CN109900884A

CN109900884A - 一种基于代谢组学的短链氯化石蜡斑马鱼胚胎毒性效应的研究方法

Info

Publication number: CN109900884A
Application number: CN201711297076.5A
Authority: CN
Inventors: 任晓倩; 陈吉平; 张海军; 耿柠波; 王菲迪; 宋肖垚
Original assignee: Dalian Institute of Chemical Physics of CAS
Current assignee: Dalian Institute of Chemical Physics of CAS
Priority date: 2017-12-08
Filing date: 2017-12-08
Publication date: 2019-06-18

Abstract

本发明公开了一种基于代谢组学技术的短链氯化石蜡斑马鱼胚胎毒性效应的研究方法，首先通过短链氯化石蜡对斑马鱼胚胎的暴露，建立了快速提取斑马鱼胚胎代谢产物的样品前处理方法，利用UHPLC/Q‑Trap MS能有效地对胚胎体内代谢产物进行分析，结合统计学处理及代谢通路富集分析能直观地反映短链氯化石蜡对斑马鱼胚胎代谢通路的影响。根据胚胎体内代谢物含量的变化初步阐述了短链氯化石蜡的毒性作用机制，基于分子生物学构建了一种胚胎毒性效应评估方法。本发明具有成本低，易于操作，检测快速，灵敏度高，选择性强，重复性好，获得信息全面等优点。

Description

一种基于代谢组学的短链氯化石蜡斑马鱼胚胎毒性效应的研究方法

技术领域

本发明属于污染物毒性评价领域，涉及一种基于分子生物学的评估方法，通过污染物对斑马鱼胚胎代谢路径的影响，评估污染物的斑马鱼胚胎毒性效应。

背景技术

短链氯化石蜡(Short-chain chlorinated paraffins，SCCPs)是一类链长为10～13个碳原子，氯含量为30％～70％(以重量计)的氯代正构烷烃，其组成复杂，具有上千种同族体和同分异构体。其广泛应用于金属加工液、涂料、密封剂、粘合剂、皮革处理剂、塑料加工过程中的阻燃剂等。SCCPs具有远距离迁移能力、环境持久性、生物累积与生物放大性，以及水生生物毒性等POPs属性。2017年，SCCPs作为一种新型持久性有机污染物被列入斯德哥尔摩公约受控清单。过去的30年里，美国、欧盟和日本已对短链氯化石蜡的生态风险和人体健康风险进行了初步的评估。研究表明，对无脊椎动物和鱼类，短链氯化石蜡在μg/L水平就具有慢性毒性效应。此外，研究还发现，SCCPs具有内分泌干扰效应。在致癌性研究中，人们发现短链氯化石蜡会增加啮齿动物肝脏、甲状腺、肾腺瘤和癌症的发病率。目前，对于大多数芳构化POPs(多氯联苯、二噁英、有机氯农药和多溴联苯醚等)的毒性效应与作用机制的研究已经比较透彻，而短链氯化石蜡的毒性研究仍十分有限。鉴于短链氯化石蜡在中国环境中污染的严重性，对其毒性效应开展深入细致的研究是十分必要，所得结果可以填补该领域的研究空白。近年来，斑马鱼(Danio rerio)已成为化合物毒性评价的良好动物模型，并且成为各国标准化组织制定的标准试验动物。此外，胚胎和幼鱼，相较于成鱼来说，对于环境压力有更灵敏的响应。

本发明基于分子生物学，以斑马鱼胚胎作为研究对象，构建一种短链氯化石蜡斑马鱼胚胎毒性效应的评估方法。该方法研究了短链氯化石蜡暴露后，斑马鱼胚胎体内代谢产物的变化及影响的代谢通路，通过测定代谢通路中关键调控酶的活性，较为直观的揭示了短链氯化石蜡的毒性效应。

发明内容

本发明目的是提供一种研究污染物胚胎毒性效应的方法。利用UHPLC/Q-Trap有效地对胚胎体内小分子代谢产物进行分析，所述小分子代谢物为指分子量小于1000的代谢物。例如：氨基酸、脂肪酸、磷脂等多种小分子代谢物。

