CN114487200A - 采用植物水培技术筛查和定量扑草净代谢物的质谱检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种采用植物水培技术筛查和定量扑草净代谢物的质谱检测方法，属于农药残留分析技术领域。本发明利用含氯自来水水培的植物根部充分吸收扑草净后，结合高分辨质谱法进行定性和定量分析，可以得到清晰的各种代谢物色谱峰，便于定性；根分泌物样品中的扑草净及代谢物经过常温贮存，通过暴露于水体中余氯、根系微生物、光照和植物体内酶的代谢等降解/转化作用下产生的种类繁多高浓度的代谢物便于定量；通过本发明能轻松锁定环境中各种存在形式的扑草净代谢物，并识别优势代谢物；本发明适用于环境中扑草净结构类似污染物如甲硫基‑S三嗪类除草剂等代谢物的筛查和定量。
Description
技术领域
本发明涉及农药残留分析技术领域。具体涉及一种基于植物水培技术筛查和定量分析扑草净代谢物的质谱检测方法。
背景技术
扑草净(prometryn)是一种选择内吸传导型三嗪类除草剂，其化学结构为 2,4-双(异丙基氨基)-6-甲硫基-s-三嗪，在我国农业生产和水产养殖中应用广泛。农业上主要用于高粱、玉米、芹菜、棉花等作物中防除一年生阔叶杂草和禾本科杂草，在水产养殖业作为环境改良剂，用于清除有害藻类和水草。扑草净虽属急性致死毒性低和无潜在致癌性的除草剂，但作为可疑的环境内分沁干扰物对机体的内分泌干扰作用不可忽视。扑草净对人类和动物确切的作用机制未知，可能影响了机体内三羧酸循环并抑制氧化磷酸化作用。由于大面积及不合理使用，扑草净通过吸附迁移及食物链等造成了生态环境和相关产品中的残留。国内外研究发现，扑草净在环境中频繁检出，在众多农药风险排名中居首远高于可接受的生态风险值，其长期暴露可能已经对动物的生殖发育和环境的生态种群衰退产生了重大的不良影响。欧盟已于2004年1月全面禁止扑草净作为农药进行销售和使用。
扑草净在水体、土壤和动植物体内形成了数量广泛、种类繁多、降解代谢不完全的复杂中间产物，多数化合物的三氮苯环最终不裂解。三嗪类除草剂R1 取代基为氯、甲硫基和甲氧基时分别称津、净和通类。扑草净、莠去津和特丁通等结构类似物在环境中的降解途径通常是R1基被取代或者侧链烷基部分或完全损失，平行或先后形成不同侧链的共同混合物直到松开所有的侧链形成最终降解产物三聚氰酸一酰胺或三聚氰酸等。如扑草净脱异丙基、莠灭净脱乙基的代谢产物均为去异丙胺基莠灭净；莠去津在超纯水中光解的羟基降解产物为三聚氰酸二酰胺和2-羟基脱乙基阿特拉津；莠灭净在大鼠、哺乳期山羊和产蛋鸡中形成脱烷基代谢物去异丙胺基莠灭净和双去异丙胺基莠灭净，虽然扑草净在生物体和环境中的多数代谢降解物的毒性降低了，但是某些中间产物如扑草净亚砜的毒性却大大增加；一些代谢物如扑灭通和莠灭净等毒性与扑草净相当或更高，又如降解产物三聚氰酸会造成肾组织损伤。最终使人类暴露于自然界诸多复杂除草剂代谢降解物的健康和环境风险中，但是由于对代谢物的了解不充分影响了对其进一步开展毒性评估和风险监测。
目前对多数扑草净代谢物的研究也只是基于定性阶段，定量研究尚没有报导，所以需要明确优势代谢物，以利于开展环境和产品中扑草净代谢物的检测。
发明内容
本发明的目的是提供一种质谱的检测方法，可以有效筛查和定量检测环境中扑草净代谢物的残留量。
本发明的主要原理为，扑草净通过植物根部吸收，经植物体内酶的代谢并由根系传导到水培溶液中，在和水体中余氯的氧化反应，根系微生物，光照等降解/转化作用下产生了种类繁多高浓度的代谢物，样品基质简单干扰少，通过本发明能轻松锁定溶液样品中各种存在形式的扑草净代谢物，并识别优势代谢物；该方法适用于环境中扑草净结构类似污染物如甲硫基-S三嗪类除草剂等代谢物的筛查和定量。
一种基于植物水培技术筛查和定量扑草净代谢物的质谱方法，该方法包括如下步骤:
(1)样品预处理：采用作物芹菜，在含有扑草净的水溶液中培养,水溶液浓度为每升中含有10-50mg，经过24-96小时后，清洗植物根部，并采用芹菜转移到无扑草净的水中静置2-4天根部释放，得到根分泌溶液样品；
所述芹菜为5-7叶期芹菜,生长在用400-800mL水配制含初始扑草净浓度为 10-50ppm的1L水培玻璃器皿中，培养密度为4-7株芹菜；经24-96小时根部吸收试验后用去离子水将健康芹菜根部冲洗干净，转移到第2个无扑草净的 400-800mL水水培玻璃器皿中进行第1次96小时根部释放试验；将芹菜根部清洗干净并避免物理损伤，再次将植株转移到第3个无扑草净的装有400-800mL 新鲜自来水的玻璃瓶中进行第2次96小时根部释放试验，以此类推分别得到第 1、2、3、4、5次根分泌物样品；不同根释放次数的差别在于扑草净及代谢物含量和比例不同；
