CN111057714A - 一种用于测定植物激素独脚金内酯分布的表达载体及其制备方法与应用 - Google Patents

一种用于测定植物激素独脚金内酯分布的表达载体及其制备方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种用于测定植物激素独脚金内酯分布的表达载体及其制备方法与应用，所述表达载体以pEGAD为骨架并含有以下组件：35S强启动子、SL受体复合体的下游抑制因子基因SMAX1‑like7、荧光标记基因Venus和核定位序列NLS；该表达载体通过转入植物中得到转基因植株，通过共聚焦检测转基因植株中的荧光强度分析SL的分布。SL是一种新型植物激素，目前报道的测量方法非常有限；本发明的表达载体，在不同浓度SL的环境下，表现出不同的荧光强度，通过对荧光强度的变化及定量分析来实现对SL的精准测定。

Description

一种用于测定植物激素独脚金内酯分布的表达载体及其制备 方法与应用
技术领域
本发明涉及生物检测方法技术邻域，具体涉及一种用于测定植物激素独脚金内酯分布的表达载体及其制备方法与应用。
背景技术
植物激素通过调节细胞的生长发育来调节种子萌发、形态建成、成熟衰老和死亡等过程，越来越多的植物激素被发现和研究，独脚金内酯(SL，Strigolactone)就是其中一种。独脚金内酯是一类类胡萝卜素的植物次级代谢产物，也是最近几年发现并且研究火热的一种新型植物激素，对植物生长发育以及植物“绿色革命”非常大的意义和价值。独脚金内酯是一类倍半萜烯化合物，其骨架都包含1个ABC三元环和一个完全相同的D环；独脚金内酯是多种植物激素的统称，包括独角金醇、高粱内酯、列当醇和人工合成的类似物GR24、GR6、GR7等植物激素；其中，高粱内酯的结构式如下：
Figure BDA0002348943300000011
SL广泛存在于单子叶和双子叶植物以及一些藻类中，可以抑制植物分枝，控制中胚轴延长，还可以通过抑制侧根形成和刺激根毛伸长来调节跟的发育，以及具有刺激寄生植物种子萌发的作用。由于SL能够产生多种生理作用参与植物生长发育调节，因此，对植物体内SL的测定具有十分重要的意义。然而，目前对于SL的测定需要对植物进行提取分离后通过LC-MS进行分离产物的测定，并没有对于植物体内SL的直接测定方法；由于SL的种类和衍生物数目比较大，使得对其直接测定成为一个非常困难且有意义的技术。
发明内容
本发明旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明提出一种表达载体，能够用于测定植物激素独脚金内酯分布。
本发明还提出上述表达载体的制备方法。
本发明还提出上述表达载体在测定植物激素独脚金内酯分布的方法中的应用。
根据本发明的第一方面实施例的一种用于测定植物激素独脚金内酯分布的表达载体，所述表达载体含有以下组件：35S强启动子、SMAX1-like7、Venus和NLS；所述组件的连接方式为35S-SMAX1-like7-Venus-NLS；所述SMAX1-like7的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
根据本发明的第一方面实施例的表达载体，至少具有如下有益效果：本发明所述的表达载体中的SMAX1-like7(基因)表达的SMAX1-like7蛋白是SL受体复合体的下游抑制因子，在植物体内表达的带有Venus荧光基团的SMAX1-like7蛋白能够表征植物体内SL的含量，通过荧光信号即可测定植物中SL的分布情况，为植物体内SL的直接测定提供了一个有效的工具，从而实现活体植物体内SL的测定；表达载体中的35S强启动子能够启动其他基因(即下游SMAX1-like7)的过量表达；将标记的荧光蛋白置换成Venus，这使得该系统检测起来更灵敏和快速。
根据本发明的一些实施例，：所述表达载体的原始骨架为pEGAD；作为优选的，所述pEGAD切除了GFP。
根据本发明的第二方面实施例的制备方法，包括以下步骤：
S1、采用pEGAD为原始质粒，酶切去除GFP，得到pEGAD载体骨架；
S2、在所述pEGAD载体骨架中连入Venus，得到Venus-pEGAD载体骨架；
S3、在所述Venus-pEGAD载体骨架的Venus后端连入NLS，得到Venus-NLS-pEGAD载体骨架；
S4、在所述Venus-NLS-pEGAD载体骨架的Venus前端连入SMAX1-like7即得。
根据本发明的第二方面实施例的制备方法，至少具有如下有益效果：本发明所述的制备方法简单高效，能够制备出高质量的检测SL分布的表达载体。
根据本发明的一些实施例，所述步骤S1中的酶切为采用Age1和EcoR1进行双酶切。
