CN109374765B - 一种全自动在线spe-lc-ms/ms定量分析植物样品中内源性独脚金内酯的方法 - Google Patents

一种全自动在线spe-lc-ms/ms定量分析植物样品中内源性独脚金内酯的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种植物样品中内源性独角金内酯类化合物的定量检测方法。该方法是采用在线SPE‑LC‑MS/MS定量分析方法，包括以下步骤：1)对于植物样品进行预处理，得到处理后的样品；2)将步骤1)得到的处理后的样品用复溶溶剂溶解，得到溶解液；3)将溶解液进入在线SPE‑LC‑MS/MS系统进行检测，记录所述独脚金内酯和所述独脚金内酯的稳定同位素内标对应的峰面积，根据内标法计算得到所述植物样品中内源性独角金内酯的含量。该方法能够实现对植物内源的独脚金内酯进行准确绝对定量分析，并且简便快捷、选择性好、准确性高、灵敏度高，对研究独脚金内酯类化合物的生理功能及分子作用机理具有非常重要的意义。

Description

一种全自动在线SPE-LC-MS/MS定量分析植物样品中内源性独 脚金内酯的方法
技术领域
本发明属于生物技术及分析化学领域，具体涉及一种应用在线(On-line)SPE-LC-MS/MS技术，准确快速地定量分析植物样品中内源性独脚金内酯的方法。
背景技术
独角金内酯(Strigolactones，SLs)是2008年被鉴定的一类新型植物激素，它能在植物侧根的形成和生长、主根和根毛的伸长、种子萌发、下胚轴伸长及次生生长等生理过程中发挥重要作用。尤其是独脚金内酯能够在极低浓度下通过抑制侧芽的生长从而在株型的建成中发挥关键调控作用的特性，使得其近年来持续成为植物科学和农学研究领域的热点和前沿。独脚金内酯机理和功能的深入研究不仅对于作物品种的培育具有非常重要的作用，也与提升粮食的科学种植水平有重大关联性。中科院遗传发育所李家洋院士团队因“水稻高产优质性状形成的分子机理及品种设计”荣获2017年度国家自然科学一等奖，其研究团队建立的水稻分子设计育种的理论框架与技术体系，培育的基于“理想株型”的水稻新品种，和独脚金内酯的调控机理研究紧密相关。
SLs是一类倍半萜类内酯化合物，目前发现的SLs已经有十几种，已知的SLs化合物都由C、H、O三种元素组成，普遍具有四环(A,B,C,D)的骨架结构，D环对这些化合物的生物活性是必不可少的。在水稻材料中检测出的2’位差向异构的5-脱氧Strigol(2’-epi-5-deoxystrigol，epi-5DS)被认为是水稻材料中生理活性最高的一种SL(分子结构见式I)。与传统的植物激素相比，SLs在植物体内的生理浓度更低(低1-2个数量级)，含量往往在10-2ng/g，化学结构不稳定，容易降解，组织特异性分布强，因此其成分分析及定量检测一直是制约SLs分子作用机理深入研究的瓶颈。
Figure BDA0001848848480000011
早期针对SLs的定量分析方法主要是生物活性检测方法，该方法基于SLs能够促进寄生植物种子萌发和促进丛枝菌根真菌菌丝分枝生长的生理功能，而且这两种生理功能的作用浓度范围都很低。一些学者以丛枝共生真菌菌丝生长的情况或寄生植物种子萌发率为指标来衡量SLs的相对含量，这种检测方法能够在一定程度上反映样品中SLs的相对量，但方法的灵敏度远不能满足科学家们对于SLs定量检测的需求，现在基本仅作为SLs初步定性。由于较好的分离和检测性能，液相色谱技术被应用于SLs定量分析中。但是SLs并不具有大的共轭体系，这使得它们在紫外-可见光检测范围内的光吸收较弱，因此PDA检测的灵敏度较低。近年来，随着质谱技术的发展及接口技术的成熟，液相色谱与质谱联用逐渐成为SLs定量分析的最有力技术手段。质谱检测方法在定量分析方面有着不可比拟的优势，质谱分析过程中先将目标化合物离子化，然后以质量分析器将离子碎片按照质荷比(m/z)分开以进行检测。以多反应监测(MRM)模式进行检测能够在很大程度上排除杂质干扰、提高灵敏度，这对于样品量少、结构相似性高的SLs分析具有很大帮助。
