CN103558354B - 一种基于生物组学整合技术的水体毒性分析方法 - Google Patents

一种基于生物组学整合技术的水体毒性分析方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种基于生物组学整合技术的水体毒性分析方法，属于水体毒性评价领域。其步骤为：选择受试水样和模式动物进行染毒实验；采集提取总RNA，采集血清样品；RNA样品采用基因芯片进行转录组检测，得到受试动物全基因组表达数据；血清样品进行核磁共振检测，获得核磁共振谱图和血清代谢物信号；根据基因表达倍数筛选差异表达基因；根据偏最小二乘法判别分析结果筛选差异表达代谢物；分别进行基于转录组和代谢组的生物学通路分析，最终识别出转录组和代谢组共同发生变化的生物学通路。通过本发明可以对受污染水体的复杂毒性和致毒机理进行高通量测试分析，提供全面准确的生物信息学参数和指标，简化了高通量生物信息学数据的处理。

Description

一种基于生物组学整合技术的水体毒性分析方法
技术领域
本发明涉及一种水体毒性评价方法，更具体地说是一种基于生物组学整合技术的水体毒性分析方法，即一种基于生物组学整合技术综合分析水体复杂毒性及其致毒机理的高通量筛选方法。
背景技术
目前，污水处理厂二级出水、饮用水源水乃至自来水中均检测出多种微量有毒有害有机污染物及重金属，这些污染物质会带来环境健康风险，甚至威胁人体健康。因此，急需全面、准确、灵敏的水体毒性分析技术和方法，深入分析受污水体的毒性作用及机理，预测其潜在的人体健康风险。
现有的水体毒性评价方法主要为生物测试法，包括体外检测和活体检测。这些检测方法通过生物反应终点（如致死率、应激反应、氧化损伤等）来反映污染物的毒性效应，具有简便快速的优点。但这些传统方法也存在不足：（1）传统方法只能反映生物体或组织器官个别的生化功能和状态，缺乏整体的、系统的毒性评价指标。（2）这些方法不够灵敏，只对高浓度的污染物有响应，对于水体中痕量污染物的毒性作用则检测不出。（3）受污染水体组分复杂，很难逐一对其进行鉴别和检测，对每个化合物都进行生物毒性测试则更加不现实，加之不同的污染物间可能存在的协同或拮抗等联合毒性，即便获得所有污染物的浓度和毒性，也难以准确评价水体的综合毒性及致毒机理。
实际环境中的污染过程或毒性效应极为复杂，如何真实地反映污染物的毒性作用，一直以来都是困扰研究人员的一大难题。在这种大背景下生物组学技术就应运而生了。生物组学技术就是综合运用基因组、转录组、蛋白质组和代谢组技术全面分析生物体的生命变化。生物体的遗传信息从底层代码（基因组和转录组的信息）到最终表现型（蛋白质组和代谢组的表达）的传递会受到很多因素的制约。因此，在考查环境污染物的毒性作用时，既要考虑毒物对基因组和转录组等底层遗传信息的影响，同时也要考虑毒物导致的蛋白质表达变化及代谢组的改变。这就需要整合不同组学检测得到的数据，相互串联，深入挖掘潜在的生物学信息，才能更真实、准确地阐明污染物的毒性作用机制。目前，生物组学技术用于水体毒性分析，大多数仅限于不同组学内部的分析，缺乏不同组学间的有效串联。本发明引入了一套不同组学间串联分析方法，可以有效地进行高通量的生物信息学分析，准确定位水体毒性作用影响的生物学通路。
发明内容
1.要解决的技术问题
针对现有水体毒性检测分析方法在灵敏度、整体性和准确度等方面的不足，本发明提供一种基于生物组学整合技术的水体毒性分析方法，即基于转录组和代谢组整合的生物组学技术的水体毒性评价方法，通过本发明可以对受污染水体的复杂毒性和致毒机理进行高通量测试分析，提供全面准确的生物信息学参数和指标。
2.技术方案
本发明的技术方案如下：
一种基于生物组学整合技术的水体毒性分析方法，其具体步骤如下：
（1）染毒实验：受污染水体样品作为受试水样，以纯净水作为空白对照，选取模型动物（如斑马鱼、小鼠、大鼠等有完备遗传信息背景数据的模式动物）进行染毒实验，每组10只模式动物；
（2）样品采集：染毒周期结束后，采集提取肝脏总RNA样品；采集血液，经3000转/分钟，离心20分钟，得到血清样品；