结合统计学处理及代谢通路富集分析直观地反映污染物对斑马鱼胚胎代谢路径的影响，并利用生物学检测方法进一步对嘌呤代谢关键酶活性进行快速分析。根据胚胎体内代谢物含量的变化及所在代谢路径中限速酶活性的变化揭示了污染物可能的胚胎毒性效应，基于分子生物学构建了一种污染物毒性效应评估方法。本发明具有实验成本低、操作简单、检测快速、灵敏度高、选择性强、重复性高、获得信息量全面等优点。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：

以斑马鱼胚胎作为模式生物，以短链氯化石蜡为例对斑马鱼胚胎进行暴露，并利用UHPLC/Q-Trap MS测定了胚胎体内氨基酸、脂肪酸、葡萄糖、脂类、肉碱等多种代谢产物，通过统计学分析及代谢通路富集分析找到受短链氯化石蜡暴露后胚胎体内显著变化的代谢物和代谢通路，并进一步检测代谢路径中起关键调控作用的限速酶活性，研究了短链氯化石蜡胚胎毒性效应。

具体包括以下步骤：

(a)受精后两小时内的斑马鱼胚胎于烧杯中，用短链氯化石蜡对胚胎进行暴露72h后，去离子水快速清洗胚胎表面，收集胚胎样品，液氮淬灭；

(b)采用液固萃取法对步骤a所得胚胎样品的小分子代谢产物进行提取；

(c)利用基于UHPLC/Q-Trap MS的质谱方法对步骤b所得提取液中的小分子代谢产物进行定量分析；

(d)统计学分析处理UHPLC/Q-Trap MS检测的代谢产物，找出含量显著变化的代谢产物，视为差异代谢物，对差异代谢物进行深入的代谢路径富集分析，找到受短链氯化石蜡显著影响的代谢通路；

(e)对受显著影响的代谢路径中起关键作用的限速酶活性进行测定，揭示短链氯化石蜡的毒性效应。

上述步骤a中，所述烧杯为200mL的烧杯，胚胎培养密度为50只/烧杯，每个烧杯培养液体积为100mL；培养液为经过Aqua Pro Pure系统处理过的养殖软化水，使用前，充分曝气至少24小时以使水中溶解氧接近饱和，试验用水的硬度为150mg/L(以CaCO₃计)，pH为7.96。暴露用实验室自制合成的短链氯化石蜡，成鱼产卵后，挑选出受精正常、发育良好的胚胎随机分配到各个烧杯中，每个烧杯加入含DMSO为0.02％(v/v)、含短链氯化石蜡不同暴露浓度的培养液100mL，另外设置对照组，即加入只含有0.02％(v/v)DMSO的培养液。每个暴露组及对照组设置10个平行，在培养箱内的培养条件为温度27±0.5℃，光暗比12/12；培养液溶解氧至少为空气饱和值的80％，且每24h更换一次培养液。暴露72h后，分别收集每个烧杯中的20只胚胎到干净离心管内，迅速液氮淬灭，而后转入-80℃冰箱保存，待处理。

上述步骤b中，提取胚胎体内小分子代谢物的过程分为两步提取：第一步制备细胞破碎液，每个样品加入500uL去离子水，冰水浴中匀浆3min，得到匀浆液后，冰水浴中超声破碎，破碎时间为5min，得到破碎悬液，冷冻干燥，得到冻干样品；第二步小分子代谢物提取，每个冻干样品中加入500uL含内标的提取液(80％甲醇/水，包含六个内标，200μg/L L-苯丙氨酸-D5，200μg/L氘代辛酰(8,8,8-D3)-L-盐酸肉碱，200μg/L溶血磷脂酰胆碱(12:0)，400μg/L磷脂酰乙醇胺(17:0)，200μg/L十一烷酸，200μg/L十九烷酸)，涡旋30min混匀，8℃下，13000×g离心20min,；注射器取上清并且过有机相滤器后，转移至干净离心管，冷冻干燥，得到冻干样品，每个冻干样品加入200uL提取液，复溶，直接用于UHPLC/Q-Trap MS分析。