所述水为自来水，含有余氯以Cl2计为0.3-1.0mg/L。
(2)将以上根分泌溶液样品在自然光照常温好氧环境条件下放置15-30天，保存条件为光周期为16小时/8小时(白天/黑夜)，温度范围在18-25℃，湿度不受控；得到经降解转化后的各种代谢物。
(3)定性分析：将步骤(1)和(2)所得根分泌物样品提取分离。所得根分泌物样品5-10mL，以1mL/min的速度加载到预处理后的十八烷基键合硅胶固相萃取柱中，用5-10mL纯水洗涤，并在真空下完全干燥，吸附的化合物用甲醇10-20mL 洗脱，将洗脱液在氮吹条件下干燥至干，然后用1.0mL甲醇重新溶解，涡旋振荡15s，通过0.22μm膜过滤，稀释1-20倍，得到定性分析样品；
所述的十八烷基键合硅胶固相萃取柱，SPEC18固相萃取柱，使用前用5-10 mL甲醇和5-10mL纯水进行预淋洗处理。
(4)标准溶液配制：选择扑草净和代谢物标准品用甲醇稀释成系列浓度的混合溶液，建立标准曲线。
(5)定量分析：将步骤(2)所得根分泌物样品使用体积比1：9的乙腈和水混合溶液稀释1-10倍，然后通过0.22μm膜过滤进行定量分析；
(6)质谱分析：所述(3)和(4)步骤中样品，采用高分辨质谱，对样品中的扑草净及代谢物以正离子模式进行检测，采用的色谱柱为十八烷基键合硅胶柱，采用的流动相为乙腈-甲酸-水溶液，梯度洗脱；质谱条件为，以正离子模式进行检测；质谱条件为，全扫描范围为m/z 50-600，从色谱图上通过精确质量数初步进行筛选，如果样品中发现可疑精确质量数和代谢类似物其理论质量数在10ppm 误差范围内，则将此化合物母离子的质量数编辑在仪器方法文件的可疑代谢物目标列表中，当检测到目标物且这些代谢物的强度达到阈值，就可以从目标列表中选择母离子在可变的碰撞能量获得二级质谱碎片离子；或在平行反应监测模式下将输入到目标物列表的可疑化合物母离子打碎，再次检查是否生成了二级碎片，然后进行化合物定性鉴定，及定量计算。
高分辨质谱仪为美国热电公司的UHPLC/ESI Q-Exactive Orbitrap质谱仪，所述质谱条件如下：鞘气和辅助N2流量分别为40和10L/min，在3.5kv喷雾电压下实现了电分离，HESI的加热温度为350，毛细管温度为320℃，S-Lens RF 值为50；采用UHPLC/ESI Q-Exactive Orbitrap MS高分辨质谱仪的Full MS-SIM 扫描模式、MS/dd-MS2模式和PRM模式(平行反应监测)从芹菜根部分泌溶液中搜索扑草净及其代谢物并通过[M+H]+和MS2二级质谱碎片离子进行定性鉴定。
使用Xcalibur V2.1在Qual Browser软件中分析数据以进行化合物定性鉴定，Quan Browser软件分析数据以进行化合物定量处理。
采用的色谱柱为十八烷基键合硅胶柱，Accucore aQ C18；所述色谱柱规格为150mm×2.1mm×2.6μm；
所述色谱条件如下：梯度洗脱条件为：流动相溶液A和B分别为含有0.10％甲酸水和乙腈，用3％乙腈(B)梯度洗脱2.0分钟，在12分钟内线性增加至97％并持续1.0分钟，包括重新平衡色谱柱在内的总运行时间为18分钟；色谱柱温度30℃，流速为0.30mL/min，进样量为5.0μL；
本发明基于植物水培技术建立了一种准确筛查和定量扑草净代谢物的技术方法，植物吸收扑草净后，可从根分泌物样品的总离子流色谱图中清晰地得到各种代谢物峰，根据扑草净相关代谢产物特定结构片段中的共性和产物离子裂解规律，结合文献中已知代谢物和代谢途径的研究进行质谱解析，准确识别出 12种扑草净代谢物，分别为2-羟基-扑灭津，去异丙胺基莠灭净，扑灭通，扑草净亚砜，扑草净砜，双去异丙胺基莠灭净，2-羟基脱乙基阿特拉津，三聚氰酸二酰胺，扑草净亚砜同分异构体，N,N'-双(异丙基氨基)-s-三嗪-2,4-二胺，莠灭净， N-异丙基氨基-s-三嗪-2,4-二胺，并将扑草净及前9种代谢物进行定量分析。
扑草净代谢物其主要来源于根部分泌的扑草净和新鲜自来水水培溶液中氯生成硫氧化消毒副产物扑草净亚砜，并经光降解和根际微生物等作用下进一步转化的结果，也来源于扑草净在植物体内的代谢及传导；根分泌物样品基质成分简单，这一发明解决了环境中代谢物含量低及复杂基质干扰引发的定性和定量困难，可扩展此方法的原理，筛查并定量其他结构类似物质如甲硫基-S三嗪类等除草剂在环境中各种转化形式的优势代谢物。本发明主要选用自来水，经多地选择自来水试验，本发明都适用，此外，其他含有氯Cl2范围为0.3-1.0mg/L 的水体，也应适用于本发明。
