CN112986411B - 一种生物代谢物筛查方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供的生物代谢物筛查方法，包括如下步骤：将生物组织或微生物细胞进行液相质谱、气相质谱或质谱的测定结果通过图谱软件鉴定后，列出鉴定结果中的化合物在生物合成中所需蛋白质；然后将其与测定组织或微生物细胞的转录组测序结果蛋白质注释结果相匹配，以除去无匹配数据的蛋白质，剩余蛋白质对应的化合物即为代谢物的筛查结果一；其中，转录组测序的所述测定组织或微生物细胞与所述生物组织或微生物细胞来源于同类生物个体的相同组织或微生物细胞。通过采用质谱和转录组结果相结合的方式，在保证分析效率和质量的情况下极大地避免现有的色谱分离过程中分析人员的主观因素影响，避免人为因素带来的各种弊端。

Description

一种生物代谢物筛查方法
技术领域
本发明涉及代谢物筛查技术领域，具体涉及一种生物代谢物筛查方法。
背景技术
代谢物亦称中间代谢物，是指通过代谢过程产生或消耗的物质。代谢物质中含有多种活性物质。活性物质是指来自生物体内对生命现象具体做法有影响的微量或少量物质。活性物质种类繁多，有糖类、脂类、甾醇类、生物碱、甙类、挥发油等等，其用途非常广泛，主要应用于药品，保健食品，烟草以及化妆品的原料或者辅料。
现阶段，代谢物的筛查主要有两种方法：1、传统的分离化学方法，即通过实验室分离，将生物组织提取的混合物分离成高纯度的单体后，再通过核磁、质谱、红外、元素分析等手段逐一定性；2、色谱联用技术，通过色谱在线分离后进入与联用的分析设备，如质谱、光电阵列和核磁。
但是，上述方法1虽然能够发现新颖的代谢物的分子结构和骨架，但是，实验室的分离过程比较繁重，导致实验周期变得十分漫长；而且新颖的分子结构也许有很好的应用前景和经济价值，但其需要更长的实验周期来进行验证和开发，费时费力。方法2虽然可以方便快捷地在线上分离省去了大量的线下分离工作，加快分析过程的效率；但是，方法2的实施十分依赖于色谱的分离条件和分析人员的知识背景与经验，分析人员的素质和经验不足会对代谢物的筛查结果造成极大的影响。
因此，当没有开发新颖分子骨架需求时，方法2显然对于开发生物体中的有价值的代谢物有着明显的优势，但其缺点如上文所述也是十分明显的，因此克服方法2分离条件及分析人员因素的影响，对筛查生物体中已知的代谢物有着十分重要的意义。
发明内容
因此，本发明要解决的技术问题在于克服现有技术中生物中已知代谢物筛查的方法效率低，依赖分析人员的主观因素的缺陷，从而提供一种生物代谢物筛查方法。
为此，本发明提供如下技术方案：
一种生物代谢物筛查方法，包括如下步骤：
将生物组织或微生物细胞进行液相质谱、气相质谱或质谱的测定结果通过图谱软件鉴定，列出鉴定结果中的化合物在生物合成中所需蛋白质；
然后将其与测定组织或微生物细胞的转录组测序结果蛋白质注释结果相匹配，以除去无匹配数据的蛋白质，剩余蛋白质对应的化合物即为代谢物的筛查结果一；
其中，转录组测序的测定组织或微生物细胞与所述生物组织或微生物细胞来源于同类生物个体的相同组织或微生物细胞。
其中，所需合成蛋白质是根据代谢物名称在分子生物学数据库中查找，如KEGG数据库中，会直接给出生物体合成目标化合物的反应式及参与其反应过程的酶。
进一步地，还包括在将生物组织或微生物细胞进行液相质谱、气相质谱或质谱的测定结果通过图谱软件鉴定后，剔除鉴定结果中无CAS号的化合物，无需求的化合物以及与工业生产源不符的化合物；
其中，无需求的化合物是指市面上无单次千克级或以上交易量的化合物；工业生产源不符的化合物是指检测的生物组织与工业生产原料的生物分界不同的化合物。