上述步骤c中代谢产物的定量分析中，基于代谢物分子性质的差异，分为正负离子两种模式进行扫描，色谱条件如下所述。正离子模式：色谱柱用ACQUITY UPLC BEH C8(1.7μm，2.1×100mm)，流动相A为含甲酸0.1％(v/v)的超纯水，B相为含甲酸0.1％(v/v)的乙腈。流动相梯度洗脱程序为：起始为90％A，3min时下降到60％，15min时下降到0％并维持5min，20.1min时回到90％A，平衡3min；流速为0.35mL/min，柱温为50℃，进样量为5μL。负离子模式：色谱柱用ACQUITY UPLC HSS T3(1.8μm，2.1×100mm)，流动相A为含NH₄HCO₃ 5mmol/L的超纯水，B相为含NH₄HCO₃ 5mmol/L的甲醇。流动相梯度洗脱程序为：起始为98％A并维持1min，3min时下降到58％，12min时下降到0％并维持4min，16.1min时回到98％A，平衡4min；流速为0.35mL/min，柱温为50℃，进样量为5μL。正负离子扫描模式均为Scheduled MRM(有保留时间)模式。

上述步骤d中统计学分析基于在线的http://www.metaboanalyst.ca./网站对斑马鱼胚胎体内代谢产物的质谱数据进行处理，找出短链氯化石蜡暴露后胚胎内相对于对照组而言含量显著变化的代谢物，视为差异代谢物。用IncroMap软件对差异代谢物进行代谢通路富集分析，通过对差异代谢物的倍率变化(FC：fold change)数据建立t-test和Q-statistic模型进行分析，基于KEGG数据库找出显著受影响的代谢通路。代谢通路富集分析得到了反映代谢通路受影响程度的Q值，根据Q值，对这些影响通路进行分类，并绘图。

上述步骤e测定嘌呤代谢中起关键作用的限速酶活性的变化，包括嘌呤核苷磷酸化酶(PNP)和鸟嘌呤脱氨酶(GDA)，这两种酶活性的测定采用酶联免疫吸附法(ELISA)，结合这些生物学指标揭示了短链氯化石蜡的斑马鱼胚胎毒性效应。

本发明的有益结果如下：

(1)本发明选择斑马鱼胚胎作为模式生物，具有诸多优点：首先，斑马鱼成鱼个体小、发育周期短、繁殖率高、饲养成本低，易实验养殖；其次，该物种已成为包括OECD、ISO、USEPA在内的多个国际组织机构推荐的标准鱼种；最重要的是，斑马鱼在基因水平上87％与人类同源，其早期发育与人类极为相似，一定程度上降低了实验结果外推至人的物种差异性；同时，胚胎比成鱼更为敏感，其受精方式为体外受精，配体透明，便于观察。

(2)本实验所用短链氯化石蜡为实验室自制合成的标准品，产量较高，保证了暴露实验的用量，克服了商品化短链氯化石蜡浓度低、规格小、价格昂贵的缺点。

(3)本发明建立了快速提取斑马鱼胚胎体内小分子代谢物的方法，且基于UHPLC/Q-Trap MS进行拟靶向分析，分析代谢物种类多且定量效果好。

(4)本发明以代谢组学作为技术手段研究短链氯化石蜡毒性作用机制，能够为毒性作用机制与生物表型状态之间的关系提供一个深入观察视角，在环境污染物毒性评估过程中表现出快速、灵敏、高选择性的特点。