（3）转录组检测：每3个RNA样品混合成1个样品，进行转录组基因芯片检测，基因芯片Mouse Genome430A2.0由Affymetrix公司（美国）提供，染毒组和对照组每组做3张芯片，进行统计分析，得到受试动物全基因组表达数据；
（4）代谢组检测：染毒组和对照组每个受试动物取300μL血清样品，加入300μL pH7.4的磷酸盐缓冲液混合均匀后取550μL上清液，采用Bruker AV600型核磁共振仪（Bruker公司，德国），进行核磁共振检测；
（5）差异表达基因筛选：根据基因芯片的检测结果，将染毒组和对照组基因表达信号进行比较，筛选表达倍数>2.0且错误发现率（False Discovery Rate,FDR）<0.1的基因作为差异表达基因，这一标准既可以排除芯片假阳性信号的干扰，又能从上万个全基因组基因中筛选足够数量的差异表达基因用于后续的生物学通路分析；
（6）差异表达代谢物筛选：将血清核磁共振谱图进行分段积分,以0.005ppm为间隔进行积分，这一标准能够提高血清代谢物谱峰的识别度，减小谱峰重叠带来的误差。将得到的积分数据采用多元数据分析软件SIMCA-P11.5（Umetrics公司,美国）进行偏最小二乘法-判别分析（Partial Least Squares DiscriminantAnalysis,PLS-DA），选取对PLS-DA模型影响值（Variable Influence on Projection,VIP）>1.0且FDR<0.01的代谢物作为差异表达代谢物，这些代谢物既在染毒组和对照组间发生了显著变化，又对PLS-DA模型的贡献较大；
（7）生物学通路识别：通过基因本体数据库（Gene Ontology,GO）和京都基因与基因组百科全书数据库（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG）对差异表达基因进行生物学通路分析，经超几何检验（Hypergeometric Test）p<0.05且包含4个以上差异表达基因的通路被识别为基于转录组受到显著影响的通路；通过代谢组学数据分析软件MetaboAnalyst2.0(http://www.metaboanalyst.ca)对差异表达的代谢物进行生物学通路分析，通路影响值（Pathway Impact,PI）>0.1的通路被识别为基于代谢组受到显著影响的通路；最后筛选出转录组和代谢组均受到影响的生物学通路。这些最终识别的生物学通路就指示了检测水样对生物体毒性作用影响的具体生物学过程，如氧化应激、代谢紊乱、肝毒性等（这些毒性作用可以通过其他生物学方法分别进行验证，但本发明可一次性同时检测水体多种复杂毒性）。相应的差异表达基因和代谢物可作为判断水体毒性的生物标志物。
3.有益效果
本发明基于转录组和代谢组整合的生物组学技术，提供一种基于生物组学整合技术的水体毒性分析方法，从生物底层遗传信息到最终表现型全面准确评价水体复杂毒性，弥补了现有评价方法的不足，同时筛选出识别复杂毒性作用的新型生物标志物，该发明能更简便、有效地将不同组学结果进行整合，大大简化了高通量生物信息学数据的处理。该方法对微污染水体的毒性检测效果明显，甚至对污染物浓度低至纳克级的水体毒性也有效果。而传统毒性检测方法对水体中的污染物浓度响应值较高，通常只对毫克级以上的污染物水平有效果。
附图说明
图1为本发明的流程图。
图2实施例1肝脏组织切片检测结果（A.对照组；B.染毒组）；
图3实施例2肝脏组织切片检测结果（A.对照组；B.染毒组）
具体实施方式
以下通过实例进一步说明本发明：
实施例1：
一种基于生物组学整合技术的水体毒性分析方法，评价微污染饮用水源水毒性，如图1所示，步骤如下：
（1）染毒实验：以饮用水源水样品和纯净水进行小鼠染毒实验（自由饮水），受试动物为雄性昆明种小鼠（Mus musculus），7周龄，17-31g，随机分为染毒组和对照组，每组10只，分别饲喂水源水样品和纯净水，染毒周期为90天。
（2）样品采集：染毒90天后，染毒组和对照组小鼠，提取肝脏总RNA样品，并采集血清样品。
（3）转录组检测：采用小鼠基因组芯片Mouse Genome430A2.0(Affymetrix公司,美国)进行转录组检测，染毒组和对照组每组3张芯片，进行统计分析，得到受试小鼠全基因表达数据。
