CN113267582B - 一种斯赤列指纹图谱的构建方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于中药药物分析技术领域，公开了一种斯赤列指纹图谱的构建方法，包括前处理、固相萃取、供试品溶液的制备及UPLC色谱测定等步骤。本发明提供斯赤列指纹图谱构建方法精密度、重复性及稳定性良好。本发明提供的方法所构建的指纹图谱可以反应不同产地和不同采收期的药材质量，为更加准确、全面地评价和控制斯赤列的质量提供了稳定可靠的质量控制方法。

Description

一种斯赤列指纹图谱的构建方法

技术领域

本发明属于民族药药物分析技术领域，具体涉及一种斯赤列指纹图谱的构建方法。

背景技术

斯赤列（Sambucus adnata Wall.）为忍冬科接骨木属植物，干燥地上部分或全草，又名血满草、接骨药、接骨丹、大血草等，主要分布于云南四川等地，具有抑制血管紧张素转换酶及抗炎、镇痛等生物活性，彝族等山区居民使用其治疗风湿痹痛等。

中药的药效物质基础是由多种活性成分构成，单一成分是不能显示出中医临床用药的整体疗效，因此，仅以中药部分活性成分的含量作为质量控制的指标是不足够的，难以保证中药的整体质量。中药指纹图谱能使中药材的质量控制由原有的单一成分含量测定上升到能通过色谱的整体面貌反映中药的整体组成与特征，能反应成分复杂的中药因种植地气候、地理特征、采摘时期等因素造成不同程度的中药化学组分浓度分布的波动性，是评价中药优劣、鉴别真伪、区分物质和确保其一致性和稳定性的有效方法，也是目前控制中药材质量的有效手段和重要技术。斯赤列现有的生药鉴别、显微鉴别、理化鉴别及HPLC法测定其熊果酸、齐墩果酸成分含量等相关质量控制研究尚不足以支撑其深入开发，仅对熊果酸、齐墩果酸两种成分进行定量分析，不能从整体上反应斯赤列的内在质量。目前，尚无斯赤列的指纹图谱。

发明内容

本发明的目的在于提供一种斯赤列指纹图谱的构建方法。

本发明的目的是这样实现的，包括前处理、固相萃取、供试品溶液的制备及UPLC色谱测定等步骤，具体为：

（1）前处理：斯赤列打成粗粉，取粗粉1.0 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密量取溶剂，料液比为1:20~1:30，称定重量，提取，放置至室温，用溶剂补足减失的重量，过滤，用20.0 mL溶剂洗涤滤渣，滤液回收至干；

（2）固相萃取：将前处理得到的样品加入5.0 mL水溶解得到药材水溶液，使用Sep-Pak-C₁₈固相萃取(SPE)小柱，①SPE小柱的预处理：上样前用甲醇活化SPE柱，然后用水替换滞留在柱中的甲醇，以使水溶液与柱中吸附剂表面有良好的接触，在样品加入前应保持湿润；②上样：加入药材水溶液，利用抽真空的方法使样品溶液进入SPE小柱吸附剂；③先淋洗，淋洗液为10%、20%、30%、50%、70%、90%、100%甲醇，除去极性大的杂质；④继续洗脱，洗脱液为70%、90%、100%甲醇；

（3）供试品溶液的制备：收集洗脱溶液，回收溶剂，残渣加甲醇定容至5 mL容量瓶中，以0.22 μm微孔滤膜滤过，即得供试品溶液；

（4）UPLC色谱测定：将供试品溶液进行色谱测定，色谱条件为：Waters AcquityBEH C18色谱柱（2.1×100 mm，1.7 μm），流速0.1~0.3 ml•min^-1，检测波长200~250 nm，柱温25~40°C，流动相乙腈(A)-0.1%磷酸溶液(B)进行梯度洗脱：