本发明对根分泌溶液中扑草净代谢物进行了长期的转化反应，得到若干个优势代谢物，根分泌物长期放置的目的是为了定量根分泌物样品中最终稳定存在的扑草净各代谢物含量及模拟确定水体中扑草净优势代谢物。
扑草净在各种水体中的最终命运相同，从而轻松锁定了环境中各种存在形式的扑草净代谢物，最后识别出的优势代谢物分别是扑草净亚砜，2-羟基-扑灭津、2-羟基脱乙基阿特拉津和去异丙胺基莠灭净，并给出了这些代谢物的定量范围。
相比于现有技术，本发明的有益效果为定性优势明显，代谢物峰简洁直观，故筛查结果更加准确可信，可以实现传统方法不能达到的全面筛选污染物代谢物的能力，对评估水体中的扑草净和代谢物对人体健康风险的影响及掌握其它类似结构污染物在环境中代谢途径及潜在优势代谢物的定量有重大意义。本发明尤其适用的作物为芹菜。
附图说明
图1A和B分别是水培芹菜根分泌溶液中扑草净亚砜及异构体质谱图及碎片解析：UHPLC/ESI Q-Exactive Orbitrap质谱仪采用full MS/dd-MS2模式获得；
图2不同96小时根分泌物中扑草净及代谢物百分比图；
图3自来水水培芹菜根分泌物中总离子流色谱图：A：96小时根分泌物； B：30天根分泌物；1.扑草净2.扑草净亚砜3.扑灭通4.扑草净亚砜异构体5. 去异丙胺基莠灭净6.2-羟基-扑灭津；
图4不同水培芹菜根分泌溶液分别经A:453天和B:161天贮存下降解/转化作用后各代谢物的含量；
图5扑草净在根分泌溶液环境中的降解/转化途径；
图6芹菜和白菜采用去离子水添加培养液的水培方式下根分泌溶液中扑草净和扑草净亚砜动态浓度；
图7水培芹菜和白菜采用去离子水添加培养液的水培方式下根分泌溶液经长期贮存降解/转化作用后扑草净各代谢物含量；
图8自来水和去离子水中扑草净经24小时和30天明暗处贮存代谢物生成及转化。
具体实施方式
下面结合具体的实施对本发明做进一步的阐述和说明，以使相关领域技术人员更加清楚地理解本发明，本发明不限于以下实施例。
实施例1
样品前预处理：
(1)5-7叶期芹菜生长在用400mL新鲜自来水(取自中国大连市区的饮用水系统，平均含有余氯以Cl2计为0.558mg/L)配制含初始扑草净浓度为50ppm的 1L水培玻璃器皿中。水培密度为4株芹菜；经72小时吸收试验后用去离子水将健康芹菜根部冲洗干净，转移到第2个无扑草净的400mL新鲜自来水水培玻璃器皿中进行第1次96小时根部释放试验；将芹菜根部清洗干净并避免物理损伤，再次将植株转移到第3个无扑草净的装有400mL新鲜自来水的玻璃瓶中进行第2次96小时根部释放试验，以此类推分别得到第1、2、3、4、5次根分泌物样品；不同根释放次数的差别在于扑草净及代谢物含量和比例不同；
(2)将以上根分泌溶液样品在自然光照常温环境条件下放置30天；保存条件为光周期为16小时/8小时(白天/黑夜)，温度18℃，湿度不受控；得到经降解转化后的优势代谢物。
(3)定性分析：将步骤(1)和(2)所得根分泌物样品提取分离。取10mL根分泌物样品以1mL/min的速度加载到SPEC18固相萃取柱中(柱事先用5mL甲醇和5mL纯水进行预淋洗处理)，用5mL纯水洗涤，并在真空下完全干燥，吸附的化合物用10mL甲醇洗脱，将洗脱液在氮吹条件下干燥至干，然后用1mL甲醇重新溶解，涡旋振荡15s，稀释1-20倍，通过0.22μm膜过滤至液相玻璃进样瓶中进行定性分析；
Sep-Pak Vac C18 SPE固相萃取柱(500mg,6mL)为Waters公司生产。
(4)定量分析：将步骤(2)中所得根分泌物样品使用体积比1：9的乙腈和水混合溶液将水样稀释10-20倍，然后通过0.22μm膜过滤进行定量分析；
实施例2
样品前预处理：
(1)4-5叶期芹菜生长在600mL自来水，自来水中含有余氯以Cl2计为0.3mg/L，配制在含初始扑草净浓度为10ppm的1L水培玻璃器皿中，水培密度为5株芹菜；经24小时吸收试验后用去离子水将健康芹菜根部冲洗干净，转移到第2个无扑草净的200mL自来水(自来水中含有余氯以Cl2计为0.3mg/L)玻璃器皿中进行第1次96小时根部释放试验，将芹菜根部清洗干净并避免物理损伤，再次将植株转移到第3个无扑草净的装有200mL自来水(自来水中含有余氯以Cl2计为 0.3mg/L)的玻璃瓶中进行第2次96小时根部释放试验，以此类推分别得到第1、 2、3、4、5次根分泌物样品；不同根释放次数的差别在于扑草净及代谢物含量和比例不同；