更进一步地，在将生物组织或微生物细胞进行液相质谱、气相质谱或质谱的测定结果通过图谱软件鉴定后，依次剔除鉴定结果中无CAS号的化合物，无需求的化合物以及与工业生产源不符的化合物。
还包括列出筛查结果一中化合物在合成时所需的前体，即为筛查结果二。
还包括剔除前体中无CAS号的化合物，无需求的化合物以及与工业生产源不符的化合物。
所述前体通过天然合成通路数据库列出；优选地，所述天然合成通路数据库包括KEGG(京都基因与基因组百科全书)或Biocyc(生理循环代谢通路及基因组数据库)。
所述生物组织或微生物细胞在进入液相质谱、气相质谱或质谱之前，按照液相质谱或质谱的样品预处理流程进行处理。
转录组测序的所述测定组织或微生物细胞与所述生物组织或微生物细胞采集时间相同。
转录组测序的所述测定组织或微生物细胞与所述生物组织或微生物细胞来源于同一生物个体的同一组织或同一微生物细胞，且采集时间相同。
所述代谢物为生物体生理代谢所产生的天然化合物；
所述生物组织是指动物组织或植物组织。优选地，所述生物组织为生物组织的提取液；所述微生物细胞为微生物细胞的提取液。
其中，生物体生理代谢所产生的天然化合物包括但不限于有现有市场价值的天然化合物或有潜在市场价值的生理活性物质，因为代谢物中可能还有未发现作用的天然产物，或者本身没有市场价值，但有生理价值的化合物。
对生物组织进行萃取所得到的溶液是通过相应溶剂(如缓冲溶液、水、乙醇、甲醇、二氯甲烷、乙酸乙酯等)对生物组织进行萃取，将其中所含代谢物从生物体细胞或组织中转移到相应溶剂中。
本发明技术方案，具有如下优点：
1.本发明提供的生物代谢物筛查方法，包括如下步骤：将生物组织或微生物细胞进行液相质谱、气相质谱或质谱的测定结果通过图谱软件鉴定，列出鉴定结果中的化合物在生物合成中所需蛋白质；然后将其与测定组织或微生物细胞的转录组测序结果蛋白质注释结果相匹配，以除去无匹配数据的蛋白质，剩余蛋白质对应的化合物即为代谢物的筛查结果一；其中，转录组测序的所述测定组织或微生物细胞与所述生物组织或微生物细胞来源于同类生物个体的相同组织或微生物细胞。本发明提供的生物代谢物筛查方法，采用气相质谱、液相质谱或质谱与图谱软件相结合初步鉴定生物组织或微生物细胞中的化合物，且对质谱的分离要求低，不依赖于分析人员的主观因素；然后利用同类生物个体的相同组织的转录组的信息来确认质谱与数据库的结果数据中的正确鉴定结果；通过采用质谱和转录组结果相结合的方式，在保证分析效率和质量的情况下极大地避免现有的色谱分离过程中分析人员的主观因素影响，避免人为因素带来的各种弊端，如经验差异、知识背景差异、人员主观因素、人力成本、时间成本。
2.本发明提供的生物代谢物筛查方法，还包括将生物组织进行液相质谱、气相质谱或质谱的测定结果通过图谱软件鉴定后后，剔除鉴定结果中无CAS号的化合物，无需求的化合物以及与工业生产源不符的化合物；其中，无需求的化合物是指市面上无单次千克级或以上交易量的化合物；工业生产源不符的化合物是指检测的生物组织与工业生产原料的生物分界不同的化合物；通过CAS号、需求数据和工业生产原料这三个指标来准确地定义并提取精炼被检测样品质谱数据中的贵价化合物，并利用同类生物个体的相同组织的转录组的信息来确认质谱数据中的正确鉴定结果；因此，本发明提供的生物代谢物筛查方法，通过采用质谱和转录组结果相结合的方式，并结合剔除无CAS号的化合物，无需求的化合物以及与工业生产源不符的化合物，全部流程通过简单的数据匹配的方式快速筛查生物组织中的贵价化合物，在保证分析效率和质量的情况下极大地避免现有的色谱分离过程中分析人员的主观因素影响，避免人为因素带来的各种弊端，如经验差异、知识背景差异、人员主观因素、人力成本、时间成本。