根据分析结果，构建斯赤列指纹图谱。

步骤（1）中的提取为用冷浸提取24h或超声提取15~45min或回流提取2 h；溶剂为甲醇、丙酮或水。

步骤（1）中的提取为用超声提取30 min。

步骤（1）中的溶剂为甲醇。

步骤（1）中的料液比为1:25。

步骤（2）中淋洗液为50%甲醇，洗脱液为100%甲醇。

步骤（4）中流速为0.2 ml•min^-1，检测波长为202 nm，柱温为35°C。

本发明优点：

本发明提供斯赤列指纹图谱构建方法精密度、重复性及稳定性良好。

本发明提供的方法所构建的指纹图谱可以反应不同产地和不同采收期的药材质量。

本发明为更加准确、全面地评价和控制斯赤列的质量提供了稳定可靠的质量控制方法。

附图说明

图1为斯赤列的共有模式图；

图2为21批不同产地和不同采收期斯赤列UPLC色谱峰匹配图；

图3为碎石图(a: 不同产地药材；b: 不同采收期药材)；

图4为第一主成分、第二主成分和第三主成分三维得分图(a: 不同产地药材样本；b：不同采收期药材样本)；

图5 为聚类分析树状图(a: 不同产地药材; b: 不同采收期药材)。

具体实施方式

下面对本发明作进一步的说明，但不以任何方式对本发明加以限制，基于本发明所作的任何变换，均属于本发明的保护范围。

本发明所述的斯赤列指纹图谱的构建方法，包括前处理、固相萃取、供试品溶液的制备及UPLC色谱测定等步骤，具体为：

（1）前处理：斯赤列打成粗粉，取粗粉1.0 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密量取溶剂，料液比为1:20~1:30，称定重量，提取，放置至室温，用溶剂补足减失的重量，过滤，用20.0 mL溶剂洗涤滤渣，滤液回收至干；

（2）固相萃取：将前处理得到的样品加入5.0 mL水溶解得到药材水溶液，使用Sep-Pak-C₁₈固相萃取(SPE)小柱，①SPE小柱的预处理：上样前用甲醇活化SPE柱，然后用水替换滞留在柱中的甲醇，以使水溶液与柱中吸附剂表面有良好的接触，在样品加入前应保持湿润；②上样：加入药材水溶液，利用抽真空的方法使样品溶液进入SPE小柱吸附剂；③先淋洗，淋洗液为10%、20%、30%、50%、70%、90%、100%甲醇，除去极性大的杂质；④继续洗脱，洗脱液为70%、90%、100%甲醇；

（3）供试品溶液的制备：收集洗脱溶液，回收溶剂，残渣加甲醇定容至5 mL容量瓶中，以0.22 μm微孔滤膜滤过，即得供试品溶液；

（4）UPLC色谱测定：将供试品溶液进行色谱测定，色谱条件为：Waters AcquityBEH C18色谱柱（2.1×100 mm，1.7 μm），流速0.1~0.3 ml•min^-1，检测波长200~250 nm，柱温25~40°C，流动相乙腈(A)-0.1%磷酸溶液(B)进行梯度洗脱：

根据分析结果，构建斯赤列指纹图谱。

步骤（1）中的提取为用冷浸提取24h或超声提取15~45min或回流提取2 h；溶剂为甲醇、丙酮或水。

步骤（1）中的提取为用超声提取30 min。

步骤（1）中的溶剂为甲醇。

步骤（1）中的料液比为1:25。

步骤（2）中淋洗液为50%甲醇，洗脱液为100%甲醇。

步骤（4）中流速为0.2 ml•min^-1，检测波长为202 nm，柱温为35°C。

色谱指纹图谱用于中药质量控制既然符合中药内含多种物质群的情况，又合乎目前大部分内含物质化学结构尚不清楚。斯赤列药材的化学成分复杂，以往研究仅以熊果酸、齐墩果酸为评价指标，具有一定的单一性和局限性。本发明首次建立斯赤列的指纹图谱，并结合相似度评价、主成分分析和聚类分析三种化学计量学方法，对不同产地和不同采收期药材进行综合评价，为斯赤列药材质量评价方法的建立提供新的模式。