(2)将以上根分泌溶液样品在自然光照常温环境条件下放置15天，保存条件为光周期为16小时/8小时(白天/黑夜)，温度范围在25℃，湿度不受控；得到经降解转化后的优势代谢物。
(3)定性分析：将步骤(1)和(2)所得根分泌物样品提取分离。取8mL根分泌物样品以1mL/min的速度加载到SPEC18固相萃取柱中(柱事先用8mL甲醇和 8mL纯水进行预淋洗处理)，用8mL纯水洗涤，并在真空下完全干燥，吸附的化合物用20mL甲醇洗脱，将洗脱液在氮吹条件下干燥至干，然后用1mL甲醇重新溶解，涡旋振荡15s，稀释1-5倍，通过0.22μm膜过滤至液相玻璃进样瓶中进行定性分析；
Bond Elut C18固相萃取柱(500mg,6mL)，为安捷伦公司生产；
(4)定量分析：将步骤(2)中所得根分泌物样品使用体积比1：9的乙腈和水混合溶液将水样稀释5倍，然后通过0.22μm膜过滤进行定量分析；
实施例3
样品前预处理：
(1)5-7叶期芹菜生长在800mL自来水，含有余氯以Cl2计为1.0mg/L，配制含初始扑草净浓度为30ppm的1L水培玻璃器皿中，水培密度为7株芹菜；经 48小时吸收试验后用去离子水将健康芹菜根部冲洗干净，转移到第2个无扑草净的800mL自来水(自来水中含有余氯以Cl2计为1.0mg/L)水培玻璃器皿中进行第1次96小时根部释放试验；将芹菜根部清洗干净并避免物理损伤，再次将植株转移到第3个无扑草净的装有800mL自来水(自来水中含有余氯以Cl2计为1.0mg/L)的玻璃瓶中进行第2次96小时根部释放试验，以此类推分别得到第1、2、3、4、5次根分泌物样品；不同根释放次数的差别在于扑草净及代谢物含量和比例不同；
(2)将以上根分泌溶液样品在自然光照常温环境条件下放置20天，保存条件为光周期为16小时/8小时(白天/黑夜)，温度范围在22℃，湿度不受控；得到经降解转化后的优势代谢物。
(3)定性分析：将步骤(1)和(2)所得根分泌物样品提取分离。取5mL根分泌物样品以1mL/min的速度加载到SPEC18固相萃取柱中(柱事先用10mL甲醇和 10mL纯水进行预淋洗处理)，用10mL纯水洗涤，并在真空下完全干燥，吸附的化合物用15mL甲醇洗脱，将洗脱液在氮吹条件下干燥至干，然后用1mL甲醇重新溶解，涡旋振荡15s，稀释1-5倍，通过0.22μm膜过滤至液相玻璃进样瓶中进行定性分析。
Copure C18固相萃取柱(500mg,6mL)，为北京逗点公司生产。
(4)定量分析：将步骤(2)中所得根分泌物样品使用体积比1：9的乙腈和水混合溶液将水样稀释10倍，然后通过0.22μm膜过滤进行定量分析；
实施例4
试剂与试药：扑草净工业级标准品(97.5％)来自千里红生物技术公司(山东)；乙腈、甲醇和乙酸乙酯均为HPLC级，均购自美国Fisher公司；甲酸(LC/MS 级)由Fisher中国上海公司提供。
质谱条件为：Q-Exactive Orbitrap质谱仪(美国热电公司)采用电加热喷雾离子源(HESI)对扑草净及代谢物以正离子模式进行了测定。使用以下参数可获得最佳信号：采用PierceTM ESI正负离子校准溶液(美国热电公司)用于每周一次的Q-Orbitrap调谐和校准。鞘气和辅助N2流量分别为40和10L/min，在 3.2kV喷雾电压下实现了电分离，HESI的加热温度为350℃，毛细管温度为 320℃，S-Lens RF值为50。
色谱条件为：在Accucore aQ C18柱(150mm×2.1mm，粒径为2.6μm，美国热电公司，P/N17326–152130)上进行色谱分离，流动相溶液A和B分别为含有0.10％甲酸水和乙腈，用3％乙腈(B)梯度洗脱2.0min，在12min内线性增加至97％并持续1.0min，包括重新平衡色谱柱在内的总运行时间为18min；流速为0.30mL/min，保持色谱柱温度30℃，进样量为5.0μL。
Q-Exactive系统执行full MS/dd-MS2模式，该系统包括Full MS扫描，然后是触发的数据相关扫描(dd-MS2)(扫描范围为m/z 50-600，质量分辨率设置为70000，而产物离子质量分辨率设置为17500)，从色谱图上通过精确质量数初步进行筛选，如果样品中发现可疑精确质量数和代谢类似物其理论质量数在 10ppm误差范围内，则将此化合物母离子的质量数编辑在仪器方法文件的可疑代谢物目标列表中，当检测到目标物且这些代谢物的强度达到阈值，就可以从目标列表中选择母离子在可变的碰撞能量(30-40-50eV)下从离子阱中获得二级质谱碎片离子；