(5)统计学手段结合代谢通路富集对高通量代谢产物进行分析，得到胚胎体内代谢产物的变化以及显著受影响的代谢路径，更深入的反应了短链氯化石蜡所引起的胚胎毒性效应。

附图说明

图1为评价代谢组学分析方法稳定性和可靠性的质量控制图：QC样品中化合物的RSD分布于PCA因子得分图。

图2为不同浓度SCCPs暴露后斑马鱼胚胎体内小分子代谢物的PLS-DA因子得分图。

图3为经过代谢通路富集分析所得到的SCCPs暴露后，斑马鱼胚胎受到显著干扰代谢通路图。

图4为嘌呤代谢通路图。

具体实施方式

实施例：以斑马鱼胚胎为受试生物，建立了基于UHPLC/Q-Trap MS的代谢组学技术研究短链氯化石蜡对斑马鱼胚胎的毒性效应。

实施例1：

将受精正常、发育良好的胚胎(2hpf)随机分配到各个烧杯中，胚胎培养密度为50只/烧杯，每个烧杯培养液体积为100mL；培养液为经过Aqua Pro Pure系统处理过的养殖软化水，使用前，充分曝气至少24小时以使水中溶解氧接近饱和，试验用水的硬度为150mg/L(以CaCO₃计)，pH为7.96。暴露用实验室自制合成的短链氯化石蜡标准品对照组是0μg/L、暴露组分别是1、5、10、50、100、200μg/L，加上空白对照，一共7个组。每个烧杯加入含DMSO为0.02％(v/v)、含短链氯化石蜡不同暴露浓度的培养液100mL，另外设置对照组，即加入只含有0.02％(v/v)DMSO的培养液。每个暴露组和对照组设置10个平行，在培养箱内的培养条件为温度27±0.5℃，光暗比12/12；培养液溶解氧至少为空气饱和值的80％，且每24h更换一次培养液。暴露72h后，分别收集每个烧杯中的20只胚胎到干净离心管内，迅速液氮淬灭，而后转入-80℃冰箱保存，待处理。

实施例2：

提取胚胎体内小分子代谢物的过程分为两步提取：第一步制备细胞破碎液，每个样品加入500uL去离子水，冰水浴中匀浆3min，得到匀浆液后，冰水浴中超声破碎，破碎时间为5min，得到破碎悬液，冷冻干燥，得到冻干样品；第二步小分子代谢物提取，每个冻干样品中加入500uL含内标的提取液(80％甲醇/水，包含六个内标，200μg/L L-苯丙氨酸-D5，200μg/L氘代辛酰(8,8,8-D3)-L-盐酸肉碱，200μg/L溶血磷脂酰胆碱(12:0)，400μg/L磷脂酰乙醇胺(17:0)，200μg/L十一烷酸，500μg/L十九烷酸)，涡旋30min混匀，8℃下，13000×g离心20min,；注射器取上清并且过有机相滤器后，转移至干净离心管，冷冻干燥，得到冻干样品，每个冻干样品加入200uL提取液，复溶，直接用于UHPLC/Q-Trap MS分析。

实施例3：

建立UHPLC/Q-Trap MS分析方法对胚胎体内代谢产物进行定量分析，基于代谢物分子性质的差异，分为正负离子两种模式进行扫描，色谱条件如下所述。正离子模式：色谱柱用ACQUITY UPLC BEH C8(1.7μm，2.1×100mm)，流动相A为含甲酸0.1％(v/v)的超纯水，B相为含甲酸0.1％(v/v)的乙腈。流动相梯度洗脱程序为：起始为90％A，3min时下降到60％，15min时下降到0％并维持5min，20.1min时回到90％A，平衡3min；流速为0.35mL/min，柱温为50℃，进样量为5μL。负离子模式：色谱柱用ACQUITY UPLC HSS T3(1.8μm，2.1×100mm)，流动相A为含NH₄HCO₃ 5mmol/L的超纯水，B相为含NH₄HCO₃ 5mmol/L的甲醇。流动相梯度洗脱程序为：起始为98％A并维持1min，3min时下降到58％，12min时下降到0％并维持4min，16.1min时回到98％A，平衡4min；流速为0.35mL/min，柱温为50℃，进样量为5μL。正负离子扫描模式均为Scheduled MRM(有保留时间)模式。

实施例4：

考察所建立的代谢组学分析方法准确性与重现性，所有样本混合作为质控(QC)样品插入分析序列，每个浓度组六个样品后进一个QC样品，总共插入9次QC样品。QC样品中每个代谢物浓度的相对标准偏差(RSD)的计算结果与QC样品的主成分分析(PCA)得分均如图1所示。正负离子分别检测，总计检测到560个色谱峰中，44.8％色谱峰的RSD<10％，85.7％色谱峰的RSD<20％，93.4％色谱峰的RSD<30％。此外，主成分分析(PCA)得分图表明所有QC样品的因子得分在第一主成分方向均落在两倍标准偏差的置信区间内(R²X＝0.3954)。QC样品的统计学分析结果表明代谢物拟靶向分析序列具有较好的稳定性与重复性，满足定量分析的要求。