实施例1

提取方法的单因素考察

斯赤列打成粗粉，取粗粉1.0 g.，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇溶液25.0 mL，精密称定，分别用冷浸提取24 h，超声提取30 min，回流提取2 h，放置至室温，用甲醇补足减失的重量，过滤，用20.0 mL甲醇洗涤滤渣，滤液回收至干，残渣加甲醇使溶解并定容至5 mL容量瓶中，用0.22 μm的微孔滤膜滤过，分别吸取10 μL进样。以UPLC色谱图中11个共有峰的峰面积为评价指标，进行综合评分，结果见表1。

表1 不同提取方法的综合评分结果

比较各样品溶液UPLC色谱图中各成分峰面积大小，常温下超声提取法较加热回流、冷浸提取法的提取效率高，超声提取的色谱峰较多，且操作简单，耗时短，易控制，误差小，因此选择超声提取法为提取方法。

实施例2

提取工艺正交试验

采用正交实验设计对斯赤列提取工艺进行优选。以溶剂类型(A)、提取时间(B)、料液比(C)为考察因素，每个因素选取3个水平，以斯赤列UPLC色谱图中11个共有峰峰面积为评价指标。正交试验因素与水平、因子安排见表2、3。

表2正交试验因素水平表

表3因子安排表

由于本次正交设计采用了多个指标成分进行分析，所以采用多指标综合评分法进行数据处理。以X_ij表示第i次试验第j 个指标的测定值（即X_ij表示正交试验的第i次试验的色谱图中第j个色谱峰峰面积)，首先以各指标的最大值作为参照，对同一指标各数据进行标准化处理，D_ij表示第j个指标下的第i个测定值的标准化数据。D_ij = X_ij /(X_j)max，其中i=1，2，…9； j = 1，2，…，16。再按各指标的重要程度和各组数据的相对标准偏差确定权重系数，F_j = E_j ×RSD/RSD_j，其中RSD为峰11的相对标准偏差，RSD_j为第j个指标的相对标准差，由于各指标的活性不是非常明确而且峰面积都较大，故认为都很重要，重要程度E_j均定为1。P_i = Σ( F_j × D_ij) /ΣF_j，计算所得的兼顾各项指标综合评分公式P _i值越大越好^[16-17]。L₉(3⁴)表及正交实验结果及分析见表4、5。

表4正交试验结果分析

表5综合评分P _i 方差分析表

由正交实验结果显示，在所选因素水平范围内，按多指标试验公式评分判定，R值的大小依次为A>B>C，说明影响药材提取工艺的因素依次A>B>C，即提取溶剂>提取时间>料液比；由直观分析结果可见，提取溶剂因素各水平影响大小顺序为A₁＞A₂＞A₃，提取时间因素各水平影响大小顺序为B₂＞B₁＞B₃，料液比因素各水平影响大小顺序为C₂＞C₃＞C₁。

由方差分析结果可见，因素A提取溶剂对实验结果影响显著(P<0.01)，因素B对实验结果影响其次，因素C对实验结果影响最小，同时综合考虑节省试验时间和节约试验能源，确定A₁B₂C₂为最佳提取工艺，即采用超声波提取法，加入25 ml甲醇溶液，提取30 min为最佳提取工艺。

实施例3

1.固相萃取的条件考察

使用Sep-Pak-C₁₈固相萃取(SPE)小柱，①SPE小柱的预处理：上样前用甲醇活化SPE柱，然后用水替换滞留在柱中的甲醇，以使水溶液与柱中吸附剂表面有良好的接触，在样品加入前应保持湿润；②上样：加入药材水溶液，利用抽真空的方法使样品溶液进入SPE小柱吸附剂；③先淋洗，除去极性大的杂质；④继续淋洗，收集洗脱溶液，回收溶剂，定容。

