CN103433009A - 一种扑草净分子印迹固相萃取柱及使用方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及固相萃取技术领域，特指一种扑草净分子印迹固相萃取柱和使用方法。本发明以扑草净为模板，甲基丙烯酸为功能单体，乙二醇二甲基丙烯酸酯为交联剂，偶氮二异丁腈为引发剂，二氯甲烷为溶剂，采用沉淀聚合法制备扑草净分子印迹聚合物微球。将微球均匀填充于固相萃取柱内，得到扑草净分子印迹固相萃取柱。以二氯甲烷为样品溶剂、二氯甲烷-乙腈为淋洗溶剂、甲醇-水为洗脱溶剂，实现了谷物样品中西玛津、莠去津、西草净、扑灭津、莠灭净、特丁津、扑草净和特丁净残留的同时富集和净化；与毛细管电泳多残留检测方法相结合，可对谷物样品中这8种除草剂残留进行同时检测。

Description

一种扑草净分子印迹固相萃取柱及使用方法

技术领域

本发明涉及固相萃取技术领域，特指一种扑草净分子印迹固相萃取柱和使用方法，并和毛细管电泳方法结合用于选择性分离、富集和检测谷物样品中西玛津、莠去津、西草净、扑灭津、莠灭净、特丁津、扑草净和特丁净的残留。

背景技术

三嗪类除草剂是在世界范围内被广泛使用的一类农药，为环境荷尔蒙的可疑物质，能够引发癌症和干扰内分泌，然而三嗪类除草剂在食品中的残留浓度很低，往往需要在检测前进行适当富集，另外，在提取后进行的多残留色谱检测中，被同时提取出来的大量共存基质特别容易污染色谱柱，还需要通过净化使基质得以去除，即使采用了没有柱污染问题的毛细管电泳方法，有些种类的样品由于基质复杂，其基质信号与分析物信号有可能发生重叠，影响到定量结果的准确性，同样需要对样品进行净化，因此，对于食品中该类除草剂残留的检测来说，富集和净化是十分必要的。

固相萃取因使用的试剂量较少，对操作人员的伤害较小，操作耗时较短而被日益广泛地应用于农药残留检测的样品前处理中，成为富集和净化的最常用方法之一，但是众所周知，固相萃取柱中使用的填料通常都是一些非特异选择性的吸附材料，在实际应用时，往往容易同时提取出其它的干扰物质，影响检测结果，再者目前的商用固相萃取柱多为一次性使用，这无形之中也增加了检测成本；分子印迹聚合物是为模板分子量身定做的高分子聚合物，对模板分子和其结构类似物具有高识别性，而且可重复使用多次，这些都是普通固相萃取填料所不能比拟的，目前报道的分子印迹固相萃取填料多采用本体聚合法，经研磨得到的材料颗粒不均匀，许多结合位点被包裹于颗粒内部，不能充分发挥印迹材料的功能。

发明内容

本发明的目的在于提供一种扑草净分子印迹固相萃取柱的制备和使用方法，与本发明不可分割的部分——毛细管电泳多残留检测方法相结合，可实现对谷物中西玛津、莠去津、西草净、扑灭津、莠灭净、特丁津、扑草净和特丁净残留的同时检测。

具体步骤如下：

一种扑草净分子印迹固相萃取柱，其特征在于：所述的固相萃取柱采用如下制备方法进行制备：

（1）将扑草净、甲基丙烯酸按照1:4的摩尔比混合溶解于二氯甲烷中，于室温下放置过夜，其中二氯甲烷体积（mL）与甲基丙烯酸量（mmol）的比值为8~10：1，按照扑草净与乙二醇二甲基丙烯酸酯摩尔比为1:20的比例以及与偶氮二异丁腈摩尔比为1:0.24的比例将二者加入到上述溶液中超声振荡至混合均匀后，向装有溶液的圆底烧瓶通入氮气以去除氧气，保证聚合反应能够顺利进行，然后将烧瓶置于50^°C-60^°C恒温电热套中在旋转条件下反应，制得聚合物微球，将聚合物微球置于索式提取器中，用乙酸-甲醇混合溶剂洗去模板分子，然后用甲醇清洗去除聚合物微球中残留的乙酸，并用丙酮反复沉降除去过细微粒，最后放入真空干燥器中干燥至恒重，得到扑草净分子印迹聚合物微球。