实施例5：

分析基于在线的http://www.metaboanalyst.ca./进行处理，对胚胎体内代谢产物进行PLS-DA(图2所示)和ANOVA分析，找出SCCPs暴露组相对于对照组含量具有显著变化的代谢物，视为差异代谢物。用IncroMap软件对差异代谢物进行代谢通路富集分析，通过对差异代谢物的倍率变化(FC：fold change)数据建立t-test和Q-statistic模型进行分析，基于KEGG数据库找出显著受影响的代谢通路。代谢通路富集分析得到了反映代谢通路受影响程度的Q值，根据Q值，对这些影响通路进行分类，如图3所示。

实施例6：

对嘌呤代谢(图4所示)过程中起关键作用的限速酶活性进行检测，包括嘌呤核苷磷酸化酶(PNP)和鸟嘌呤脱氨酶(GDA),两种酶的测定均采用酶联免疫吸附法(ELISA)。

酶活性测定悬液制备：采集到的各组10个样品，6个用于代谢组学分析，4个用于酶活测定。斑马鱼胚胎分别转移至干净的离心管，并用去离子水清洗3次，吸弃去离子水。每管加入100uL的PBS，冰水浴下组织匀浆3min，然后冰水浴下超声破碎5min，得到胚胎细胞悬液。8℃下5000×g离心15min，取上清备用。移取10uL上清，按照ELISA测定说明依次进行加样，加酶，温育，洗涤，显色，终止等操作，利用酶标仪在450nm波长下测定吸光度值。

结合以上分析测定结果，揭示了SCCPs的斑马鱼胚胎毒性效应。

在环境相关浓度下(1-5μg/L)，SCCPs已经开始较为轻微地扰乱斑马鱼胚胎总代谢，增强了不饱和脂肪酸(USFAs)和超长链脂肪酸(VLCFAs)的β-氧化过程，尤其在嘌呤代谢过程中，抑制了鸟嘌呤(guanine)向黄嘌呤(xanthine)的转化。当暴露浓度升高到50-200μg/L时，SCCPs则显著的扰乱了斑马鱼胚胎的代谢。其中，扰乱程度最大的是甘油磷脂代谢、脂肪酸代谢和嘌呤代谢。SCCPs的暴露使得斑马鱼胚胎体内磷脂、不饱和脂肪酸、超长链脂肪酸和氨基酸的含量显著提高；相反却显著的降低了中长链脂肪酸、饱和脂肪酸、肉碱和重要能量提供物质次黄嘌呤核苷酸。尽管，在暴露实验过程中，斑马鱼胚胎的存活率与孵化率未受显著影响，但是孵化后幼鱼的存活率则随着暴露浓度的提高而显著降低。这些结果显示，应该更多的关注SCCPs对鱼类的亚慢性毒性和慢性毒性。

本发明以代谢组学作为技术手段，结合起关键调控作用的酶活性测定，研究短链氯化石蜡对斑马鱼胚胎的毒性效应，能够为毒性效应与生物表型状态之间的关系提供一个深入的观察视角，实验过程具有快速、灵敏、高选择性，且获得信息全面直观等特点，能够真实的反映环境真实情况。本发明以与人类高度同源的斑马鱼胚胎作为体外模型研究污染物的毒性效应，能够减少常规毒理实验中动物使用量大的缺点，该发明用以探索污染物的毒性效应，尤其是发育毒性具有深远的意义。

Claims

1.一种短链氯化石蜡斑马鱼胚胎毒性效应的评估方法，其特征在于：包括以下步骤：

(a)受精后0～4h的斑马鱼胚胎，用短链氯化石蜡对胚胎进行暴露，68～76h后，去离子水快速清洗胚胎表面，收集胚胎样品，液氮淬灭；

(d)统计学分析处理UHPLC/Q-Trap MS检测的代谢产物，找出含量显著变化的代谢产物，视为差异代谢物，对差异代谢物进行代谢通路富集分析，找到受短链氯化石蜡显著影响的代谢通路；