考察了步骤③中的淋洗液，分别用10%、20%、30%、50%、70%、90%、100%甲醇，发现50%甲醇能淋洗大部分极性较大的成分，而保留极性较小的成分，因此向SPE小柱中加入药材提取水溶液，先用50%甲醇溶剂除去大极性物质；另考察了步骤④中的淋洗液，70%、90%甲醇作为淋洗液与100%甲醇淋洗液所收集的供试品溶液UPLC色谱图对比，发现100%甲醇收集的供试品溶液色谱图中11个共有峰部分峰面积比70%、90%甲醇的高，说明70%、90%甲醇不能彻底淋洗吸附在SPE小柱上的小极性物质，而100%甲醇能完全并快速的淋洗，因此用100%甲醇作为淋洗液，收集100%甲醇洗脱溶液，回收溶剂，定容。

2.最佳固相萃取方法

使用Sep-Pak-C₁₈固相萃取(SPE)小柱(50 mg)，①SPE小柱的预处理：上样前用甲醇活化SPE柱，然后用水替换滞留在柱中的甲醇，以使水溶液与柱中吸附剂表面有良好的接触，在样品加入前应保持湿润；②上样：加入药材水溶液，利用抽真空的方法使样品溶液进入SPE小柱吸附剂；③用50%甲醇淋洗，除去极性大的杂质；④用100%甲醇淋洗，收集100%甲醇洗脱溶液，回收溶剂，定容。

实施例4

供试品溶液的制备条件

取斯赤列粗粉1.0 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密量取25.0 mL甲醇溶液，称定重量，超声提取30 min，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，续滤液回收溶剂，加入5.0 mL水溶解，用实施例3中的最佳固相萃取方法，收集100%甲醇洗脱部分，回收溶剂，残渣加甲醇定容至5 mL容量瓶中，以0.22 μm微孔滤膜滤过，即得。

实施例5

色谱条件

1 测定波长的选择

采用UPLC-PDA对供试品溶液进行色谱分析，对样品进行全波长检测，经对比发现，200~250 nm波长段内均出现较多色谱峰，202 nm时，具有较多的色谱峰峰数，色谱图主要色谱峰响应值高，基线平稳。因此以202 nm作为检测波长。

2 色谱柱的选择

对Waters Acquity BEH C18 1.7 μm (2.1×100 mm)、Shim-pack XR-ODS III1.6 μm (2.0 × 100 mm)、Zorbax SB-Aq (2.1×100 mm)三种色谱柱进行考察，通过在相同流动相和洗脱程序对同一样品进行分析时分离效果的对比，确定选用分离度良好、基线平稳、峰形对称的Waters Acquity BEH C18 色谱柱(2.1×100 mm，1.7 μm)。

3 柱温的选择

分别考察了25、30、35、40°C对分离效果的影响，最终选择谱图中色谱峰相对分离度较好的35°C作为柱温。

4 流动相及洗脱程序的选择

分别对乙腈(A)-酸水(B)、甲醇(A)-酸水(B)两种流动相系统进行考察，结果发现乙腈-水系统的分离效果比较好，同时选用乙腈梯度洗脱时的柱压较甲醇低。另外由于波长选定在202 nm，当流动相为甲醇(A)-酸水(B)时，基线出现向下漂移，因为在该波长下甲醇有吸收，因此选用乙腈(A)-酸水(B)，其中酸水考察了甲酸水、醋酸水、磷酸水，通过比较分析发现甲酸水和醋酸水由于含有羧基官能团，在250 nm波长及其以下会有吸收，因此选用乙腈-0.1%磷酸水为流动相系统进行梯度洗脱。通过不断优化梯度洗脱程序，最终确立了如表6所示洗脱程序。