对于超低含量的SLs来讲，建立一套高效的前处理方法来纯化和富集目标化合物是整套分析方法的关键之所在。目前用于植物激素提取纯化的主要手段是液液萃取和离线固相萃取(Off-line SPE)。离线SPE是一种基于色谱分析的样品前处理方法，通常包括五个步骤：(1)活化固相萃取柱；(2)预处理；(3)添加样品；(4)，除去杂质；(5)洗脱目标化合物。传统的离线SPE技术都需要人工控制，按照上述步骤一步一步进行，过程中间又必须进行溶剂挥发和重新定容等操作，需要投入大量的人力和时间成本。同时人为操作容易产生操作误差，整个过程难以平行控制，在结果的重现性方面也有很大的缺陷。另外，所处理的样品只有一小部分被取出进样分析，方法的检测灵敏度也受到很大的限制，极大地阻碍了独脚金内酯在植物育种机理方面的研究和应用。
发明内容
本发明的目的是提供一种快速、准确的更高通量和灵敏度的植物样品中内源性独角金内酯的定量检测方法。
本发明所提供的植物样品中内源性独角金内酯类化合物的定量检测方法，是采用在线(On-line)SPE-LC-MS/MS定量分析方法，包括以下步骤：
1)对于植物样品进行预处理，得到处理后的样品；
所述植物样品包括植物组织材料和/或植物培养液；
所述植物样品为植物组织材料，所述预处理的方法为处理a：将所述植物组织材料在液氮中研磨，准确称量研磨后的植物组织，加入提取溶剂和独脚金内酯的稳定同位素内标，混匀，进行提取，收集植物提取液，氮气吹干；
所述植物样品为植物培养液，所述预处理的方法为处理b：收集植物水培液，加入提取溶剂和独脚金内酯的稳定同位素内标，混匀，进行提取，静置或离心，取上层有机相，用氮气吹干；
所述植物组织材料和植物培养液中均含有独脚金内酯类化合物；
2)将步骤1)得到的吹干后的样品用复溶溶剂溶解，得到溶解液；
3)将步骤2)得到的溶解液进入在线SPE-LC-MS/MS系统进行检测，记录所述独脚金内酯和所述独脚金内酯的稳定同位素内标对应的峰面积，根据内标法计算得到所述植物样品中内源性独角金内酯的含量。
研究表明，独脚金内酯生理功能基本是通过植物根部将其分泌至生长环境中在根部组织周围发挥作用的，因此对SLs的检测材料基本包括两类：植物水培液和植物组织材料。因此，步骤1)中选择植物水培液或植物组织材料进行检测。
上述方法步骤1)中，所述提取溶剂为丙酮和/或乙酸乙酯，所述处理a中用于植物组织材料的提取溶剂优选为丙酮，所述处理b中用于植物培养液的提取溶剂优选为乙酸乙酯。
所述独脚金内酯类化合物为植物材料中独脚金内酯类化合物，具体可为epi-5DS或其结构类似物。
由于独脚金内酯类化合物主要从根组织中分泌，因此所述植物组织材料优选为植物根组织。
所述植物组织材料的用量为10-500mg,具体可为100mg,其与提取溶剂的用量比小于100mg：0.1mL，优选比例为100mg：(0.5-5)mL，具体可为100mg：1mL。
所述植物培养液的用量为10-200mL，其与提取溶剂的用量体积比可为1：10-10：1，具体可为2:1。
所述植物培养液具体可为植物水培培养液，以水稻为例，其制备方法如下：将萌发后的水稻用木村培养液(用量为10-200mL/株)正常培养1周后的水稻，更换缺P的木村培养液，进行缺P处理，3周后，收集培养液。
所述独脚金内酯的稳定同位素内标为2H6-epi-5DS，其加入量为0.1-5ng/100mL植物培养液或0.1-5ng/100mg植物组织。
所述提取步骤中，提取方法可为超声、震荡、离心、低温过夜提取等常规方法，对于植物组织材料优选低温过夜提取，对于植物培养液优选震荡或者超声提取。
所述步骤2)中的复溶溶剂既要很好溶解目标化合物，又要符合后面在线固相萃取的设计方案，可为不同比例的甲醇、乙腈、水溶剂，优选体积比为1:1的乙腈和水的混合溶剂。所述复溶溶剂的用量为0.01-1mL。
所述步骤3)中，所述在线SPE-LC-MS/MS系统具体为：SymbiosisTM Pharma在线固相萃取-液相色谱系统(荷兰Spark Holland公司)串联Quattro Premier XE三重四极杆质谱仪(美国Waters公司)。以及与其原理和使用相似的在线SPE系统也均适用于本发明。
所述在线SPE-LC-MS/MS系统中在线固相萃取条件如下：
SPE小柱可采用反相材料或者硅胶材料的填料，本发明优选反相材料的SPE小柱，具体可为C18填料的SPE小柱，更具体可为HysphereTM C18HD SPE柱。
需要对在线SPE的淋洗溶剂的种类和用量进行选择和优化，根据C18的保留机理和独脚金内酯的理化性质，淋洗的溶剂可选择为下述至少一种：水、甲醇和乙腈。该步骤的目的是尽可能除去极性较大的吸附在SPE柱上的杂质而保留住目标化合物。所述的淋洗具体为用水和体积比为30％-60％的甲醇/水溶液(更具体可为30％-40％的甲醇/水溶液)依次淋洗，淋洗速度为0.5mL/min。