采用UHPLC/ESI Q-Exactive Orbitrap MS高分辨质谱法的Full MS-SIM扫描模式、MS/dd-MS2和PRM模式(平行反应监测)从芹菜根部(暴露于50mg/L 扑草净)分泌溶液中搜索扑草净及其代谢物并通过[M+H]+和MS2二级离子质谱的精确质量数进行定性鉴定。
实施例5
样品为实施例1-3中定性样品，质谱条件见实施例4；
定性分析结果：
通过和标准物质的保留时间，精确质量数，同位素丰度比和特征质谱碎片等信息进行确认。表1列出了根分泌物中鉴定的扑草净代谢物名称及二级质谱碎片离子。根分泌溶液中鉴定到扑草净和8种代谢物分别为2-羟基-扑灭津、去异丙胺基莠灭净、扑灭通、扑草净亚砜，扑草净砜，双去异丙胺基莠灭净，2- 羟基脱乙基阿特拉津和三聚氰酸二酰胺，还有4个代谢物没有标准物质，推断为N,N'-双(异丙基氨基)-s-三嗪-2,4-二胺，莠灭净，N-异丙基氨基-s-三嗪-2,4-二胺和扑草净亚砜同分异构体。
对水培芹菜根分泌溶液中典型的扑草净亚砜和扑草净亚砜同分异构体进行的UHPLC/ESI Q-Exactive Orbitrap质谱仪full MS/dd-MS2模式质谱解析见图1：图1(A)和图1(B)分别是扑草净亚砜和扑草净亚砜同分异构体。用高分辨质谱分析准确识别出96小时根分泌物中的扑草净亚砜异构体，其精确质量数与扑草净亚砜相同，但保留时间和特征离子碎片不同，通过各自的特征离子碎片和扑草净亚砜区分开来。异构体在根分泌物中占了较高比例，且稳定存在，所以也是新发现的重要代谢物。
图2为不同96小时根分泌溶液(样品编号RE#1～6)中扑草净及代谢物百分比图，做为对照试验采用了去离子水添加营养液水培芹菜(见图2中RE#7)，此根部经第1次释放的96小时根分泌物中代谢物种类和含量均达不到定性要求；
从图3自来水水培芹菜根分泌物UHPLC/ESI Q-Exactive Orbitrap质谱仪fullMS/dd-MS2全扫描模式总离子流色谱图中可以清晰地观察到6个代谢物峰，分别为1.扑草净2.扑草净亚砜3.扑灭通4.扑草净亚砜异构体5.去异丙胺基莠灭净6.2-羟基-扑灭津。水体基质成分简单，没有干扰，适合定性分析。
表1水培芹菜根分泌物中扑草净及其代谢物的二级质谱碎片离子汇总
实施例6
扑草净及其代谢产物的含量测定
(1)标准溶液配制
扑草净标准(99.90％)、扑灭通(99.30％)、2-羟基-扑灭津(99.56％)、三聚氰酸二酰胺(98.49％)和2-羟基脱乙基阿特拉津(99.97±2.16ug/mL)购自德国Dr公司；双去异丙胺基莠灭净(98.7％)和去异丙胺基莠灭净(99.9％) 购自加拿大TLC Pharma Chem Inc公司；4,6-双(异丙基氨基)-2-甲基亚砜基-1,3,5- 三嗪即扑草净亚砜(98.0％)，和4,6-双(异丙基氨基)-2-甲基砜基-1,3,5-三嗪即扑草净砜(96.0％)标准品定制于上海纳孚生物技术有限公司(上海)，其结构通过LC/MS(DAD和API)和氢谱(NMR)确认。
选择扑草净和代谢物标准品用甲醇稀释成系列浓度的混合对照品溶液，建立标准曲线。高分辨质谱仪检测线性范围宽，灵敏度高，线性相关系数均大于 0.99。
(2)定量方法验证
空白水培样品中目标物的加标回收率采用三个不同浓度水平进行了定量验证，所有目标化合物的回收率均在78.0-108.6％之间(n＝6)，相对标准偏差(RSD) 在2.7-18.2％之间。检测限(LOD)和定量限(LOQ)为信噪比的3-10倍，是基于添加到空白营养液中的目标化合物分析而计算的，在0.01-0.10μg/L和 0.03-0.30μg/L范围内(见表2)。
表2水培溶液中目标物的线性、检出限、定量限
表3水培溶液中目标物的回收率及精密度
(3)由于扑草净亚砜异构体没有标准物质,其在根分泌溶液中的含量以扑草净亚砜做为参考标准物质单独定量。图4是不同水培芹菜(自来水)根分泌溶液分别经图4(A).453天和图4(B).161天常温自然光照贮存下降解/转化作用后各代谢物的含量；优势化合物分别是扑草净，扑草净亚砜，2-羟基-扑灭津、2-羟基脱乙基阿特拉津和去异丙胺基莠灭净；图5为扑草净在根分泌溶液环境中的降解/转化途径。
结果：图4(A)中根分泌溶液样品经连续在常温自然光照条件下贮存453天后降解物的种类和含量已经趋于稳定，扑草净和扑草净亚砜含量分别为1758.6 μg/L和802.8μg/L占了总浓度的33％和15％，而2-羟基-扑灭津含量达到 1978.2μg/L比例明显增加为总浓度的37％，其次是2-羟基脱乙基阿特拉津和去异丙胺基莠灭净含量分别368.5μg/L和388.4μg/L占了总浓度的7％和7％，比例和96小时根部分泌溶液相比发生巨大转变。