5 流速的选择

考察流动相流速对色谱图的影响，增加流速可缩短保留时间，加快分析速度。本实验分别对0.1 mL•min^-1、0.2 mL•min^-1、0.3 mL•min^-1的流速进行考察，最终在综合考虑分离度和仪器耐压等因素下，选择0.2 mL•min^-1作为最终流速。

6 最佳色谱条件

Waters Acquity BEH C18色谱柱（2.1×100 mm，1.7 μm），流速0.2 ml•min^-1，检测波长202 nm，柱温35°C，流动相乙腈(A)-0.1%磷酸溶液(B)进行梯度洗脱，见表6。

表6 梯度洗脱程序

实施例6

精密度试验

按照实施例4的方法制备供试品溶液。按实施例5中的最佳色谱条件连续进样6次，测定记录色谱图。

以峰3为参比峰，考察各共有峰的相对保留时间和相对峰面积的一致性，结果(见表7、8)表明，各色谱峰相对保留时间的RSD为0.01~0.15%，表明精密度良好；各色谱峰相对峰面积的RSD为1.60~2.95%，表明该精密度良好。

表7精密度试验的共有峰相对保留时间

表8精密度试验的共有峰相对峰面积

实施例7

重复性试验

按照实施例4的方法制备供试品溶液。按实施例5中的最佳色谱条件进行测定，记录色谱图。以参照峰3为参比峰，计算各共有峰的相对保留时间和相对峰面积，结果（见表9、10）表明，各共有峰的相对保留时间的RSD为0.34~0.59%；各色谱峰相对峰面积的RSD为0.76~2.99 %，表明该方法的重复性良好。

表9重复性试验的共有峰相对保留时间

表10 重复性试验的共有峰相对峰面积

实施例8

稳定性试验

按照实施例4的方法制备供试品溶液。按实施例5中的最佳色谱条件，分别于0、2、4、6、8、10、12、24、48 h进行测定，记录色谱图，以参照峰11为参比峰，计算各共有峰的相对保留时间和相对峰面积，结果（见表11、12）表明，各共有峰的相对保留时间的RSD为0.07~0.83%；各色谱峰的相对峰面积RSD为2.07~4.89%；表明供试品溶液在48 h内稳定。

表11稳定性试验的共有峰相对保留时间

表12 稳定性试验的共有峰相对峰面积

实施例9

不同产地和不同采收期斯赤列的指纹图谱建立

将9个云南不同产地同一采收期和同一个产地12个不同采收期的斯赤列，分别按实施例4的方法制备供试品溶液，按实施例5中的最佳色谱条件进行测定，记录各UPLC色谱图。药材来源见表13。采用中国药典委员会“中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2004A版）”软件对20个样品的指纹图谱进行分析处理，以AIA(* CDF)格式导入软件，S1色谱图中色谱峰形好、分离度良好、基线平整，故设定S1为参照指纹图谱，为减小极端数据的影响，选择中位数法作为对照指纹图谱生成方法，“时间窗宽度”设为0.1，运用多点校正方法对色谱峰进行保留时间校正，进行全谱峰自动匹配，生成对照指纹图谱R，见图1，其中确定11个共有峰，并生成21批不同产地及不同采收期斯赤列指纹图谱的色谱峰匹配图，见图2。

表13 药材来源

实施例10

不同产地及同一产地不同采收期斯赤列的相似度评价

以斯赤列共有模式图谱图1为对照，对不同产地和不同采收期的斯赤列进行整体相似度评价，结果见表14。不同产地斯赤列指纹图谱的相似度均在0.8以上，其中S1的相似度最低，仅为0.817，直接观察可发现S1指纹图谱的色谱峰信息较少，且大多数共有峰的峰面积较小。另S2、S4、S8、S9的相似度也并不高，在0.8~0.9之间，而S3、S5、S6、S7的相似度均在0.9以上。观察指纹图谱11个共有峰峰面积可知，不同产地的斯赤列药材，因生长环境不同，其11个指标成分的含量有一定程度的差异。同一产地不同采收期斯赤列指纹图谱的相似度在0.901~0.987之间，相似度较好，可见同一产地化学成分差异不明显，但因采收期不同，11个指标成分的含量也有差异。