（2）称取扑草净分子印迹聚合物微球，填充至底部装有筛板的空固相萃取柱中，再在填料的上方放置筛板并压实，制得扑草净分子印迹固相萃取柱。

所述的在旋转条件下反应指在100-350rpm转速下反应15-24h，在15h聚合反应完毕，可以继续增加至24h，但对实验结果无影响，超过24h这个时间聚合物的吸附能力会有所下降。

所述的乙酸-甲醇混合溶剂指乙酸和甲醇按照体积比1：9混合得到的溶剂。

所述的扑草净分子印迹聚合物微球填充至底部装有筛板的空固相萃取柱中的填充的高度不低于15mm。

2、扑草净分子印迹固相萃取柱的使用方法，按照下述步骤进行：

（1）将上述分子印迹固相萃取柱置于真空固相萃取装置上，依次用二氯甲烷、甲醇和超纯水在负压状态下淋洗活化，并抽干淋洗溶剂，其中三种溶剂的体积比为3:2:2。

（2）使制备的以二氯甲烷为溶剂的样品溶液在负压状态下连续通过固相萃取柱，抽干溶剂。

（3）以二氯甲烷-乙腈混合溶液为淋洗剂，在负压状态下连续通过固相萃取柱进行淋洗，抽干淋洗剂，并保持连续抽干状态。

（4）以甲醇-水混合溶液作为洗脱溶剂，在负压状态下连续通过固相萃取柱对分析物进行洗脱，抽干洗脱剂。

（5）将洗脱液用氮气吹干溶剂，用缓冲溶液定容后供毛细管电泳检测。

3毛细管电泳检测按照下述电泳条件进行：

缓冲液组成为25mmol/L硼酸盐、15mmol/L磷酸盐、40mmol/L十二烷基硫酸钠和3%（V/V）正丙醇，pH为6.5；分离电压20 kV；进样量为3.5kPa×90s；分离柱温25^°C；检测波长220nm。

所述的负压状态指-20kPa~-100kPa。

所述的样品溶液采用如下步骤制备：

（1）称取10.0g经粉碎并过20目筛后的带有农药残留大豆或玉米，置于50mL具塞锥形瓶中或称取10.0g经粉碎并过20目筛后的空白大豆或玉米（没有农药残留），置于50mL具塞锥形瓶中，加入8种三嗪类除草剂混合标准溶液，使加标量为0.005mg/kg；

（2）加入50%（V/V）甲醇水溶液30mL，于水浴振荡器中振摇30 min，4000 r/min下离心5 min，取上清液，样品残渣再加入50%（V/V）甲醇水溶液10mL，重复上述操作，合并两次提取液于蒸发瓶中，用旋转蒸发器蒸发近干，用20mL二氯甲烷溶解干渣。

所述的二氯甲烷-乙腈混合溶液指二氯甲烷和乙腈按照体积比75:25混合得到的溶液，二氯甲烷-乙腈混合溶液的加入量应采用不使被测物质从柱中淋洗出来的最大用量，目的是使样品中共存的干扰物被最大程度地洗掉，而被测物没有在这一步产生损失，本发明中选择3-10mL。

所述的甲醇-水混合溶液指甲醇和水按照体积比4:1混合得到的溶液，甲醇-水混合溶液加入量应采用使被测物质从柱中完全洗脱出来的最小用量，目的是使样品中的被测物在这一步用最小的溶剂消耗即可被完全洗脱，本发明中选择3-10mL。