洗脱步骤的目的是将目标化合物洗脱下来，而且能较少的洗下杂质。洗脱的溶剂可选甲醇或者乙腈，优选为甲醇。
所述在线SPE-LC-MS/MS系统中在LC-MS色谱条件如下：
色谱柱：XBridgeTM BEH C18，3.0mm×75mm，3.5um；
柱温：30℃；
流动相由A、B组成，其中A为体积分数0.05％的乙酸水溶液，B为体积分数0.05％的乙酸乙腈溶液；
洗脱方式为梯度洗脱，所述梯度洗脱方式具体如下：
Figure BDA0001848848480000041
所述的“％”为体积百分比。
所述在线SPE-LC-MS/MS系统中在MS质谱条件如下：
电离模式：ESI源正离子模式；扫描方式：MRM；
离子源参数为：毛细管电压为2-5kV；源温100-150℃；脱溶剂气温度300-500℃；脱溶剂气流速500-1000L/h；锥孔气流30-150L/h；倍增器电压400-800V；碰撞气(氩气)0.1-0.3mL/min。
本发明所述的植物样品包括：水稻、油菜、玉米、番茄、烟叶等植物的根、茎、叶、花、花粉等组织及其水培的培养液。
本发明建立了一种全自动的在线纯化、分离、分析的独脚金内酯定量分析方法，该方法能够实现对植物内源的独脚金内酯进行准确绝对定量分析，并且简便快捷、选择性好、准确性高、灵敏度高，对研究独脚金内酯类化合物的生理功能及分子作用机理具有非常重要的意义。该方法建立的优势具体体现在：(1)在数分钟内即可完成从固相萃取纯化到分离检测的全过程，在分离检测第一个样品的同时，可平行进行下一个样品的SPE前处理，实际上样品SPE时间可忽略不计，与通常离线方法需要3-5小时相比，样品通量大大提高。(2)样品材料固相萃取后可全量上柱，同时萃取小柱还有浓缩的功能，所以还可提高质谱系统的检测灵敏度，只需要较少的样品即可达到同样的灵敏度，能够解决珍贵的转基因植物材料很难大量取材的问题。(3)以前需要由人工进行的许多样品前处理步骤可以省略，降低了人工前处理造成的错误和误差，结果稳定性将会大大提高，而且SPE步骤和分离检测条件可打印成电子报告，便于数据溯源。
附图说明
图1为水稻培养液中独脚金内酯epi-5D及其稳定同位素内标(2H6-epi-5DS)的检测谱图。
图2为水稻野生型和突变体的水培液中epi-5DS的含量分析结果，其中，野生型水稻为Shiokari背景，d14是不敏感型突变体，d10是合成缺陷突变体，n＝3，n.d.为notdetected。
图3为水稻野生型和突变体根组织中epi-5DS的含量分析结果，野生型水稻为Shiokari背景，d14是不敏感型突变体，d10是合成缺陷突变体，n＝3，n.d.为not detected。
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明进行说明，但本发明并不局限于此，凡在本发明的精神和原则之内所做的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
实施例1、水稻水培培养液中独脚金内酯的含量测定
1)材料培养及独脚金内酯的提取：
萌发的水稻野生型(wildtype)Shiokari用木村培养液(用量100mL/株)正常培养1周后的水稻，更换缺P的木村培养液，进行缺P处理，3周后，收集培养液20mL，加入稳定同位素内标2H6-epi-5DS 500pg，加入8mL乙酸乙酯，涡旋震荡5min，离心5min 2000rpm，取上层有机相，氮气吹干后，加入300μL 50％(v/v)乙腈/水复溶，进入全自动在线SPE-LC-MS/MS进行纯化、分离和检测。
2)在线SPE流程：
用于在线SPE系统的HysphereTM C18HD SPE柱购自Spark Holland公司。HysphereTM C18HD SPE柱经1mL甲醇和1mL水活化，流速均为5mL/min。进样步骤由自动进样器完成，温度控制为4℃。45μL样品由0.4mL水以0.5mL/min上样。之后分别依次由1mL水和1mL 30％(v/v)甲醇/水以5mL/min的速度淋洗，淋洗后在左侧完成上述过程的SPE柱被机械臂转移到右侧。使用甲醇进行洗脱，洗脱时间为3min 20s，流速为0.15mL/min。
3)液相方法及质谱条件：