3.本发明提供的生物代谢物筛查方法，通过天然合成通路数据库对筛查结果一中的化合物的合成前体中的代谢物以及贵价化合物进行推测，一定程度上避免生物样品的代谢以及生长周期带来的结果差异，同时可通过一个样品推测出除测定样品生长周期之外的潜在的代谢物以及贵价化合物。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是本发明实施例1中生物代谢物筛查方法的流程图。
图2是本发明实施例2和3中生物代谢物筛查方法的流程图。
具体实施方式
提供下述实施例是为了更好地进一步理解本发明，并不局限于所述最佳实施方式，不对本发明的内容和保护范围构成限制，任何人在本发明的启示下或是将本发明与其他现有技术的特征进行组合而得出的任何与本发明相同或相近似的产品，均落在本发明的保护范围之内。
实施例中未注明具体实验步骤或条件者，按照本领域内的文献所描述的常规实验步骤的操作或条件即可进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规试剂产品。
实施例1
普通分析人员用体积分数为70％乙醇提取干燥甘草根茎，将提取液进行离心处理后进入液相质谱进行检测，根据离子质荷比通过配套软件SIEVE及质谱数据库Metlin自动初步鉴定化合物；然后从该结果中依次剔除无CAS号的化合物；市面上无单次千克级或以上交易量的化合物；工业生产原料与甘草的生物分界不同的化合物；然后匹配分子生物学数据库KEGG列出该结果中的化合物在生物合成中所需的蛋白质，将该蛋白质结果与同批次新鲜甘草的根茎的转录组测序结果的蛋白质注释结果相匹配，除去无匹配数据的蛋白质；筛选出的化合物为贵价化合物筛查结果一，具体结果见表1；
然后通过分子生物学数据库KEGG列出筛查结果一中化合物的所需合成前体，从这些前体化合物中依次剔除其中无CAS号的化合物，无需求的化合物以及与工业生产源不符的化合物，最后得出的化合物为贵价化合物筛查结果二，具体结果见表2。
表1甘草代谢物筛查结果一
化合物名称 CAS No.
槲皮素 117-39-5
生松素 480-39-7
甘草素 578-86-9
异甘草素 961-29-5
山奈酚 520-18-3
表2甘草代谢物筛查结果二
Figure BDA0002321976710000061
Figure BDA0002321976710000071
实施例2
普通的分析人员，将高山被孢霉的干菌体用体积分数为80％乙醇提取得提取液，过滤后按顶空气相质谱预处理及检测方法进行检测，根据离子质荷比和NIST数据库初步鉴定化合物；
将高山被孢霉的干菌体用5％盐酸甲醇溶液，3ml氯仿甲醇溶液(两者体积比为1:1)处理后加入正己烷萃取，取正己烷部分定容过滤后用顶空气相质谱进行检测,根据离子质荷比和NIST数据库初步鉴定化合物。
合并上述两次的鉴定结果，然后匹配分子生物学数据库KEGG列出剩余化合物在生物合成中所需的蛋白质，将该蛋白质与同批次高山被孢霉的新鲜样品的转录组测序结果蛋白质注释结果相匹配，除去无匹配数据的蛋白质；筛选出的化合物为代谢物筛查结果一，具体结果见表3；
然后通过天然合成通路数据库KEGG列出筛查结果一中化合物的所需合成前体，得出的化合物为代谢物筛查结果二，具体结果见表4。
表3高山被孢霉的贵价化合物筛查结果一
Figure BDA0002321976710000072
Figure BDA0002321976710000081
表4高山被孢霉的贵价化合物筛查结果二
化合物 CAS No.