根据本发明的一些实施例，所述连入Venus包括以下步骤：设计含酶切位点Age1和EcoR1的引物扩增得到Venus片段；采用Spe1和EcoR1双酶切Venus片段后与所述pEGAD载体骨架连接。
根据本发明的一些实施例，所述连入NLS包括以下步骤：设计含酶切位点Sma1和Xho1引物扩增得到NLS片段；对所述NLS片段和Venus-pEGAD载体骨架分别进行Sma1和Xho1双酶切后连接。
根据本发明的一些实施例，所述连入SMAX1-like7包括以下步骤：设计含酶切位点Age1和Spe1引物扩增得到SMAX1-like7片段；对所述SMAX1-like7片段和Venus-NLS-pEGAD载体骨架分别进行Age1和Spe1双酶切后连接。
根据本发明的第三方面的实施例的应用，包括以下步骤：
S01、转基因植株的制备：将所述表达载体转入植株中得到转基因植株；
S02、独脚金内酯的测定：通过所述转基因植株中的荧光强度分析SL的分布和含量。
根据本发明的第三方面实施例的应用，至少具有如下有益效果：本发明所述的表达载体用于测定植物中的独脚金内酯能够防止传统萃取工艺中植物激素的损失及降解，具有实时和准确的优点；能够实现活体植物体内SL的检测，有利于对植物中SL作用机制的研究；使用共聚焦显微镜能够观察和测定到每一个细胞的荧光强度，进而检测单个组织细胞中的SL含量，实现植物体内SL分布的追踪和定位。
根据本发明的一些实施例，所述转基因植物的制备包括以下步骤：将所述表达载体电击转化到农杆菌中；转化后的农杆菌进行活化后对需测定的抽苔期的植物进行浸染；浸染后的植物进行收种后进行抗性筛选即得；作为优选的，所述农杆菌的型号为EHA105。由于pEGAD载体中含有卡那霉素(Kan)筛选标记，因此，使用卡那霉素进行抗性筛选。
根据本发明的一些实施例，所述独脚金内酯的测定包括以下步骤：利用共聚焦显微镜观察所述转基因植株的荧光强度，根据荧光强弱得出独脚金内酯在植株中的分布情况；采用显微镜操作软件对荧光强度进行数据分析，进而测定独脚金内酯的含量。
作为优选的，所述独脚金内酯的测定的具体步骤为：
S001、采用已知浓度的GR24处理转基因植株，建立荧光强度与GR24的数量关系；
S002、根据建立得到的数量关系对植物中SL分布进行测定。
更优选的，所述荧光强度与GR24的数量关系的建立方法包括以下步骤：利用共聚焦显微镜观察所述转基因植株的荧光强度，采用显微镜操作软件对荧光强度进行初步定量；采用一定系列浓度的GR24处理转基因植物，在一定系列时间点对荧光强度进行定量，根据不同浓度的GR24、处理时间和荧光强度建立对应关系。
本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。
附图说明
图1为本发明实施例1中构建的表达载体示意图；
图2为本发明实施例1中pEGAD原始载体示意图。
具体实施方式
为详细说明本发明的技术内容、所实现目的及效果，以下结合实施方式并配合附图予以说明。
试剂：pEGAD空载来自本实验室，高保真酶、内切酶和连接酶均购自Thermo公司，6-BA，SilwetL-77均购自Sigma公司，GR24，BASTA购自生工生物工程股份有限公司，其它试剂均为分析纯试剂，实验用水均为双蒸水。
仪器：DK-S24型电热恒温水浴锅购自上海森信实验仪器有限公司，FV1000激光共聚焦显微镜购自OLYMPUS公司，GZX-300光照培养箱购自AISITE公司，AB204-S电子天平购自Metter Toledo公司。
本发明的实施例1为：一种用于测定植物激素独脚金内酯分布的表达载体，包括以下步骤：
1、原始质粒提取：
在无菌操作下将得到的pEGAD工程菌接种到含50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，37℃，220rpm培养12h，收集菌体，提取质粒。
2、GFP位点的切除：
质粒浓度保证在0.2～1μg/μL，采用50μL的酶切体系对质粒进行双酶切，酶切位点为Spe1和EcoR1；37℃反应2h后(跑胶，切胶回收，加入30μL ddH2O)，收集酶切条带，4℃保存备用，所得条带为pEGAD载体骨架。
3、连入Venus：
设计含酶切位点Spe1和EcoR1的引物(Venus-F-Spe1和Venus-R-EcoR1)扩增得到Venus片段；采用50μL的酶切体系对扩增片段进行双酶切，37℃反应2h后跑胶，切胶回收，加入30μL ddH20洗脱，得到回收产物；回收产物与上述pEGAD载体骨架采用10μL连接体系进行黏性末端连接，得到Venus-pEGAD载体骨架。
4、连入NLS：