所述步骤5中的缓冲溶液含体积百分比为20%的甲醇、25mmol/L硼酸盐和15mmol/L磷酸盐。

现有的三嗪类分子印迹固相萃取柱材料多采用本体聚合法制备，但是本体聚合法制备的分子印迹聚合物呈块状，需要经过研磨，这就造成所得填料形状不规则，且研磨过程容易使印迹空穴遭到破坏，最终使整个分子印迹固相萃取柱的吸附能力受到影响。为了解决传统分子印迹技术所存在的上述缺陷，本发明采用了一种沉淀聚合的方法，并且只采用扑草净单一模板即可制备出能对谷物样品中含有的西玛津、莠去津、西草净、扑灭津、莠灭净、特丁津、扑草净和特丁净残留同时进行高效富集和净化的印迹聚合物微球，方法操作简单，成本低，不需要在反应体系中加入任何稳定剂，即可获得粒径均匀的单分散微球聚合物，微球粒径约为0.2μm，具有很大的比表面积，使得聚合物上形成的选择性位点可以被充分利用。方法避免了繁琐的粉碎和研磨过程，具有较高的得率和较好的印迹效果，用该聚合物微球填充的固相萃取柱重复使用10次后效能基本无下降；采用本发明固相萃取柱对谷物样品进行富集和净化，结合毛细管电泳方法可对8种三嗪类除草剂进行多残留同时检测，有望成为谷物样品中这8种三嗪类除草剂残留检测的必备手段，目前尚未有人将三嗪类分子印迹固相萃取柱与毛细管在线推扫技术相结合进行这8种三嗪类除草剂残留的同时检测，与传统的高效液相色谱法相比毛细管在线富集检测方法具有灵敏度高、检测时间短、消耗溶剂少等优点。

附图说明

图1为分别利用扑草净分子印迹固相萃取柱和商品ENVI^TM-18固相萃取柱对加标大豆样品中8种三嗪类除草剂进行富集和净化后的效果比较电泳图；

图2为分别利用扑草净分子印迹固相萃取柱和商品ENVI^TM-18固相萃取柱对加标玉米样品中8种三嗪类除草剂进行富集和净化后的效果比较电泳图；

1.西玛津，2.莠去津，3.西草净，4.扑灭津，5.莠灭净，6.特丁津，7.扑草净，8.特丁净。

具体实施方式

实施例1

一 扑草净分子印迹固相萃取柱制备

A 将扑草净（0.242 g）、甲基丙烯酸按照摩尔比为1:4的比例混合溶解于35 mL二氯甲烷中，于室温下放置过夜，按照扑草净与乙二醇二甲基丙烯酸酯摩尔比为1:20的比例以及与偶氮二异丁腈摩尔比为1:0.24的比例将二者加入到上述溶液中超声振荡5min，向装有溶液的圆底烧瓶通入氮气5min，然后将烧瓶置于55^°C恒温电热套中在350rpm转速下反应15h，制得聚合物微球，将聚合物微球置于索式提取器中，用乙酸-甲醇（10:90, V/V）混合溶剂洗去模板分子，然后用甲醇清洗去除聚合物微球中残留的乙酸，并用丙酮反复沉降除去过细微粒，最后放入真空干燥器中干燥至恒重。

B称取250mg上述扑草净分子印迹聚合物微球，填充至6mL底部装有筛板的空固相萃取柱中，再在填料的上方放置筛板并压实。

二 扑草净分子印迹固相萃取柱用于加标大豆样品的富集和净化

A称取10.0g经粉碎并过20目筛后的空白大豆，置于50mL具塞锥形瓶中，加入8种三嗪类除草剂混合标准溶液，使加标量为0.005mg/kg，加入50%（V/V）甲醇水溶液30mL，于水浴振荡器中振摇30 min，4000 r/min下离心5 min，取上清液，样品残渣再加入50%（V/V）甲醇水溶液10mL，重复上述操作，合并两次提取液于蒸发瓶中，用旋转蒸发器蒸发近干，用20mL二氯甲烷溶解干渣。