Farnesyl diphosphate 372-97-4
丙二酰辅酶A 524-14-1
乙酰辅酶A 72-89-9
棕榈酰辅酶A 1763-10-6
丙酮酸 127-17-3
磷烯醇丙酮酸 138-08-9
丙二酸 141-82-2
卵磷脂 8002-43-5
顺-8,11,14-二十碳三烯酸 1783-84-2
20-羟基二十碳-5Z,8Z,11Z,14Z-四烯酸 79551-86-3
实施例3
普通的分析人员，将干燥粉碎后的九香虫用体积分数为95％乙醇进行提取过滤后进入液相质谱进行检测，根据离子质荷比通过配套软件SIEVE及质谱数据库Metlin自动初步鉴定化合物；然后匹配分子生物学数据库KEGG列出剩余化合物在生物合成中所需的蛋白质，将该蛋白质与九香虫的转录组测序结果蛋白质注释结果相匹配，除去无匹配数据的蛋白质；筛选出的化合物为代谢物筛查结果一，具体结果见表5；
然后通过天然合成通路数据库KEGG列出筛查结果一中化合物的所需合成前体，得出的化合物为代谢物筛查结果二，具体结果见表6。
表5九香虫的代谢物筛查结果一
Figure BDA0002321976710000091
Figure BDA0002321976710000101
表6九香虫的代谢筛查结果二
Figure BDA0002321976710000102
Figure BDA0002321976710000111
Figure BDA0002321976710000121
Figure BDA0002321976710000131
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引申出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。

Claims (9)

1.一种生物代谢物筛查方法，其特征在于，包括如下步骤：
将生物组织或微生物细胞进行液相质谱、气相质谱或质谱的测定结果通过图谱软件鉴定，得到鉴定结果，剔除鉴定结果中无CAS号的化合物，无需求的化合物以及与工业生产源不符的化合物；其中，无需求的化合物是指市面上无单次千克级或千克级以上交易量的化合物；工业生产源不符的化合物是指检测的生物组织与工业生产原料的生物分界不同的化合物，列出鉴定结果中的化合物在生物合成中所需蛋白质；
然后所述所需蛋白质与测定组织或微生物细胞的转录组测序结果蛋白质注释结果相匹配，以除去无匹配数据的蛋白质，剩余蛋白质对应的化合物即为代谢物的筛查结果一；
其中，转录组测序的所述测定组织或微生物细胞与所述生物组织或微生物细胞来源于同类生物个体的相同组织或微生物细胞。
2.根据权利要求1所述生物代谢物筛查方法，其特征在于，将生物组织或微生物细胞进行液相质谱、气相质谱或质谱的测定结果通过图谱软件鉴定后，依次剔除鉴定结果中无CAS号的化合物，无需求的化合物以及与工业生产源不符的化合物。
3.根据权利要求1-2任一项所述生物代谢物筛查方法，其特征在于，还包括列出筛查结果一中化合物在合成时所需的前体，即为筛查结果二。
4.根据权利要求3所述生物代谢物筛查方法，其特征在于，还包括剔除前体中无CAS号的化合物，无需求的化合物以及与工业生产源不符的化合物。
5.根据权利要求4所述生物代谢物筛查方法，其特征在于，所述前体通过天然合成通路数据库列出。
6.根据权利要求5所述生物代谢物筛查方法，其特征在于，所述天然合成通路数据库包括KEGG或Biocyc。
7.根据权利要求1-2或4-6任一项所述生物代谢物筛查方法，其特征在于，转录组测序的所述测定组织或微生物细胞与所述生物组织或微生物细胞采集时间相同。
8.根据权利要求7所述生物代谢物筛查方法，其特征在于，转录组测序的测定组织或微生物细胞与所述生物组织或微生物细胞来源于同一生物个体的同一组织或同一微生物细胞，且采集时间相同。
9.根据权利要求1-2、4-6或8任一项所述生物代谢物筛查方法，其特征在于，所述代谢物为生物体生理代谢所产生的天然化合物；
所述生物组织是指动物组织或植物组织。
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