶段](T3组),取得根部材料后,利用ddH2O冲洗干净琼脂糖后,立刻放入液氮中,待提取RNA。
3)提取测序方法:利用RNAiso for polysaccharide-rich Plant Tissue提取所有样本的RNA,并将CK,T1,T2和T3等量混合,构建cDNA文库,用于Illumina HiSeq2000测序。
2、SSR标记转移的实验材料及提取方法:
1)SSR标记转移的实验材料为如下18个品种:金花茶3小叶、大叶金2、博白大果油茶、日本红山茶、小果油茶、南荣油茶、普通油茶、长林23号、长林4号、香花油茶、义安-2、宛田红花油茶、弄章实生、弄章01、官山01、鸿鸪01、那荡06、陆川大果油茶、鸿鸪08、鸿鸪23。
2)SSR标记应用材料:取上述18个品种的嫩叶,利用改良的CTAB法提取其基因组DNA,存于-20℃待用。
3、数据分析:
利用FastQC对转录组数据进行质量控制,利用Trimmomatic过滤低质量序列,接头等得到Clean Data.再利用Trinity对clean data进行组装,得到转录组组装结果。在此基础上,利用MISA搜索SSR位点,并设计相应的SSR位点引物。
对转录组SSR标记进行特征分析,并分别从转录组开发的SSR中随机选择45对SSR标记引物(引物序列如表1所示),用于下一步的验证和应用。
表1普通油茶根转录组开发合成用于本实验的SSR引物
4、SSR引物扩增:根据步骤表1筛选的SSR引物,针对步骤3的18个样品油茶基因组DNA进行PCR扩增
PCR反应体系:模板DNA 1L,2.5mmolL-1dNTPs 1L,10×Buffer 1L,10mmolL-1上下游引物各0.4L,Taq聚合酶1.5U,用ddH2O补足到10L体系。
扩增反应程序:预变性94℃ 4min;变性94℃ 30sec,退火59℃ 30sec(Δ℃=1℃),延伸72℃ 45sec,9个循环;变性94℃ 30sec,退火55℃ 30sec,延伸72℃ 30sec,21个循环,72℃延伸10min,4℃保存。
反应结束后,在PCR管中加入6×Loading buffer 2μL,混合均匀,吸取2μL在8.0%聚丙烯酰胺凝胶上200V电压下电泳1.5h,再进行快速银染,显影,照相。
5、数据分析:
统计在普通油茶中无扩增产物、无多态和有多态三种情况的数量;进一步分析有扩增产物引物在不同油茶物种的转移情况。再利用GenAlEx 6.5估算遗传多样性参数(等位基因数目Na、有效等位基因数目Ne、观测杂合度Ho、期望杂合度He、Shannon信息指数I)。
二、结果与分析:
1、转录组测序结果和SSR特征分析:
利用Illumina Hiseq 2000平台测序,共产出4956567120nt数据。组装得到57121个Unigene,总长为42633606nt,N50为1174nt。利用MISA脚本在Unigene中搜索SSR位点,SSR位点的标准为1-12,2-6,3-5,4-5,5-4,6-4。总共检测到15902个SSR位点。不同SSR基序类型分布如图1所示:二碱基基序的类型数量最多为8976,其次为三碱基基序为4008,接着为单碱基基序数量为1927,六碱基基序(511),五碱基基序(346),最少为四碱基基序为134。
如图2所示,在检测到的SSR位点中,AG/CT的比例为最多(48.64%),其次为A/T(11.97%),第三位为AAG/CTT(6.18%)。
2、SSR标记的开发和转移:
本实验在SSR位点检测的基础上,设计了6738对,合成其中的45对引物用于亲缘物种的转移分析。其中10对引物无法扩增出产物,6对可以扩增出产物,但无多态;另外29对SSR为多态引物(具体结果见表2)。
表2 48对合成的SSR在亲缘物种中的转移情况
注:“+”表示能扩增出产物;“-”不能扩增出产物;“M”表示引物没有多态;“P”表示多态引物。
3、遗传多样性:
本实验对参与SSR转移分析的样本进行了遗传多样性分析。具体结果如表3所示:检测到样本的数目N的变化范围为4到18;有效等位基因数目Ne为1.14到5.79;Shannnon’s信息指数的变化范围为0.24到1.83。
表3油茶参试样本的遗传多样性
Locus | N | Na | Ne | I | Ho | He |
CoSSR1 | 15 | 5 | 3.81 | 1.43 | 1.00 | 0.74 |
CoSSR2 | 12 | 5 | 2.80 | 1.20 | 0.58 | 0.64 |
CoSSR3 | 15 | 7 | 4.21 | 1.65 | 0.60 | 0.76 |
CoSSR4 | 9 | 7 | 5.79 | 1.83 | 0.44 | 0.83 |
CoSSR5 | 17 | 3 | 1.61 | 0.68 | 0.47 | 0.38 |
CoSSR6 | 10 | 6 | 3.45 | 1.47 | 0.40 | 0.71 |
CoSSR10 | 18 | 2 | 1.80 | 0.64 | 0.67 | 0.44 |
CoSSR11 | 16 | 4 | 2.26 | 0.92 | 0.75 | 0.56 |
CoSSR12 | 17 | 3 | 2.25 | 0.91 | 0.76 | 0.56 |
CoSSR14 | 15 | 3 | 2.41 | 0.95 | 0.67 | 0.58 |
CoSSR16 | 15 | 2 | 1.14 | 0.24 | 0.00 | 0.12 |
CoSSR20 | 13 | 3 | 2.89 | 1.08 | 0.46 | 0.65 |
CoSSR22 | 14 | 4 | 2.47 | 1.08 | 0.57 | 0.59 |
CoSSR24 | 14 | 3 | 2.90 | 1.08 | 0.71 | 0.66 |
CoSSR25 | 14 | 4 | 2.14 | 0.99 | 0.50 | 0.53 |
CoSSR26 | 14 | 3 | 2.90 | 1.08 | 0.79 | 0.66 |
CoSSR27 | 7 | 5 | 4.26 | 1.51 | 0.14 | 0.77 |
CoSSR28 | 6 | 6 | 4.80 | 1.68 | 0.33 | 0.79 |
CoSSR30 | 14 | 3 | 2.56 | 1.00 | 0.79 | 0.61 |
CoSSR32 | 14 | 3 | 2.67 | 1.04 | 0.50 | 0.63 |
CoSSR35 | 9 | 5 | 3.12 | 1.35 | 0.67 | 0.68 |
CoSSR36 | 7 | 6 | 4.08 | 1.57 | 0.71 | 0.76 |
CoSSR37 | 10 | 5 | 4.35 | 1.54 | 0.20 | 0.77 |
CoSSR38 | 9 | 6 | 2.84 | 1.38 | 0.67 | 0.65 |
CoSSR39 | 9 | 6 | 3.95 | 1.54 | 0.56 | 0.75 |
CoSSR40 | 10 | 3 | 2.38 | 0.94 | 0.40 | 0.58 |
CoSSR42 | 10 | 3 | 2.25 | 0.94 | 0.40 | 0.56 |
CoSSR43 | 10 | 2 | 1.22 | 0.33 | 0.20 | 0.18 |
CoSSR45 | 4 | 2 | 1.28 | 0.38 | 0.25 | 0.22 |
注:N表示样本数量;Na表示等位基因数目;Ne表示有效等位基因数目;Ho表示观测杂合度;He表示期望杂合度;I表示Shannon信息指数。