B将扑草净分子印迹固相萃取柱置于真空固相萃取装置上，依次用15mL二氯甲烷、10mL甲醇和10mL超纯水在负压状态下淋洗活化，并抽干淋洗溶剂。

C使制备的样品溶液在负压状态下连续通过固相萃取柱，抽干溶剂。

D以5 mL二氯甲烷-乙腈（75:25, V/V）为淋洗剂，在负压状态下连续通过固相萃取柱进行淋洗，抽干淋洗剂，并保持连续抽干状态10min。

E以5mL甲醇-水（80:20, V/V）作为洗脱溶剂，在负压状态下连续通过固相萃取柱对分析物进行洗脱，抽干洗脱剂。

F将洗脱液用氮气吹干溶剂，用500μL含20%甲醇、25mmol/L硼酸盐和15mmol/L磷酸盐的缓冲溶液定容后供毛细管电泳检测。

三 加标样品的毛细管电泳检测

A电泳条件：缓冲液组成为25mmol/L硼酸盐、15mmol/L磷酸盐、40mmol/L十二烷基硫酸钠和3%（V/V）正丙醇，pH为6.5；分离电压20 kV；进样量为3.5kPa×90s；分离柱温25^°C；检测波长220nm。

B上述加标大豆样品三嗪类除草剂的回收率分别为：西玛津88.31%，莠去津82.01%，西草净97.76%，扑灭津91.92%，莠灭净96.24%，特丁津77.99%，扑草净100.3%，特丁净93.15%。

C上述加标大豆样品分别经扑草净分子印迹固相萃取柱和商品ENVI^TM-18固相萃取柱富集和净化后的效果比较电泳图如附图1所示。

从附图1中可看出，用扑草净分子印迹固相萃取柱对大豆样品的净化效果要明显优于商品ENVI^TM-18固相萃取柱，采用后者，在2-6min之间的杂质峰、西玛津前的杂质峰以及西草净和扑灭津间的杂质峰都未被去除干净，而采用前者，这些杂质峰全部消失。除西玛津、莠去津和特丁津外，扑草净分子印迹固相萃取柱的回收率均高于ENVI^TM-18柱，其中扑草净的回收率最高。

实施例2

一 扑草净分子印迹固相萃取柱制备

A 将扑草净（0.242g）、甲基丙烯酸按照摩尔比为1:4的比例混合溶解于35 mL二氯甲烷中，于室温下放置过夜。按照扑草净与乙二醇二甲基丙烯酸酯摩尔比为1:20的比例以及与偶氮二异丁腈摩尔比为1:0.24的比例将二者加入到上述溶液中超声振荡5min，向装有溶液的圆底烧瓶通入氮气5min，然后将烧瓶置于55^°C恒温电热套中在350rpm转速下反应15h，制得聚合物微球，将聚合物微球置于索式提取器中，用乙酸-甲醇（10:90, V/V）混合溶剂洗去模板分子，然后用甲醇清洗去除聚合物微球中残留的乙酸，并用丙酮反复沉降除去过细微粒，最后放入真空干燥器中干燥至恒重。

B称取250mg上述扑草净分子印迹聚合物微球，填充至6mL底部装有筛板的空固相萃取柱中，再在填料的上方放置筛板并压实。

二 扑草净分子印迹固相萃取柱用于加标大豆样品的富集和净化

A称取10.0g经粉碎并过20目筛后的空白玉米，置于50mL具塞锥形瓶中，加入8种三嗪类除草剂混合标准溶液，使加标量为0.02mg/kg。加入50%（V/V）甲醇水溶液30mL，于水浴振荡器中振摇30 min，4000 r/min下离心5 min，取上清液。样品残渣再加入50%（V/V）甲醇水溶液10mL，重复上述操作，合并两次提取液于蒸发瓶中，用旋转蒸发器蒸发近干。用20mL二氯甲烷溶解干渣。