设计含酶切位点Sma1和Xho1的引物(NLS-F-Sma1和NLS-R-Xho1)扩增得到NLS片段；采用50μL的酶切体系对扩增片段进行双酶切，37℃反应2h后跑胶，切胶回收，加入30μLddH20洗脱，得到回收产物；将上述Venus-pEGAD载体骨架采用Sma1和Xho1双酶切，回收产物与酶切后所得载体采用10μL连接体系进行黏性末端连接，得到Venus-NLS-pEGAD载体骨架；NLS连接在Venus基因的前端。
5、连入SMAX1-like7：
设计含酶切位点Age1和Spe1的引物(SMAX1-like7-F-Age1和SMAX1-like7-R-Age1)扩增得到SMAX1-like7片段；采用50μL的酶切体系对扩增片段进行双酶切，37℃反应2h后跑胶，切胶回收，加入30μL ddH20洗脱，得到回收产物；将上述Venus-NLS-pEGAD载体骨架采用Age1，Spe1双酶切，回收产物与酶切后所得载体采用10μL连接体系进行黏性末端连接，即得表达载体SMAX1-like7-Venus-NLS-pEGAD；SMAX1-like7连接在Venus基因的后端。SMAX1-like7的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
构建的表达载体可以转入大肠杆菌中进行扩繁或保存在-80℃备用。
上述使用的引物序列如下表1所示：
表1：引物表
Figure BDA0002348943300000061
实施例1构建的表达载体如图1所示，表达载体中重要组件的连接方式为：35S-SMAX1-like7-Venus-NLS；其中，35S为pEGAD载体中的35S强启动子，SMAX1-like7为表达SMAX1-like7蛋白的基因，Venus为荧光筛选标记基因，NLS为核定位序列；图2为pEGAD原始载体的示意图。
该表达载体的工作原理为：基于SL信号途径中，SL受体蛋白D14接受SL的信号，激活下游一系列生理反应，从而泛素化标记其下游阻遏蛋白SMAX1-like7，使其被泛素化降解。表达载体通过在植物体内表达带有Venus荧光标记的SMAX1-like7的阻遏蛋白，在SL存在的条件下，能够泛素化降解SMAX1-like7，使得蛋白上的荧光淬灭，因此，当细胞中的SL越多，Venus荧光减弱，通过这一途径可以检测细胞中的SL含量。SL的类似物GR24能在SL信号途径中发挥与之相同的作用，本发明采用GR24处理转入该系统的拟南芥植物，建立一定的数量关系。
该表达载体以pEGAD为基本表达骨架，pEGAD上含有35S启动子，35S启动子可以在双子叶植物中启动其下游基因表达，将SMAX1-like7融合入35S启动子后端表达，再加入NLS核定位序列，使得构建的载体能入核后行使其功能；由于GFP的稳定和荧光强度存在缺陷，本发明进一步将标记的荧光蛋白置换成Venus，这使得该系统检测起来更灵敏和快速。
本发明的实施例二为：表达载体在测定植物激素独脚金内酯分布的方法中的应用，包括以下步骤：
1、表达载体在拟南芥植株中的转化及筛选：
将实施例1构建得到的表达载体转入农杆菌EHA105中，28℃，220rpm小摇活化12h，1:100接种到200mL培养基中继续培养10h，收集后用浸染液(1/2MS中含44M 6-BA，0.05％SilwetL-77，30％蔗糖)重悬，调OD600到0.5，利用滴入法浸染3次后获得比较高的转化率。收种后，春化播种到50g/mL除草剂BASTA的1/2MS板子上。
2、转基因拟南芥植株中SL分布的测定：
将表达载体转化成功的拟南芥植株放在共聚焦显微镜下观测其不同组织部位的荧光强度，能够看到单个细胞的荧光强度，系列时间内对其荧光强度进行定量分析。计算得到荧光强度在1h内变化大小，根据上述所得数量关系计算观测部位的SL分布的数值。
3、Venus荧光强度与SL浓度的关系的建立：
将系列浓度的GR24处理转化成功的转基因拟南芥植株，在共聚焦显微镜的观测下对系列时间点的荧光强度进行定量分析，根据不同浓度的GR24、处理时间和荧光强度建立对应关系。
建立系列的SL浓度与系列时间处理下Venus荧光强度的关系是基于以下特点：SL的类似物GR24在化学结构上具有高度相似性，且在SL信号途径中能发挥相似的功能。
本发明解决了目前在SL测定方法上的空白，而且能在拟南芥植株体内完成对SL的实时测定；能够较好的满足SL测定的需要，对植物不同部位的SL进行测定，为后续在植物体内检测SL提供了一定的基础依据。
本发明具有以下的优点：
(1)能够实现拟南芥活体对植物激素的检测，可以防止传统萃取工艺中植物激素的损失及降解，且更实时，准确；
(2)通过共聚焦方法可以观察和测定到每一个细胞的荧光强度，可以对单个细胞进行定量测定。
以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书及附图内容所作的等同变换，或直接或间接运用在相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。