综上所述,使用本申请得到的SSR引物,能对多个品种的油茶进行扩增标记,能为今后开展遗传育种、基因组作图、基因定位和物种亲缘关系鉴别等研究提供新思路。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式,其描述较为具体和详细,但并不能因此而理解为对本发明范围的限制。应当指出的是,对于本领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明构思的前提下,还可以做出若干变形和改进,这些都属于本发明的保护范围。因此,本发明的保护范围应以所附权利要求为准。
序列表
<110> 钦州学院
<120> 一种普通油茶SSR分子标记引物及标记方法和应用
<130> ZP19100147/QZX
<141> 2019-02-17
<160> 90
<170> SIPOSequenceListing 1.0
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<213> 人工序列(rengongxulie)
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<210> 35
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(rengongxulie)
<400> 35
agcagtgagg aagccgaata 20
<210> 36
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(rengongxulie)
<400> 36
aacacctcat gactgtcaaa tca 23
<210> 37
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(rengongxulie)
<400> 37
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(rengongxulie)
<400> 38
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<213> 人工序列(rengongxulie)
<400> 39
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<212> DNA
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<212> DNA
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<212> DNA
<213> 人工序列(rengongxulie)
<400> 62
ccctatgaat agaaatcaac caa 23
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tccaaaattc caaatcccaa 20
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tcccctcatt caatcttcca 20
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<400> 69
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(rengongxulie)
<400> 70
gcaggctgtc aacagaaaca 20
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(rengongxulie)
<400> 71
atctcgaacc tcttgcctca 20
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<213> 人工序列(rengongxulie)
<400> 73
ggatctgttg ggtggtgagt 20
<210> 74
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ttaattgatc ggctgggttc 20
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tatcgccatc tgttcatcca 20
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ccccttcctg ccctaataat 20
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ctccgagatc ctccacagag 20
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tctcggtctc tgtgatgacg 20
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<213> 人工序列(rengongxulie)
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gatacgaggg caatggagaa 20
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gtgctattgt tggttgtggg 20
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<213> 人工序列(rengongxulie)
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aagacagccc catttttgtg 20
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<400> 89
tcatggcgat taaagctgtg 20
<210> 90
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<212> DNA
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<400> 90
acggcatctg cctgtagttt 20
Claims (2)
1.一种普通油茶SSR分子标记引物组,其特征在于,所述SSR分子标记引物组的序列如SEQ ID NO.1~12、SEQ ID NO.19~24、SEQ ID NO.27~28、SEQ ID NO.31~32、SEQ IDNO.39~40、SEQ ID NO.43~44、SEQ ID NO.47~56、SEQ ID NO.59~60、SEQ ID NO.63~64、SEQ ID NO.69~80、SEQ ID NO.83~86、SEQ ID NO.89~90所示。
2.如权利要求1所述的普通油茶SSR分子标记引物组的应用,其特征在于:该引物用于检测不同油茶品种遗传多样性。
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