表14 斯赤列的指纹图谱相似度评价

实施例11

主成分分析

主成分分析(Principal Component Analysis，PCA)是采用降维的方法，把多个变量指标转化为几个综合指标，解释多个变量的方差和协方差结构，是光谱、色谱及其色谱质谱联用的数据分析常采用模式识别手段。运用SPSS19.0软件对各共有峰峰面积原始数据进行标准化处理后，分别对不同产地及不同采收期斯赤列指纹图谱的11个共有峰进行主成分分析，得到主成分相关矩阵的特征值及其方差贡献率，见表15、表16。表15中前3个主成分的累积方差贡献率达到85.94%，代表了不同产地斯赤列指纹图谱中11个分析变量的大部分信息内容；结合碎石图(图3a)，可知前3个主成分的特征值较大，连线较为陡峭，即前3个主成分对解释变量的贡献最大。本文以特征值λ>1为提取标准，并综合碎石图和方差贡献率分析，确定最优主成分数。结果表明前3个主成分的特征值>1，累积方差贡献率达到85.94%，确定主成分数3个；同样对采于大理州祥云县不同月份的12批斯赤列指纹图谱中的11个共有峰进行主成分分析，见表16，前4个主成分的特征值>1，累积方差贡献率达到81.84%；结合碎石图3b，表明前4个主成分对分析变量的贡献最大。

表15 不同产地斯赤列的特征值和方差贡献率

表16 不同采收期斯赤列的特征值和方差贡献率

主成分旋转载荷矩阵能反映各变量对主成分的贡献大小和方向。由表17可知，不同产地斯赤列指纹图谱中，第一主成分主要综合了峰1、3、4、7、8、11的信息，这几个峰对其贡献最大，在第一主成分上均呈正向分布；第二主成分主要综合了峰5、6的信息，在第二主成分上均呈正向分布；第三主成分主要综合了峰2、9、10的信息，其中峰2在第三主成分上呈负向分布，峰9、10呈正向分布。不同采收期斯赤列的主成分载荷矩阵，由表18可知，第一主成分主要综合了峰2、3、7、10的贡献最大，其中峰2在第一主成分上呈负向分布，其它峰均呈正向分布；第二主成分主要综合了峰1、6、8的信息，峰6在第二主成分上呈负向分布，其它峰均呈正向分布；第三主成分主要综合了峰5、9、11的信息，其中峰5在第三主成分上呈负向分布，其它呈正向分布；第四主成分主要综合了峰4，在第四主成分上呈正向分布。

表17 不同产地药材主成分载荷矩阵

Table 1-17 Component matrix of the plants in different growingregions

表18 不同采收期药材主成分载荷矩阵

Table 1-18 Component matrix of the plants in different collectingtime

对上述主成分载荷矩阵值进行计算，得到各批次样本的主成分综合得分和排序，结果见表19、20。综合排名越靠前，说明以此11个共有峰为指标成分，其药材质量越好。不同产地斯赤列主成分得分(表19)结果表明，综合得分较高的是S4(红河州开远县)和S9(昆明市禄劝县)，综合得分较低的是S1(曲靖市马龙县)和S5(玉溪市新平县)。以第一、第二、第三主成分得分为变量，做三维散点图，见图4a，其中S1、S2、S5和S8分布较近，说明曲靖市马龙县、玉溪市澄江县、新平县、昆明市呈贡区的斯赤列质量较为接近；S3、S6分布稍近，说明昆明市嵩明县和红河州红河县的斯赤列质量接近；而S4、S9分布近，说明红河州开远县和昆明市禄劝县的斯赤列质量接近；S7分布位置较为独立，产地为大理州祥云县的斯赤列与其他8个产地的质量有一定差异。