B将扑草净分子印迹固相萃取柱置于真空固相萃取装置上，依次用15mL二氯甲烷、10mL甲醇和10mL超纯水在负压状态下淋洗活化，并抽干淋洗溶剂。

C使制备的样品溶液在负压状态下连续通过固相萃取柱，抽干溶剂。

D以5mL二氯甲烷-乙腈（75:25, V/V）为淋洗剂，在负压状态下连续通过固相萃取柱进行淋洗，抽干淋洗剂，并保持连续抽干状态10min。

E以5mL甲醇-水（80:20, V/V）作为洗脱溶剂，在负压状态下连续通过固相萃取柱对分析物进行洗脱，抽干洗脱剂。

F将洗脱液用氮气吹干溶剂，用500μL含20%甲醇、25mmol/L硼酸盐和15mmol/L磷酸盐的缓冲溶液定容后供毛细管电泳检测。

三 加标样品的毛细管电泳检测

A电泳条件：缓冲液组成为25mmol/L硼酸盐、15mmol/L磷酸盐、40mmol/L十二烷基硫酸钠和3%（V/V）正丙醇，pH为6.5；分离电压20 kV；进样量为3.5kPa×90s；分离柱温25^°C；检测波长220nm。

B上述加标玉米样品三嗪类除草剂的回收率分别为：西玛津87.66%，莠去津82.10%，西草净98.17%，扑灭津90.67%，莠灭净94.98%，特丁津77.48%，扑草净99.36%，特丁净94.85%。

C上述加标玉米样品分别经扑草净分子印迹固相萃取柱和商品ENVI^TM-18固相萃取柱富集和净化后的效果比较电泳图如附图2所示。

从附图2中可看出，用扑草净分子印迹固相萃取柱对玉米样品的净化效果要优于商品ENVI^TM-18固相萃取柱，采用后者，杂质存在导致的斜坡形基线在采用前者时都已消失。扑草净回收率远远高于ENVI^TM-18；西草净、扑灭津、莠灭净和特丁净的回收率也高于ENVI^TM-18，不低于86%；西玛津、莠去津和特丁津的回收率低于ENVI^TM-18，但也不低于77%。该结果表明印迹聚合物微球对结构相似度高的硫三嗪的选择性优于氯三嗪。

Claims (10)

1.一种扑草净分子印迹固相萃取柱，其特征在于：所述的固相萃取柱采用如下制备方法进行制备：

（1）将扑草净、甲基丙烯酸按照1:4的摩尔比混合溶解于二氯甲烷中，于室温下放置过夜，其中二氯甲烷体积（mL）与甲基丙烯酸量（mmol）的比值为8~10：1，按照扑草净与乙二醇二甲基丙烯酸酯摩尔比为1:20的比例以及与偶氮二异丁腈摩尔比为1:0.24的比例将二者加入到上述溶液中超声振荡至混合均匀后，向装有溶液的圆底烧瓶通入氮气以去除氧气，保证聚合反应能够顺利进行，然后将烧瓶置于50^°C-60^°C恒温电热套中在旋转条件下反应，制得聚合物微球，将聚合物微球置于索式提取器中，用乙酸-甲醇混合溶剂洗去模板分子，然后用甲醇清洗去除聚合物微球中残留的乙酸，并用丙酮反复沉降除去过细微粒，最后放入真空干燥器中干燥至恒重，得到扑草净分子印迹聚合物微球；

（2）称取扑草净分子印迹聚合物微球，填充至底部装有筛板的空固相萃取柱中，再在填料的上方放置筛板并压实，制得扑草净分子印迹固相萃取柱。

2.如权利要求1所述的一种扑草净分子印迹固相萃取柱，其特征在于：所述的在旋转条件下反应指在100-350rpm转速下反应15-24h，在15h聚合反应完毕，能够继续增加至24h，但对实验结果无影响，超过24h这个时间聚合物的吸附能力会有所下降。