液相色谱分离是在Waters公司(Massachusetts,USA)的XBridgeTM BEH C18色谱柱(3.0mm×75mm,2.5μm particle size)上完成。流动相与梯度条件见表1，柱温设置为30℃。在ESI源正离子模式下使用多重反应监测(MRM)模式检测，离子源参数为：毛细管电压为3.3kV；源温120℃；脱溶剂气温度400℃；脱溶剂气流速800L/h；锥孔气流50L/h；倍增器电压650V；碰撞气(氩气)0.18mL/min。由10ng/mL的epi-5DS标准品，分别确定它们的母离子和子离子，并优化相应的锥孔电压和碰撞能，锥孔电压与母离子的灵敏度有关，碰撞能与母离子碎裂成子离子的丰度相关。epi-5DS和2H6-epi-5DS选择响应相对较高的331.1>216.2和337.2>221.0作为定量MRM离子通道。结果如附图1所示，可以非常好的检测到epi-5DS和2H6-epi-5DS，能够准确定量分析水稻培养液中的epi-5DS，而且只使用15mL即可准确定量。
表1用于分析检测的液相方法
Figure BDA0001848848480000061
实施例2、实施例1检测方法的方法学参数考察
按照实施例1的步骤进行操作，考察检测方法的方法学参数。
分别配置浓度为0.01、0.05、0.1、0.5、1、5、10、50ng/mLepi-5DS溶液，加入等量2ng/mL 2H6-epi-5DS，按照实施例1的步骤进行检测，结果表明，epi-5DS的峰面积与一定量的内标峰面积的比值与样品浓度呈现良好的线性关系，线性回归方程的相关系数平方(R2)在0.999以上；该方法对epi-5DS的检测限LOD(S/N＝3)为0.003ng/mL，定量限LOQ(S/N＝10)为0.01ng/mL。在水稻缺磷水培液中分析的epi-5DS为根的分泌物，SL的定量方法日内及日间精密度均在15％以下。考察水培液样品的定量方法对独脚金内脂的回收率epi-5DS的回收率范围接近80％。基质效应是样品中被分析物以外的组分，常对分析物的分析有显著干扰，并影响分析结果的准确性，这些影响和干扰被称为基质效应。对epi-5DS的基质效应考察发现，对水培液中的epi-5DS存在离子抑制效应为20％左右。具体方法学参数如表2所示，从以上结果可以看出，本发明的定量检测方法的准确度高，稳定性好。该方法10分钟即可完成样品的纯化、分离和定量检测，检测通量比之前大幅度提高。
表2在线SPE-LC-MS/MS分析独脚金内酯定量方法的方法学考察
Figure BDA0001848848480000071
实施例3、不同的遗传背景的水稻材料水培液中独脚金内酯的检测
实验采用的水稻材料为Shiokari背景的野生型(Wildtype)及d10和d14突变体。按照实施例1的步骤进行操作，分别检测以上3种水稻材料中的独脚金内酯含量。测得结果如图3所示，d14的水培液分泌量为0.418±0.020ng/mL(n＝3)，Shiokari的分泌量为0.039±0.002ng/mL(n＝3)。d14的分泌量是Shiokari的10倍左右，d10根的水培液中没有检测到epi-5DS。d14突变体是一种矮化突变体，是SLs的不敏感型突变体，因此SL会在植物体内累积，水培液中epi-5DS的分泌量也应高于野生型epi-5DS的分泌量，d10突变体是SLs的合成缺陷突变体，因此SL的合成量相对于野生型会大大减少。得到的结果与水稻材料的遗传学背景一致，说明了本发明方法的准确性。
实施例4、不同遗传背景水稻材料根组织中独脚金内酯含量的测定
实验采用的水稻材料为Shiokari背景的野生型(wildtype)及d10和d14突变体。水稻野生型用木村培养液正常培养1周后的水稻，更换缺P的木村培养液，进行缺P处理，3周后，取水稻的根组织。水稻组织材料在液氮中收集与研磨。取约200mg植物组织，加入稳定同位素内标2H6-epi-5DS 500pg，用2mL丙酮-20℃过夜提取。植物提取液4℃15000rpm离心收集上清液，氮吹吹干复溶于50％乙腈/水中，由在线SPE-LC-MS/MS系统分析。在线纯化、分离和检测的条件同实施例1。测得的Shiokari根组织内源epi-5DS含量为1.56±0.08ng/g，d14根组织中含量为16.86±0.60ng/g(n＝3)，在d10中没有检测到epi-5DS。三种材料中，d14最高，野生型Shiokari次之，d10未检测到，与三种材料遗传学背景一致，也进一步说明了该方法的有效性。该方法在100mg(鲜重)样品中就能很好的定量植物材料中的独脚金内酯，与已有的检测方法比，检测灵敏度大大提高。