2.根据权利要求1所述的测定方法，其特征在于：步骤a中的容器为烧杯，每个烧杯内加入培养液，胚胎的培养密度为1～50只/烧杯，每个浓度组设置多个平行；暴露所用短链氯化石蜡为C₁₀～C₁₃，平均氯含量为40％～70％；所述暴露操作是将受精正常、发育良好的胚胎随机分配到各个烧杯中，每只烧杯加入含DMSO、含短链氯化石蜡浓度为1μg/L～200μg/L的胚胎培养液100mL，在培养箱内的培养条件为温度27±0.5℃，光暗比12/12；培养液溶解氧至少为空气饱和值的80％，且每24h更换一次培养液。

3.根据权利要求1所述的测定方法，其特征在于：步骤b中提取胚胎体内小分子代谢物的过程分为两步：第一步得到细胞破碎液，每个样品加入500uL去离子水，冰水浴中匀浆，得到匀浆液后，冰水浴中超声破碎，破碎时间为5min，得到破碎悬液，冷冻干燥，得到冻干样品；第二步小分子代谢物提取，每个冻干样品中加入500uL含内标的提取液(80％甲醇/水，包含六个内标，200μg/L L-苯丙氨酸-D5，200μg/L氘代辛酰(8,8,8-D3)-L-盐酸肉碱，200μg/L溶血磷脂酰胆碱(12:0)，400μg/L磷脂酰乙醇胺(17:0)，200μg/L十一烷酸，200μg/L十九烷酸)，涡旋30min混匀，8℃下，13000×g离心20min；注射器取上清并且过有机相滤器后，转移至干净离心管，冷冻干燥，得到冻干样品，每个冻干样品加入200uL提取液，复溶，直接用于UHPLC/Q-Trap MS分析。

4.根据权利要求1所述的测定方法，其特征在于：步骤c代谢产物的定量分析中，基于代谢物分子性质的差异，分为正负离子两种模式进行扫描，色谱条件如下所述；正离子模式：色谱柱用ACQUITY UPLC BEH C8(1.7μm，2.1×100mm)，流动相A为含甲酸0.1％(v/v)的超纯水，B相为含甲酸0.1％(v/v)的乙腈；流动相梯度洗脱程序为：起始为90％A，3min时下降到60％，15min时下降到0％并维持5min，20.1min时回到90％A，平衡3min；流速为0.35mL/min，柱温为50℃，进样量为5μL；负离子模式：色谱柱用ACQUITY UPLC HSS T3(1.8μm，2.1×100mm)，流动相A为含NH₄HCO₃ 5mmol/L的超纯水，B相为含NH₄HCO₃ 5mmol/L的甲醇；流动相梯度洗脱程序为：起始为98％A并维持1min，3min时下降到58％，12min时下降到0％并维持4min，16.1min时回到98％A，平衡4min；流速为0.35mL/min，柱温为50℃，进样量为5μL；正负离子扫描模式均为Scheduled MRM(有保留时间)模式。

5.根据权利要求1所述的测定方法，其特征在于：步骤d中统计学分析基于在线的http://www.metaboanalyst.ca./网站对斑马鱼胚胎内代谢产物的质谱数据进行处理，找出短链氯化石蜡暴露后胚胎内含量显著变化的代谢物，视为差异代谢物；用IncroMap软件对差异代谢物进行代谢通路富集分析，通过对差异代谢物的倍率变化(FC：fold change)数据建立t-test和Q-statistic模型进行分析，基于KEGG数据库找出显著受影响的代谢通路；代谢通路富集分析得到了反映代谢通路受影响程度的Q值，根据Q值，对这些影响通路进行分类。

6.根据权利要求1所述的测定方法，其特征在于：经步骤d、步骤e得到了短链氯化石蜡暴露引起的斑马鱼胚胎体内代谢产物含量的变化及受显著影响的代谢路径，并对嘌呤代谢中起关键作用的限速酶活性进行测定，结合这些生物学指标揭示了短链氯化石蜡的斑马鱼胚胎毒性效应。

7.根据权利要求1所述的测定方法，其特征在于：所述显著变化，是指经统计学处理后，P<0.05,且VIP值>1的代谢物，认为是差异代谢物。

8.根据权利要求5所述的测定方法，其特征在于：所述显著变化的代谢物，是指对数据首先进行PLS-DA分析，然后进行ANOVA分析，挑选出其中P<0.05且VIP>1的化合物，作为显著变化的代谢物。