3.如权利要求1所述的一种扑草净分子印迹固相萃取柱，其特征在于：所述的乙酸-甲醇混合溶剂指乙酸和甲醇按照体积比1：9混合得到的溶剂。

4.如权利要求1所述的一种扑草净分子印迹固相萃取柱，其特征在于：所述的扑草净分子印迹聚合物微球填充至底部装有筛板的空固相萃取柱中的填充的高度不低于15mm。

5.如权利要求1所述的一种扑草净分子印迹固相萃取柱的使用方法，其特征在于按照下述步骤进行：

（1）将上述分子印迹固相萃取柱置于真空固相萃取装置上，依次用二氯甲烷、甲醇和超纯水在负压状态下淋洗活化，并抽干淋洗溶剂，其中三种溶剂的体积比为3:2:2；

（2）使制备的以二氯甲烷为溶剂的样品溶液在负压状态下连续通过固相萃取柱，抽干溶剂；

（3）以二氯甲烷-乙腈混合溶液为淋洗剂，在负压状态下连续通过固相萃取柱进行淋洗，抽干淋洗剂，并保持连续抽干状态；

（4）以甲醇-水混合溶液作为洗脱溶剂，在负压状态下连续通过固相萃取柱对分析物进行洗脱，抽干洗脱剂；

（5）将洗脱液用氮气吹干溶剂，用缓冲溶液定容后供毛细管电泳检测。

6.如权利要求5所述的一种扑草净分子印迹固相萃取柱的使用方法，其特征在于：所述的负压状态指-20kPa~-100kPa。

7.如权利要求5所述的一种扑草净分子印迹固相萃取柱的使用方法，其特征在于：所述的样品溶液采用如下步骤制备：

（1）称取10.0g经粉碎并过20目筛后的带有农药残留大豆或玉米，置于50mL具塞锥形瓶中或称取10.0g经粉碎并过20目筛后的空白大豆或玉米（没有农药残留），置于50mL具塞锥形瓶中，加入8种三嗪类除草剂混合标准溶液，使加标量为0.005mg/kg；

（2）加入50%（V/V）甲醇水溶液30mL，于水浴振荡器中振摇30 min，4000 r/min下离心5 min，取上清液，样品残渣再加入50%（V/V）甲醇水溶液10mL，重复上述操作，合并两次提取液于蒸发瓶中，用旋转蒸发器蒸发近干，用20mL二氯甲烷溶解干渣。

8.如权利要求5所述的一种扑草净分子印迹固相萃取柱的使用方法，其特征在于：所述的二氯甲烷-乙腈混合溶液指二氯甲烷和乙腈按照体积比75:25混合得到的溶液，二氯甲烷-乙腈混合溶液的加入量应采用不使被测物质从柱中淋洗出来的最大用量，目的是使样品中共存的干扰物被最大程度地洗掉，而被测物没有在这一步产生损失，本发明中选择3-10mL；所述的甲醇-水混合溶液指甲醇和水按照体积比4:1混合得到的溶液，甲醇-水混合溶液加入量应采用使被测物质从柱中完全洗脱出来的最小用量，目的是使样品中的被测物在这一步用最小的溶剂消耗即可被完全洗脱，本发明中选择3-10mL。

9.如权利要求5所述的一种扑草净分子印迹固相萃取柱的使用方法，其特征在于：所述步骤5中的缓冲溶液含体积百分比为20%的甲醇、25mmol/L硼酸盐和15mmol/L磷酸盐。

10.如权利要求5所述的一种扑草净分子印迹固相萃取柱的使用方法，其特征在于：所述的毛细管电泳检测按照下述电泳条件进行：

缓冲液组成为25mmol/L硼酸盐、15mmol/L磷酸盐、40mmol/L十二烷基硫酸钠和3%（V/V）正丙醇，pH为6.5；分离电压20 kV；进样量为3.5kPa×90s；分离柱温25^°C；检测波长220nm。

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