序列表
<110> 湖南农业大学
<120> 一种用于测定植物激素独脚金内酯分布的表达载体及其制备方法与应用
<160> 7
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 3009
<212> DNA
<213> 拟南芥(Arabidopsis thaliana)
<400> 1
atgccgacac cagtaaccac ggcgagacaa tgtttaacgg aagaaacagc gcgtgcatta 60
gacgacgcag tctccgtcgc gcgtcgtcga agccacgcac aaacgacgtc acttcacgcc 120
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tttcaaggga tggtggctct accgcagaat ccgccacacc aacctggttt atcagtcaaa 1680
atctcaaagc caaaacatac tgaggatctc tcaagttcaa caacgaactc gcctttgagc 1740
tttgttacaa cagatttagg gttgggaaca atctacgcat cgaagaacca agaaccaagc 1800
acaccagtat cagttgaaag gagagacttt gaggtgatca aagagaaaca attgttgtca 1860
gcttcgagat actgcaaaga tttcaagtct ctcagggaac tactctctcg aaaagtcggt 1920
tttcagaacg aagctgtgaa tgcgattagc gaaattgttt gtggatacag agatgagtcc 1980
aggagaagaa acaaccacgt agcaaccaca agtaatgttt ggcttgctct tcttggacct 2040
gataaagccg ggaagaagaa agtagcatta gctcttgctg aagtcttctg tggtggacaa 2100
gacaacttca tctgtgtgga tttcaagtca caagacagtc ttgacgatag attcagaggg 2160
aaaacagttg ttgattacat tgctggcgaa gtggcgagac gtgcggattc tgttgttttc 2220
atcgaaaacg tggaaaaggc cgagttccct gatcagatca gattgtctga ggctatgaga 2280
actggaaaac tccgtgactc gcatgggaga gagatcagta tgaaaaatgt tatagttgtt 2340
gctactattt ctggaagtga taaagccagt gattgtcatg ttcttgaaga accagtcaaa 2400
tactccgagg aaagagttct caatgccaaa aactggacac ttcagataaa actagcagac 2460
acttcaaatg ttaacaagaa tggtcccaat aagagaagac aggaggaggc agaaacagag 2520
gtgacagagc ttcgagccct taagtctcag cgttcgtttc ttgatctaaa tcttcctgtg 2580
gatgagattg aagcaaacga agacgaagcg tatacaatgt cggagaacac agaagcttgg 2640
cttgaggatt ttgtggaaca agtagatggg aaagtgacgt tcaagcttat tgactttgat 2700
gagttagcaa aaaacataaa aaggaatatt ctttcgctat ttcatctgtc ttttggacct 2760
gaaacacatc tagagatcga aaacgatgtg atccttaaga ttcttgctgc tttaagatgg 2820
tcatcagatg aagagaaaac atttgatcag tggctgcaaa ctgttcttgc tccaagcttt 2880
gctaaagcga gacaaaagtg tgttcccgct gctccttttt ctgtgaaact tgttgcctct 2940
agagagtctc cggctgaaga ggagactaca gggatacaac agtttccggc gagagtcgaa 3000
gtgatctga 3009
<210> 2