不同采收期斯赤列的主成分综合得分排序表(表20)中，综合得分较高的是T11、T12，综合得分较低的是T7、T8、T9、T10，相比较而言，在11月、12月采收斯赤列的质量相对较好，可作为最佳采收期的参考。由第一、第二、第三主成分为变量的主成分得分图(图4b)可知，T1、T2、T3、T4、T5、T6分布相近， T7、T8、T9、T10分布稍近，T11、T12分布相对独立，说明同一产地不同采收期的斯赤列1、2、3、4、5、6月份的质量相近，7、8、9、10月份的质量相近， 11、12月的质量和其它月份差别稍大。

表19 不同产地药材主成分得分和排序

表20 不同采收期药材主成分得分和排序

实施例12

聚类分析

聚类分析(Clustering analysis，CA)是根据实验数据内在的定性或定量关系，根据变量域之间的区别大小而逐步归类成群的方法，比较客观的反映了变量或区域之间的内在组合关系；CA是将研究对象关系更接近的合并为一类，着重区分类别内和类别间元素组成，明确分类界限，但不会对信息进行删减、不会区分元素重要性，类别间重要性是等同的。

为了验证主成分分析结果的可靠性及客观性，采用离差平方和法聚类，选取欧式距离平方和为度量标准，对9个不同产地和12个不同采收期的斯赤列分别进行系统聚类分析，结果见图5。从图5a中可以看出，当判别距离为15时，9批斯赤列药材分为2大类，一类包含S3、S6、S7、S4、S9，即以11个指标成分为分析变量时，昆明市嵩明县和禄劝县、红河州红河县和开远县、大理州祥云县聚为一类，且在得分图上均呈零散分布；另一类包含S1、S2、S5、S8，即曲靖市马龙县、玉溪市澄江县和新平县、昆明市呈贡区聚为一类；从图5b中可以看出，当判别距离为15时，12批产于大理州祥云县不同采收期的斯赤列药材分为2大类，Ⅰ类包括T7、T8、T9，Ⅱ类包括T1、T2、T3、T4、T5、T6、T10、T11、T12；即以11个指标成分为分析变量时，采收于7、8、9月的斯赤列质量相近，其余月份的斯赤列质量相近。结果表明即使是同一产地所产斯赤列药材，不同的采收时期质量也不尽相同，且聚类结果和主成分分析结果相似。

相似度分析、PCA和CA

从相似度分析结果可知，9批不同产地和12批同一产地不同采收期斯赤列指纹图谱的相似度均在0.8以上，其中仅有两批不同产地斯赤列的相似度小于0.85，说明不同产地的斯赤列，化学成分类型相似，但因生长环境不同，其11个指标成分的含量有一定程度的差异；不同采收期斯赤列的相似度均在0.9以上，相似度较好，说明不同采收期的斯赤列样品质量比较一致。在相似度评价的基础上，利用PCA和CA两种多元统计分析方法分别对云南同一采收期不同产地和同一产地不同采收期的斯赤列UPLC指纹图谱的11个共有峰进行分析。

从PCA结果可知，该统计分析方法将9个不同产地斯赤列指纹图谱中的11个特征变量降维至前三个主成分来代表斯赤列指纹图谱共有峰的大部分信息，由9份样品主成分得分图可知，S4(红河州开远县)和S9(昆明市禄劝县)两批样品质量较好，与其他产地斯赤列有明显区别，3D得分图结果与CA及相似度分析结果一致；同为红河州产于红河县的S6样品，其主成分综合得分排序第五，可见即便是相近产地，也有个别样品质量有较大差异；另PCA和CA结果均显示S2(玉溪市澄江县)、S5(玉溪市新平县)和S8(昆明市呈贡区)的斯赤列质量较为接近，这三个产地在地理分布上均属以昆明为中心的西南方向，说明斯赤列质量受地理分布位置的影响较大。