见图2，芹菜在新鲜自来水(含)中培养96小时根部分泌溶液样品RE#2 中主要成分为扑草净母体化合物占总峰面积总量的75％，其次是扑草净亚砜占 20％，其它次要代谢物2-羟基-扑灭津、扑草净亚砜异构体和去异丙胺基莠灭净分别占了2％、2％和1％，此样品经连续在常温自然光照条件下贮存453天后降解物的种类和含量已经趋于稳定(见图4A)。说明自来水中余氯具有加速代谢物之间转化的效果。羟基产物2-羟基-扑灭津，2-羟基脱乙基阿特拉津和三聚氰酸二酰胺可能是水体中扑草净和水体中余氯生成亚砜后继续转化的最终产物，双去异丙胺基莠灭净和三聚氰酸二酰胺的含量很低说明去异丙胺基莠灭净和2-羟基脱乙基阿特拉津没有进一步脱侧链烷基转化成产物双去异丙胺基莠灭净和三聚氰酸二酰胺，扑草净砜的含量始终在低浓度范围波动且变化没有规律，可能只是瞬间产物。
同样96小时根部分泌溶液样品RE#4(见图2)经贮存161天后(图4B)扑草净，扑草净亚砜和2-羟基-扑灭津含量分别为1017.8μg/L，526.0μg/L和159.8μg/L。
芹菜根分泌物溶液中检出数量繁多的高浓度扑草净代谢物。本发明测的结果范围：扑草净亚砜含量范围为：0.15～874.0μg/L，2-羟基-扑灭津含量范围为： 0.15～2408.0μg/L、2-羟基脱乙基阿特拉津含量范围为：0.30～381.2μg/L，去异丙胺基莠灭净含量范围为：0.15～476.0μg/L和扑草净亚砜异构体含量范围为： 0.30～91.8μg/L；
目前环境中检测的扑草净代谢物通常是去异丙胺基莠灭净和双去异丙胺基莠灭净。为了识别溶液中的优势代谢物是否是以上成分，本发明对根分泌溶液中扑草净代谢物进行了长期的转化反应，得到若干个优势代谢物，认为和扑草净在各种水体中的最终命运相同，从而轻松锁定了环境中各种存在形式的扑草净代谢物，最后识别出的优势代谢物分别是扑草净亚砜，2-羟基-扑灭津、2-羟基脱乙基阿特拉津和去异丙胺基莠灭净。
综上，本发明共筛查了扑草净及其12种代谢物分别为2-羟基-扑灭津，去异丙胺基莠灭净，扑灭通，扑草净亚砜，扑草净砜，双去异丙胺基莠灭净，2- 羟基脱乙基阿特拉津，三聚氰酸二酰胺，扑草净亚砜同分异构体，N,N'-双(异丙基氨基)-s-三嗪-2,4-二胺，莠灭净，N-异丙基氨基-s-三嗪-2,4-二胺，并将扑草净及前9种代谢物进行定量分析。方法可靠，独特，简便有效，容易操作，可将此方法扩展，用于环境中结构类似污染物代谢物的定性和定量。
实施例7
芹菜和白菜采用去离子水添加培养液的水培方式下扑草净代谢物的定性和定量比较
前处理：
植物水培：当芹菜处于6-7叶期，小白菜7-8叶期时以每个试验组芹菜5-6 株，小白菜2-3株即选择大小均匀的植株生物量均为100g，蒸馏水清洗根系后用定植篮转移到800mL水培溶液中，根部浸入到溶液4/5的位置，定期更换新鲜的水培溶液，经15天的生长恢复期，待植株长出水培根并完全适应水培环境后用于暴露试验。直接过滤水样采用高分辨质谱法进行分析。
仪器及试剂信息同实施例4，定量分析对照品同实施例5，0.163mL扑草净标准储备溶液(4.89mg/mL甲醇配制)加到800mL营养液中并充分混合，使芹菜和白菜根部分别暴露于含有1.0mg/L扑草净的玻璃水培器皿中，每天添加新配制的水培溶液保持800mL的水位体积以补充植物根部吸收水份和水体蒸发导致的损失；
水培芹菜和小白菜植株经138小时的吸收后，用去离子水将根部彻底清洗，除去多余的水份，然后转移到另一个无扑草净的800mL水培溶液的玻璃瓶中，以静态非无菌条件下进行根部释放试验，期间添加营养液以保持800mL的水样体积；采集营养液的下层、中层和上层水样采用直接水样进样法注入质谱仪分析其中的主要代谢产物含量。结果见图6芹菜和白菜采用去离子水添加培养液的水培方式下根分泌溶液中扑草净和扑草净亚砜动态浓度：A：扑草净B:扑草净亚砜)；
发现芹菜水培96小时根分泌溶液样品中扑草净母体化合物，扑草净亚砜和 2-羟基-扑灭津含量分别达61.5μg/L，21.2μg/L和0.5μg/L占浓度总量的74％，24％和1％，小白菜则分别为16.8μg/L，0.6μg/L和0μg/L占94％，3％和0％，扑草净亚砜同分异构体、2-羟基-扑灭津和去异丙胺基莠灭净浓度共占了全部的2-3％。