（4）代谢组检测：染毒组和对照组每只小鼠取300μL血清样品，加入300μL pH7.4的磷酸盐缓冲液混合均匀后取550μL上清液，进行核磁共振检测。将染毒组和对照组的血清核磁共振谱图数据分段积分（以0.005ppm为间隔），然后将积分数据输入多元数据分析软件SIMCA-P11.5，建立PLS-DA模型。
（5）差异表达基因筛选：筛选表达倍数>2.0且FDR<0.1的基因作为差异表达基因，染毒组从上万个全基因组基因中筛选出243个差异表达基因。
（6）差异表达代谢物筛选：筛选对PLS-DA模型影响值VIP>1.0且FDR<0.01的代谢物作为差异表达代谢物，染毒组从上千个血清代谢物中筛选出10个差异表达代谢物。
（7）针对差异表达基因和代谢物，将差异表达基因和代谢物分别进行生物学通路分析，共识别出三条共同影响的生物学通路（如表1所示），包括：细胞色素P450参与的外源物质代谢通路（涉及6个差异表达蛋白和2个差异表达的血清代谢物）、脂肪酸生物合成通路（涉及4个差异表达基因和6个差异表达的血清代谢物）和PPAR信号通路（涉及5个差异表达基因和2个差异表达的血清代谢物）。
受试的微污染饮用水源水的毒性作用主要影响小鼠的外毒物代谢通路和脂肪代谢过程，微污染水源水可导致小鼠肝损伤和代谢紊乱。最终筛选出的差异表达基因和血清代谢物可以作为微污染饮用水源水毒性作用的潜在生物标志物。
检测发现，受试水样中16种代表性污染物中有14种的浓度为纳克级（表2）。在此浓度水平下，传统的毒性检测方法无响应。组织病理学检测结果未发现微污染水源水导致小鼠肝脏组织病变（图2），同时14种血清生化指标检测结果也未发现受试水样引起血清病理指标的变化（表3）。采用本发明一次性同时检测到微污染水源水对小鼠造成肝损伤和代谢紊乱等多种毒性作用，而且灵敏度高，优势明显。
实施例2：
一种基于生物组学整合技术的水体毒性分析方法，评价城市污水处理厂二级出水毒性，步骤如下：
（1）染毒实验：以污水处理厂出水样品和纯净水分别进行小鼠染毒实验（自由饮水），受试小鼠为雄性昆明种（Mus musculus），7周龄，18-25g，随机分为染毒组和对照组，每组10只，分别饲喂水源水样品和纯净水，染毒周期90天。
（2）样品采集：染毒90天后，染毒组和对照组小鼠，提取肝脏总RNA样品，并采集血清样品。
（3）转录组检测：采用小鼠基因组芯片Mouse Genome430A2.0(Affymetrix公司,美国)进行转录组检测，染毒组和对照组每组3张芯片，进行统计分析，得到受试小鼠全基因表达数据。
（4）代谢组检测：染毒组和对照组每只小鼠取300μL血清样品，加入300μL pH7.4的磷酸盐缓冲液混合均匀后取550μL上清液，进行核磁共振检测。将染毒组和对照组的血清核磁共振谱图数据分段积分（以0.005ppm为间隔），然后将积分数据输入多元数据分析软件SIMCA-P11.5，建立PLS-DA模型。
（5）差异表达基因筛选：筛选表达倍数>2.0且FDR<0.1的基因作为差异表达基因，染毒组共筛选出767个差异表达基因。
（6）差异表达代谢物筛选：筛选对PLS-DA模型影响值VIP>1.0且FDR<0.01的代谢物作为差异表达代谢物，染毒组共筛选出5个差异表达代谢物。
（7）将差异表达基因和代谢物分别进行生物学通路分析，共识别出三条共同影响的生物学通路（如表4所示），包括：类固醇激素生物合成通路（涉及7个差异表达基因和2个差异表达的血清代谢物），丙氨酸、天门冬氨酸和谷氨酸代谢通路（涉及4个差异表达基因和1个差异表达的血清代谢物）和氧化磷酸化通路（涉及6个差异表达基因和2个差异表达的血清代谢物）。
受试的污水处理厂二级出水的毒性作用主要影响小鼠的脂肪代谢、氨基酸代谢和能量代谢过程，污水处理厂二级出水可对小鼠脂肪、氨基酸和能量代谢等正常的肝功能造成毒性作用。最终筛选出的差异表达基因和血清代谢物可以作为污水处理厂二级出水毒性作用的潜在生物标志物。