Claims (7)

1.一种植物样品中内源性独角金内酯类化合物的定量检测方法，是采用在线SPE-LC-MS/MS定量分析方法进行测定，包括以下步骤：
1)对于植物样品进行预处理，得到处理后的样品；
所述植物样品包括植物组织材料和/或植物培养液；
所述植物样品为植物组织材料，所述预处理的方法为处理a：将所述植物组织材料在液氮中研磨，准确称量研磨后的植物组织，加入提取溶剂和独脚金内酯的稳定同位素内标，混匀，进行提取，收集植物提取液，氮气吹干；
所述植物样品为植物培养液，所述预处理的方法为处理b：收集植物培养液，加入提取溶剂和独脚金内酯的稳定同位素内标，混匀，进行提取，收集有机相，用氮气吹干；
所述植物组织材料和植物培养液中均含有独脚金内酯类化合物；
2)将步骤1)得到的处理后的样品用复溶溶剂溶解，得到溶解液；
3)将步骤2)得到的溶解液进入在线SPE-LC-MS/MS系统进行检测，记录所述独脚金内酯和所述独脚金内酯的稳定同位素内标对应的峰面积，根据内标法计算得到所述植物样品中内源性独角金内酯的含量；
所述独脚金内酯类化合物为epi-5DS；
所述步骤1)中，所述处理a中用于植物组织材料的提取溶剂为丙酮，所述处理b中用于植物培养液的提取溶剂为乙酸乙酯；
所述植物组织材料的用量为10-500mg，其与提取溶剂的用量比为100mg：(0.5-5)mL；
所述植物培养液的用量为10-200mL，其与提取溶剂的用量体积比为1：10-10：1；
所述独脚金内酯的稳定同位素内标为2H6-epi-5DS，其加入量为0.1-5ng/100mL植物培养液或0.1-5ng/100mg植物组织；
所述步骤2)中的复溶溶剂选自体积比为1:1的乙腈和水的混合溶剂；所述复溶溶剂的用量为0.01-1mL；
所述步骤3)中，所述在线SPE-LC-MS/MS系统中在线固相萃取条件如下：
SPE柱采用C18填料的SPE柱；
淋洗的溶剂用水和体积比为30％-60％的甲醇/水溶液依次淋洗，淋洗速度为0.2-0.7mL/min；
洗脱的溶剂选自甲醇；
所述在线SPE-LC-MS/MS系统中在LC-MS色谱条件如下：
色谱柱：XBridgeTMBEH C18，3.0mm×75mm，3.5um；
柱温：30℃；
流动相由A、B组成，其中A为体积分数0.05％的乙酸水溶液，B为体积分数0.05％的乙酸乙腈溶液；
洗脱方式为梯度洗脱，所述梯度洗脱方式具体如下：
Figure FDA0002467209450000021
所述的“％”为体积百分比。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述植物组织材料为植物根组织。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述步骤1)中，所述提取的方法选自下述至少一种：超声提取、震荡提取、离心、低温过夜提取。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述步骤1)中，对于植物组织材料选择低温过夜提取，对于植物培养液选择震荡或者超声提取。
5.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述步骤3)中，所述在线SPE-LC-MS/MS系统中在线固相萃取条件如下：
SPE柱为HysphereTMC18 HD SPE柱；
淋洗速度为0.5mL/min。
6.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述在线SPE-LC-MS/MS系统中MS质谱条件如下：
电离模式：ESI源正离子模式；扫描方式：MRM；
离子源参数为：毛细管电压为2-5kV；源温100-150℃；脱溶剂气温度300-500℃；脱溶剂气流速500-1000L/h；锥孔气流30-150L/h；倍增器电压400-800V；碰撞气为氩气，其流速为0.1-0.3mL/min。
7.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述植物样品为任意植物的根、茎、叶、花、花粉及其水培的培养液。
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