上述采用去离子水添加培养液水培的芹菜和小白菜植株被扑草净污染后的根分泌溶液经83天常温自然光照贮存下经降解/转化作用后扑草净各代谢物含量见图7，光照和微生物的作用比较活跃，扑草净含量持续下降，扑草净亚砜和 2-羟基-扑灭津含量明显上升，芹菜水培根分泌溶液中扑草净含量下降到38.0 μg/L，相反，扑草净亚砜和2-羟基-扑灭津含量分别增加到33.6μg/L和8.2μg/L，同时产生了更多低含量的代谢产物如2-羟基脱乙基阿特拉津、扑草净砜和双去异丙胺基莠灭净。
这种生物代谢反应生成产物的趋势和同样存放环境条件自来水中余氯和扑草净之间的硫氧化反应情况相似，但是反应性质不同，去离子水体配制的水培溶液中虽然没有余氯的作用，但是经长期贮存，扑草净也会转化生成大量的扑草净亚砜，继而继续反应生成其它羟基代谢物，在根分泌物溶液中检出微量的 2-羟基-扑灭津和去异丙胺基莠灭净然而其含量低至可以忽略不计(小于 0.5μg/L)，与扑草净在空白营养溶液中产生的含量相当。说明去离子水添加培养液的植物水培方式不足以支撑扑草净代谢物的定性分析；定量分析表明，去离子水添加到培养液水培的芹菜和小白菜植株被扑草净污染后的根分泌溶液在常温自然光照贮存下经降解/转化作用后扑草净，扑草净亚砜和2-羟基-扑灭津将成为优势代谢物。也采用地下水进行了类似的实验，认为实际应用中同样适用于植物生长环境中受扑草净污染的表面水和地下水的代谢物分析。
实施例8
模拟自然环境测定扑草净的残留
对比试验：扑草净在去离子水及自来水中的命运和代谢物定量分析
前处理：
仪器及试剂信息同实施例4，定量分析及对照品同实施例5。
0.163mL扑草净标准储备溶液(4.89mg/mL甲醇配制)分别加到800mL 去离子水和自来水中并充分混合，使去离子水和自来水均暴露于含有1.0mg/L 扑草净的1L玻璃水培器皿中，放置在自然常温光照条件下，采集营养液的下层、中层和上层水样使用体积比1：9的乙腈和水混合溶液稀释10倍，过滤，注入质谱仪分析代谢物含量，期间添加溶液以保持800mL的水样体积；结果见图8：扑草净在800mL去离子水和自来水中经24小时和30天降解/转化作用后扑草净各代谢物含量：A：自来水B:去离子水；跟踪扑草净在自来水中的反应，并和去离子水比较，发现自来水加标溶液中的扑草净瞬间和水体中用于消毒的余氯发生了化学反应，经24小时明处和暗处反应分别有78％和55％的扑草净硫氧化生成扑草净亚砜，扑草净浓度越高，扑草净亚砜所占的比例越低，余氯的影响也越弱。反应溶液中2-羟基-扑灭津、去异丙胺基莠灭净和扑灭通的浓度小于 0.5μg/L，不足以支撑扑草净代谢物的定性分析。而去离子水和扑草净则没有明显反应，24小时只生成了1％的扑草净亚砜和微量的2-羟基-扑灭津(见图8B)。经30天明暗处放置后，和暗处相比，去离子水体中的扑草净浓度在明处相对稳定，扑草净亚砜有微弱的增加(3％)，并有微量的2-羟基-扑灭津和去异丙胺基莠灭净产生，说明直接光照对扑草净和代谢物之间在溶液中的转化有微弱的影响。而自来水体中扑草净含量发生了很大变化，30天后生成了更多的代谢物，扑草净亚砜在余氯作用下继续转化成羟基化合物2-羟基-扑灭津，然后脱去一端的异丙氨基侧链生成2-羟基脱乙基阿特拉津；而脱烷基过程不明显，扑草净降解生成去异丙胺基莠灭净后没有进一步脱烷基生成双去异丙胺基莠灭净。同时光照作用更活跃，对代谢物的转化反应更明显，和暗处(490.8μg/L)相比，有更多的扑草净在自然光照下(260.6μg/L)转化成扑草净亚砜，生成扑草净亚砜产物的量(904.2μg/L)明显高于放置暗处的量(604.1μg/L)，2-羟基-扑灭津的转化量增加幅度也更明显(明处的140.4μg/L到暗处的64.4μg/L)，但是去异丙胺基莠灭净的浓度在明暗处只看到微小的差别(2.4μg/L到2.2μg/L)。
含扑草净的自来水经长期贮存，均将发生一系列的代谢物转化反应。自来水体中的某些化合物可能加速了光直接降解，含有亚硝酸盐和硝酸盐的溶液中经光化学反应产生的羟基自由基可能促使扑草净产生脱烷基物质。
结果：扑草净在去离子水及自来水中的命运完全不同，可与自来水中余氯迅速反应生成扑草净亚砜，从而加速代谢物生成的进程。但是溶液中只能检出微量的2-羟基-扑灭津和去异丙胺基莠灭净其含量低至可以忽略不计(小于 0.5μg/L)，说明自来水中添加扑草净的方式不足以支撑扑草净代谢物的定性分析，而扑草净在去离子水中几乎没有代谢物产生，经检测地下水和长期放置的自来水体(余氯的含量降为0)对扑草净的反应也和去离子水情况类似。认为实际应用中适用于表面水和地下水体中扑草净代谢物的分析。