检测发现，受试水样选取的22种代表性污染物中检测出13种痕量有机污染物，其浓度均为纳克级（表5）。在此浓度水平下，传统的毒性检测方法无响应。组织病理学检测结果未发现污水处理厂二级出水导致小鼠肝脏组织病变（图3），同时11种血清生化指标检测结果也未发现受试水样引起血清病理指标的变化（表6）。采用本发明一次性同时检测到污水处理厂二级出水对小鼠造成多种肝功能损伤毒性，而且灵敏度高，优势明显。
综上所述，本发明能够从生物底层遗传信息到最终表现型全面准确评价水体毒性作用，一次性同时检测多种毒性，并提供新型生物标志物。此外，该方法对水体中痕量有毒物质响应灵敏，较传统的毒性学评价方法优势明显。
表1饮用水源水样品毒性作用显著影响的小鼠生物学通路
表2微污染饮用水源水中代表性污染物浓度检测结果
（单位ng/L，平均值±标准差，每个指标测3次）
污染物 浓度 污染物 浓度
异佛尔酮 11±2 苯并(a)蒽 15±2
邻苯二甲酸二甲酯 79±8 邻苯二甲酸二(2-乙基已基)酯 1820±281
屈 31±4 苯并(b)荧蒽 161±17
蒽 96±4 苯并(k)荧蒽 99±12
菲 19±1 苯并(a)芘 195±14
二-正丁基邻苯二甲酸酯 3391±1265 苯并(g,h,i)苝 2±1
芘 14±6 茚并(1,2,3-cd)芘 13±12
双(2-乙基已基)已二酸酯 206±84 二苯并(a,h)蒽 5±2
表3血清生化指标检测结果
（平均值±标准差，每组10只）
表4污水处理厂二级出水样品毒性作用显著影响的小鼠生物学通路
表5微污染饮用水源水中代表性污染物浓度检测结果
（单位ng/L，平均值±标准差，每个指标测3次）
表6血清生化指标检测结果
（平均值±标准差，每组10只）

Claims (4)

1.一种基于生物组学整合技术的水体毒性分析方法，其步骤如下：
(1)染毒实验：选择受试样品，以纯净水作为空白对照，选取模式动物，进行染毒实验；
(2)样品采集：染毒周期结束后，采集提取肝脏总RNA样品；采集离心得到血清样品；
(3)转录组检测：染毒组和对照组每3个RNA样品混合成1个样品，进行转录组基因芯片检测，每组做3张芯片，进行统计分析，得到受试模式动物全基因组表达数据；
(4)代谢组检测：染毒组和对照组每个模式动物的血清样品，进行核磁共振检测，获得血清核磁共振谱图，最终获得血清代谢物的信号值；
(5)差异表达基因筛选：根据基因芯片的检测结果，将染毒组和对照组基因表达信号进行比较，筛选表达倍数>2.0且错误发现率<0.1的基因作为差异表达基因；
(6)差异表达代谢物筛选：将血清核磁共振谱图进行分段积分，得到的积分数据进行偏最小二乘法-判别分析，选取对PLS-DA模型影响值>1.0且FDR<0.01的代谢物作为差异表达代谢物；
(7)生物学通路识别：通过基因本体数据库和京都基因与基因组百科全书数据库对差异表达基因进行生物学通路分析，经超几何检验p<0.05且包含4个以上差异表达基因的通路被识别为基于转录组受到显著影响的通路；通过代谢组学数据分析软件MetaboAnalyst 2.0对差异表达的代谢物进行生物学通路分析，通路影响值>0.1的通路被识别为基于代谢组受到显著影响的通路；最后筛选出转录组和代谢组均受到影响的生物学通路。
2.根据权利要求1所述的一种基于生物组学整合技术的水体毒性分析方法，其特征在于，所述步骤(6)中将血清核磁共振谱图进行分段积分，以0.005ppm为间隔进行分段积分。
3.根据权利要求1所述的一种基于生物组学整合技术的水体毒性分析方法，其特征在于，所述步骤(7)中，所述基于转录组和代谢组的生物学通路分析，具体为筛选超几何检验p<0.05且包含4个以上差异表达基因的通路被识别为基于转录组受到显著影响的通路，通路影响值>0.1的通路被识别为基于代谢组受到显著影响的通路；转录组和代谢组均发生变化的生物学通路作为最终识别的显著变化的生物学通路，指示了检测水体毒性作用影响的具体生物学过程，相应的差异表达基因和代谢物可作为判断水体毒性的生物标志物。
4.根据权利要求1所述的一种基于生物组学整合技术的水体毒性分析方法，其特征在于，所述代谢组检测：将染毒组和对照组血清样品，分别加入pH 7.4的磷酸盐缓冲液混合均匀后取上清液，进行核磁共振检测。
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