同一产地不同采收期斯赤列的PCA将斯赤列指纹图谱中的11个特征变量降维至用前四个主成分来代表指纹图谱大部分信息，其中综合得分较高的是T11、T12，PCA 3D主成分得分图和CA结果一致，1~6月份采收的斯赤列质量相近， 7~10月采收的样品质量接近，11、12月采收的斯赤列质量接近且相对较好。由于斯赤列属于地上部分入药，其茎木一般在秋冬两季采收最佳，其叶类在开花期或果实未成熟前采收最佳，因此研究不同产地斯赤列质量差异时，统一采于8月份开花期的斯赤列样品；但不同采收期的分析结果显示11、12月份的质量最佳，出现该现象的原因可能是因为在11、12月份冬季采收时，该植物叶已枯萎脱落，仅能采集到茎，因此导致其PCA和CA分析结果差异明显，说明采收部位的不一致，可能影响对其质量的评价和控制。

相似度分析、PCA和CA结果表明，不同产地和不同采收期的斯赤列化学成分类型存在一定差异，与药材本身内在质量有关，也因其地理位置相差较远，气候特点，生长环境等方面差别较大所致，说明产地和采收期是影响药材质量的重要因素。三种分析方法可以相互补充和印证，能体现不同产地及不同采收期斯赤列样品质量的差异性和一致性，说明通过本方法可综合全面的反映斯赤列的质量。

Claims (7)

1.一种斯赤列指纹图谱的构建方法，其特征在于包括前处理、固相萃取、供试品溶液的制备及UPLC色谱测定步骤，具体为：

（1）前处理：斯赤列打成粗粉，取粗粉1.0 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密量取甲醇，料液比为1:20~1:30，称定重量，超声提取，放置至室温，用甲醇补足减失的重量，过滤，用20.0 mL甲醇洗涤滤渣，滤液回收至干；

（2）固相萃取：将前处理得到的样品加入5.0 mL水溶解得到药材水溶液，使用Sep-Pak-C₁₈固相萃取小柱，①SPE小柱的预处理：上样前用甲醇活化SPE柱，然后用水替换滞留在柱中的甲醇，以使水溶液与柱中吸附剂表面有良好的接触，在样品加入前应保持湿润；②上样：加入药材水溶液，利用抽真空的方法使样品溶液进入SPE小柱吸附剂；③先淋洗，淋洗液为50%甲醇，除去极性大的杂质；④继续洗脱，洗脱液为100%甲醇；

（3）供试品溶液的制备：收集洗脱溶液，回收溶剂，残渣加甲醇定容至5 mL容量瓶中，以0.22 μm微孔滤膜滤过，即得供试品溶液；

（4）UPLC色谱测定：将供试品溶液进行色谱测定，色谱条件为：Waters Acquity BEHC18色谱柱2.1×100 mm，1.7 μm，流速0.1~0.3 ml•min^-1，检测波长200~250 nm，柱温25~40℃，流动相乙腈A- 0.1%磷酸溶液B进行梯度洗脱，洗脱程序为：

根据分析结果，构建斯赤列指纹图谱。

2.根据权利要求1所述的斯赤列指纹图谱的构建方法，其特征在于所述的步骤（1）中的超声提取时间为15~45min。

3.根据权利要求1所述的斯赤列指纹图谱的构建方法，其特征在于所述的步骤（1）中的提取为用超声提取30 min。

4.根据权利要求1所述的斯赤列指纹图谱的构建方法，其特征在于所述的步骤（1）中的料液比为1:25。

5.根据权利要求1所述的斯赤列指纹图谱的构建方法，其特征在于所述的步骤（4）中流速为0.2 ml•min^-1。

6.根据权利要求1所述的斯赤列指纹图谱的构建方法，其特征在于所述的步骤（4）中，检测波长为202 nm。

7.根据权利要求1所述的斯赤列指纹图谱的构建方法，其特征在于所述的步骤（4）中，柱温为35℃。

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