本发明采用植物水培技术筛查和定量扑草净代谢物的质谱检测方法，属于农药残留分析技术领域。本发明利用含氯自来水水培的植物根部充分吸收扑草净后，结合高分辨质谱法进行定性和定量分析，可以得到清晰的各种代谢物色谱峰便于定性；根分泌物样品中的扑草净及代谢物经过常温贮存，通过暴露于水体中余氯、根系微生物、光照和植物体内酶的代谢等降解/转化作用下产生的种类繁多高浓度的代谢物便于定量；通过本发明能轻松锁定环境中各种存在形式的扑草净代谢物，并识别优势代谢物；本发明适用于环境中扑草净结构类似污染物如甲硫基-S三嗪类除草剂等代谢物的筛查和定量。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
Claims (8)
1.一种采用植物水培技术筛查和定量扑草净代谢物的质谱检测方法，其特征在于，
(1)采用作物芹菜，在含有扑草净的水溶液中培养，水溶液浓度为每升中含有10-50mg，经过24-96小时后，清洗植物根部，并采用芹菜转移到无扑草净的释放水中静置2-4天进行根部释放，进行1-5次释放，得到根分泌溶液样品；
(2)将以上根分泌溶液样品在自然光照常温环境条件下放置15-30天，得到经降解及转化后的各种代谢物；
(3)定性分析：将步骤(1)和(2)所得根分泌物样品5-10mL，加载到预处理后的十八烷基键合硅胶固相萃取柱中，用5-10mL纯水洗涤，并在真空下完全干燥，吸附的化合物用甲醇10-20mL洗脱，将洗脱液在氮吹条件下干燥至干，然后用甲醇重新溶解，涡旋振荡，过滤，稀释1-20倍，得到定性分析样品；
(4)定量分析：选择扑草净和代谢物标准品用甲醇稀释成系列浓度的混合溶液，建立标准曲线；将步骤(2)所得根分泌物样品使用体积比1：9的乙腈和水混合溶液稀释1-10倍，得到定量分析样品；
(5)质谱分析：所述(3)和(4)步骤中样品，采用高分辨质谱，对样品中的扑草净及代谢物以正离子模式进行检测，采用的色谱柱为十八烷基键合硅胶柱，采用的流动相为乙腈-甲酸-水溶液，梯度洗脱；质谱条件为，以正离子模式进行检测；质谱条件为，全扫描范围为m/z50-600，从色谱图上通过精确质量数初步进行筛选，如果样品中发现可疑精确质量数和代谢类似物其理论质量数在10ppm误差范围内，则将此化合物母离子的质量数编辑在仪器方法文件的可疑代谢物目标列表中，当检测到目标物且这些代谢物的强度达到阈值，就可以从目标列表中选择母离子在可变的碰撞能量获得二级质谱碎片离子；或在平行反应监测模式下将输入到目标物列表的可疑化合物母离子打碎，再次检查是否生成了二级碎片，然后进行化合物定性鉴定，及定量计算。
2.根据权利要求1所述采用植物水培技术筛查和定量扑草净代谢物的质谱检测方法，其特征在于，所述芹菜为4-7叶期；所述含有扑草净的水体积为400-800ml；所述释放水的体积为200-800ml。
3.根据权利要求1所述采用植物水培技术筛查和定量扑草净代谢物的质谱检测方法，其特征在于，所述水为自来水,含有余氯以Cl2计为0.3-1.0mg/L。
4.根据权利要求1所述采用植物水培技术筛查和定量扑草净代谢物的质谱检测方法，其特征在于，所述保存条件为光周期为16小时/8小时(白天/黑夜)，温度范围在18-25摄氏度。
5.根据权利要求1所述采用植物水培技术筛查和定量扑草净代谢物的质谱检测方法，其特征在于，所述固相萃取柱使用前用5-10mL甲醇和5-10mL纯水进行预淋洗处理。
6.根据权利要求1所述采用植物水培技术筛查和定量扑草净代谢物的质谱检测方法，其特征在于，所述色谱条件为，色谱柱填料为十八烷基键合硅胶柱粒径2.6μm，规格为150mm×2.1mm；流动相为甲酸水及乙腈，流动相溶液甲酸水为含有体积比为0.05-0.20％(ml/ml)用3％(ml/ml)乙腈梯度洗脱2.0分钟，在12分钟内线性增加至97％(ml/ml)并持续1.0分钟。
7.根据权利要求1所述采用植物水培技术筛查和定量扑草净代谢物的质谱检测方法，其特征在于，所述扑草净及代谢物定性分析的化合物包括扑草净，2-羟基-扑灭津，去异丙胺基莠灭净，扑灭通，扑草净亚砜，扑草净砜，双去异丙胺基莠灭净，2-羟基脱乙基阿特拉津，三聚氰酸二酰胺，N,N'-双(异丙基氨基)-s-三嗪-2,4-二胺，莠灭净，扑草净亚砜同分异构体，N-异丙基氨基-s-三嗪-2,4-二胺中的至少一种。
8.根据权利要求1所述采用植物水培技术筛查和定量扑草净代谢物的质谱检测方法，其特征在于，所述扑草净及代谢物定量分析的化合物包括扑草净，2-羟基-扑灭津，去异丙胺基莠灭净，扑灭通，扑草净亚砜，扑草净砜，双去异丙胺基莠灭净，2-羟基脱乙基阿特拉津，扑草净亚砜同分异构体或三聚氰酸二酰胺中的至少一种。
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