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gactagtatg gtgagcaagg gcgaggagc 29
<210> 3
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
cggaattcct tgtacagctc gtccatgc 28
<210> 4
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
ccccgggtac tagggactgg ggtgtgc 27
<210> 5
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
cctcgaggta gccttcgagc atggcg 26
<210> 6
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
cctaccgatg ccgacaccag taaccac 27
<210> 7
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
gactagtgat cacttcgact ctcgccg 27

Claims (10)

1.一种用于测定植物激素独脚金内酯分布的表达载体，其特征在于：所述表达载体含有以下组件：35S强启动子、SMAX1-like7、Venus和NLS；所述组件的连接方式为35S-SMAX1-like7-Venus-NLS；所述SMAX1-like7的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.根据权利要求1所述的表达载体，其特征在于：所述表达载体的原始骨架为pEGAD；作为优选的，所述pEGAD切除了GFP。
3.根据权利要求1或2所述的表达载体的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
S1、采用pEGAD为原始质粒，酶切去除GFP，得到pEGAD载体骨架；
S2、在所述pEGAD载体骨架中连入Venus，得到Venus-pEGAD载体骨架；
S3、在所述Venus-pEGAD载体骨架的Venus后端连入NLS，得到Venus-NLS-pEGAD载体骨架；
S4、在所述Venus-NLS-pEGAD载体骨架的Venus前端连入SMAX1-like7即得。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于：所述步骤S1中的酶切为采用Age1和EcoR1进行双酶切。
5.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于：所述连入Venus包括以下步骤：
设计含酶切位点Spe1和EcoR1的引物扩增得到Venus片段；
采用Spe1和EcoR1双酶切Venus片段后与所述pEGAD载体骨架连接。
6.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于：所述连入NLS包括以下步骤：
设计含酶切位点Sma1和Xho1引物扩增得到NLS片段；
对所述NLS片段和Venus-pEGAD载体骨架分别进行Sma1和Xho1双酶切后连接。
7.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于：所述连入SMAX1-like7包括以下步骤：
设计含酶切位点Age1和Spe1引物扩增得到SMAX1-like7片段；
对所述SMAX1-like7片段和Venus-NLS-pEGAD载体骨架分别进行Age1和Spe1双酶切后连接。
8.根据权利要求1或2所述的表达载体在测定植物激素独脚金内酯分布的方法中的应用，其特征在于：包括以下步骤：
S01、转基因植株的制备：将所述表达载体转入植物中得到转基因植株；
S02、独脚金内酯的测定：通过所述转基因植株中的荧光强度分析SL的分布和含量。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述转基因植株的制备包括以下步骤：将所述表达载体电击转化到农杆菌中；转化后的农杆菌进行活化后对需测定的抽苔期的植株进行浸染；浸染后的植株收种后进行抗性筛选即得。
10.根据权利要求8所述的应用，其特征在于：所述独脚金内酯的测定包括以下步骤：利用共聚焦显微镜观察所述转基因植株的荧光强度，根据荧光强弱得出独脚金内酯在植株中的分布情况；采用显微镜操作软件对荧光强度进行数据分析，进而测定独脚金内酯的含量。
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